大阪医科大学プレゼン最終盤＿配布

ヒトマイクロバイオームの

解析手法論

須田 亙

理化学研究所

生命医科学研究センター

マイクロバイオーム研究チーム

副チームリーダー

2018年7月3日

大阪医科大学 研究ブランディング事業「健康寿命をのばす たかつきモデル」学内シンポジウム

10

3

_-10

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_>150

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9

Human microbiome

ヒト常在細菌叢

次世代シークエンサーとは・・・

$1,000 Human Genome Projectをモチベーションとして開発された技術を使用した

超並列処理型DNAシークエンサー

2005年に454 GS20が市場に投入され、現在進行形でバージョンアップや新機種

が開発されている。

16SデータのOTU（Operational Taxonomic Unit）解析

Database類似度検索によるOTU菌種帰属の例:

ヒト腸内細菌叢 3000readを用いた場合

0%

20 %

40 %

60 %

80 %

10 0%

0%# 10%# 20%# 30%# 40%# 50%# 60%# 70%# 80%# 90%# 100%#

1# 5# 9# 13# 17# 21# 25# 29# 33# 37# 41# 45# 49# 53# 57# 61# 65# 69# 73# 77# 81# 85# 89# 93# 97#101#105#109#113#117#121#125#129#133#137#141#145#149#153#157#161#165#169#173#177#181#185#189#193#197#201#205#209#213#217#221#225#229#233#237#241#245#249#253#257#UNDEFINED# Others# Lysobacter# Tetrasphaera# Nesterenkonia# Megasphaera# BlauIa# Acidovorax# Nocardioides# Facklamia# AggregaIbacter# Ideonella# Selenomonas# Dialister# AllochromaIum# Parvimonas# OQowia# Oribacterium# Dermabacter# Cardiobacterium# Bradyrhizobium# Stenotrophomonas# Turicella# Caulobacter# Collinsella# Brevibacterium# Paraprevotella# Massilia# Brachybacterium# Williamsia# Pseudoclavibacter# Brochothrix# Thauera# Faecalibacterium# Lactococcus# Enterococcus# Ruminococcus# Flavobacterium# Aquabacterium# Paracoccus# Aerococcus# Campylobacter# Abiotrophia# Rhodobacter# MethyloversaIlis# TM7# Hydrogenophaga# Gordonia# Thermus# Janthinobacterium# Bifidobacterium# Eubacterium# Haemophilus# Klebsiella# Burkholderia# Cupriavidus# Bacillus# Capnocytophaga# Sphingomonas# Dermacoccus# Lautropia# Peptoniphilus# Bacteroides# Kocuria# Xanthomonas# Atopobium# Gemella# Porphyromonas# Fusobacterium# Mycobacterium# Enhydrobacter# Brevundimonas# Gardnerella# Paenibacillus# Microbacterium# Rhodococcus# Methylobacterium# Arthrobacter# Janibacter# Roseateles# Veillonella# Chryseobacterium# Clostridium# Deinococcus# Granulicatella# Del_ia# Finegoldia# Micrococcus# Pseudomonas# Lactobacillus# Rothia# Leptotrichia# AcInomyces# Anaerococcus# Moraxella# Neisseria# Prevotella# Acinetobacter# Streptococcus# Corynebacterium# Staphylococcus# Propionibacterium#

Phylum

Genus

Lozupone C & Knight R. Appl Environ Microbiol. (2005)

各サンプル（

■

,

■

,

■

）で形成されたOTU（菌種）の代表配列でTreeを描く。

■

と

■

の間の距離の計算は以下

Unifrac distance = (２サンプルで固有の枝長[赤+黄色]) / (共通な枝を含む枝長の和[赤+黄+オレンジ])

http://bmf2.colorado.edu/fastunifrac/help.psp

UniFrac 解析

•

唾液細菌叢は腸疾患である炎症性腸疾患(IBD)と関連する

•

IBD患者と健常者の唾液細菌叢が有意に異なる

解析例

炎症性腸疾患と唾液細菌叢の関連

Said HS, Suda W, Nakagome S, Chinen H, Oshima K,

Kim S, Kimura R, Iraha A, Ishida H, Fujita J, Mano S,

Morita H, Dohi T, Oota H, Hattori M.

