帝京科学大学紀要 Vol. 1 (2005) pp. 105-106
事業報告
日本私立学校振興・共済事業団私立大学等経常費補助金特別補助（高度化の推進）
大学院重点特別経費−研究科共同研究経費
平成 10〜11 年度
「 遺伝子機能解明のための分子プローブの創製」
研究代表者： 実 吉 峯 郎 （理工学研究科 バイオサイエンス専攻）
研究分担者： 山 口 十四文 （理工学研究科 バイオサイエンス専攻）
平 井 俊 朗 （理工学部 バイオサイエンス学科）
川 口 健 夫 （城西大学大学院 薬学研究科）
本研究は、遺伝子の機能を解析するための分子プローブを創製することを目的として行われ、大き くわけて二つの成果が得られた。
遺伝子の複製に重要な役割を果たしている
DNAポリメラーゼαファミリーには、α—プライマー ゼ、δ、およびε分子種があり、阻害剤アフィディコリンで
3分子種ともに強く抑えられる。これで、
α—ファミリー以外の、βおよびγおよび、テロメラーゼとは識別できるが、ファミリー内の区別が できない。そこで、２—（
p-n-ブチルアニリノ）-９-β-D-アラビノフラノシルアデニン
5’-トリりん酸を分子設計し、吟味したところ、αのみを強く阻害し、δ、εを全く阻害しないことが明らかとな った。
A.Tomikawa, M.Seno, K.Sato-Kiyotaki, C.Ohtsuki, T.Hirai, T.Yamaguchi, T.Kawaguchi, S.Yoshida and M. Saneyoshi:
Synthetic Nucleosides & Nucleotides. 40 : Selective inhibition of eukaryotic DNA polymerase α by 9-(β-D-arabinofuranosyl)-2-(p-n-butylanilino)adenine and its 2’-up azido analogue; Synthesis and enzymatic evaluations. Nucleosides & Nucleotides, 17, 487-501 (1998)
Abstract:
Starting from 2’,3’,5’-tri-O-acetyl-2-iodoadenosine, 9-(β-D-arabinofuranosyl)-2-(p-n-butylanilino)adenine (9b) and its 2’(S)-azido counterparts (9c) were synthesized in seven steps. These exhibited only moderate growth-inhibitory effects against mouse leukemic P-388 cells (IC50= 13-24 μM), although 5’-triphosphate derivatives showed strong and selective inhibitory action on calf thymus DNA polymerase α, but not β- and ε-polymerases from eukaryotes. From enzyme-kinetic analyses, compound 9b-c have shown that their mechanism of inhibitory action are competitive to natural substrate dATP.
に公表してあるので詳細はそちらを参照して欲しい。
今ひとつは、光親和性標識プローブの創製であり、それをオリゴマーレベルで実行した。その結果、
トリフルオロメチルフェニルジアジリジン基を有する
TMPアナログを含むオリゴマーを設計し、合成 し、ポリメラーゼレベル(HIV-reversetranscriptase& Rat DNA polymerase β)で検定したところ、プ
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ライマー結合蛋白質のドメインに選択的に結合することが明らかとなった。これらについては、以下 の雑誌に公表してある。
1. T. Yamaguchi, K. Suyama, K. Narita, S. Kougo, A. Tomikawa and M. Saneyoshi:
Synthesis and evaluation of oligodeoxyribonucleotides containing aryl(trifluoromethyl)diazirine moiety as the closs-linking prove: photoaffinity labeling of mammalian DNA polymerase β (Synthetic Nucleosides &
Nucleotides.XXXIX). Nucleic Acids Res., 25, 2352-2358 (1997) Abstract:
Photolabile 2’-deoxy-E-5-[4-(trifluoromethyl-3-H-diazirin-3-yl)styryl]-uridine and its protected phophoroamidite derivatives have been synthesized and introduced into DNA oligomers through solid-phase DNA synthesis.
The (trifluoromethyldiazirinyl)styryluridine moiety of this nucleoside was found to be sufficiently stable for automated DNA synthesis. In addition, this moiety was found to be stable at 60oC in aqueous solution under the annealing conditions for duplex formation with complementary strands, since >95% of the photolabile nucleoside remained after heating for 1 h. The oligo(dT) 15meranalog bearing the photolabile residue was activated/decomposed by near-UV irradiation. In photoaffinity cross-linking experiments with recombinant rat DNA polymerase β, constituted from a 40kDa polypeptide, using oligo(dT) 15mer analogs bearing the photolabile residue near the 3’-terminus, a covalently bound complex of 45 kDa was obtained in the presence of complementary templates. Thus it was demonstrated that our method for synthesis of photolabile oligodeoxyribonucleotides may be useful for studies of DNA-related enzymes and DNA binding proteins.
2. T. Yamaguchi, F.Shimizu, T.Hirai, M. Yoshikuni, Y. Nagahama and M. Saneyoshi:
Photo-affinity labeling of the primer binding domein in HIV-reverse transcriptase with an oligodeoxyribonukureotide containing phenyldiazirie derivative.
Nucleic Acids Symposium Series, 39, 47-48 (1998) Abstract:
To confirm the labeling ability of oligodeoxyribonucleotides (ODNs) containing a photoreactive 2’-deoxy-5-[4-(3-trifluoromethyldiazirin-3-yl)]styryluridylate residue, an oligo(dT)15 analog (dT14D) bearing a photo-reactive residue at the 3’-terminus was used for the affinity labeling of HIV-1 reverse transcriptase (RT) in the presence of poly(A).
The nascent 66kDa subunit and modified 76kDa polypeptide were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). From the comparison of these peptide maps. The tripic peptide 224-238 appeared to have been modified by photoreactive ODN. This result was consistent with the information from X-ray crystallography of the enzyme which indicates that peptide 227-235 is close to the polymerase active site.
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