•

PSC=原発性硬化性胆管炎

•

UCとPSCを見分けられる（腸内細菌叢より有効）

解析例

PSC患者の唾液細菌叢変化

(A)

(B)

1 - Specificity Sensitivity 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Genus Species 1 - Specificity Sensitivity 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Genus Species AUC 0.8056 AUC 0.9497 AUC 0.8906 AUC 0.9323

PSC versus HC

PSC versus UC

Iwasawa K, Suda W, Tsunoda T, Oikawa-Kawamoto M,

Umetsu S, Takayasu L, Inui A, Fujisawa T, Morita H, Sogo T,

Hattori M.

Sci Rep. 2018 8:5480.

Genus AUC 0.8056

解析例

ヒト唾液細菌叢の時系列変動

Firmicutes

Bacteroidetes

0

12

24

36

Auto-correlation coefficent

1.0

0.5

0.0

-0.5

-1.0

0

12

24

36

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

Subject 1

Subject 2

Subject 3

Subject 4

Subject 5

Subject 6

Time lag (hr)

Subject 1

0

20

40

60

80

100

12:00

Relative

Abundance

(%)

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 2

0

20

40

60

80

100

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 3

0

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60

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100

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12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

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Subject 4

0

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16:00

20:00

0:00

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12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 5

0

20

40

60

80

100

12:00

16:00

20:00

0:00

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16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 6

0

20

40

60

80

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12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Firmicutes

Bacteroidetes

Proteobacteria

Actinobacteria

Fusobacteria

TM7

Spirochaetes

SR1

Tenericutes

Synergistetes

Others

Subject 1

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 2

0

20

40

60

80

100

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 3

0

20

40

60

80

100

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

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0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 4

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

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12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 5

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Subject 6

0

20

40

60

80

100

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

12:00

16:00

20:00

0:00

4:00

8:00

Streptococcus

Haemophilus

Gemella

Aggregatibacter

Eubacterium

Peptostreptococcus

Megasphaera

Abiotrophia

Bergeyella

Tannerella

Prevotella

Veillonella

Fusobacterium

Alloprevotella

Solobacterium

Oribacterium

Paraprevotella

Selenomonas

Lachnoanaerobaculum

Mycoplasma

Neisseria

Actinomyces

Porphyromonas

Leptotrichia

Campylobacter

Lautropia

Atopobium

Catonella

Dialister

Peptococcus

Rothia

Granulicatella

Corynebacterium

Capnocytophaga

Parvimonas

Treponema

Filifactor

Kingella

Cardiobacterium

Synergistes

Others

0

20

40

60

80

100

a

b

Relative

Abundance

(%)

Relative

Abundance

(%)

Relative

Abundance

(%)

0.1

0.2

0.3

0.4

W

eighted UniFrac distance

_ST

_DT

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Subject 1

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Subject 2

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Subject 3

ST

DT

ST

DT

*

*

a

b

唾液細菌叢は概日周期を持って変動している

0

2 00

4 00

6 00

8 00

1 00 0

1 20 0

1 40 0

Read #

Errors/read

0

1

2

3

4

5

6 7

8

9 10 11 12 13 14 15

0

20 0

40 0

60 0

80 0

10 00

12 00

14 00

16 00

18 00

Mock 3

Read #

Errors/read

0 1 2

3

4 5

6 7

8 9 10 11 12 13 14 15

NGSによる16Sアンプリコンシークエンスのエラー率

N=3,000

reads

N=3,000

reads

Mock2

Mock1

エラー率は

0.5%程度

Roche 454

Mock:

~10

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

O

T

U

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

G

ood

's

co

ve

ra

ge

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0

1000

2000

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4000

5000

6000

7000

8000

9000

ch

ao

1

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

Sh

anno

n

A

B

C

D

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

O

T

U

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

G

ood

's

co

ve

ra

ge

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

ch

ao

1

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

Sh

anno

n

A

B

C

D

OTU

Good’s coverage

16S シークエンスエラーによる菌種(OTU)数のOverestimation

Good’s coverage index:

1 - (F1 / N)

F1 : the number of singleton OTUs

N : sum of abundances for all OTUs

…ACGCGCAT…

…CGATTCAG…

…GATGCAGC…

…CCGTAACG…

…AATAGCAT…

…CGCGCTAG…

糞便検体

菌体の回収

ゲノム

DNA

の調整

メタゲノムデータ

Wet

Microbial profile

Species A Species B Species C

Assembly

・gene information

Functional profile

Gene A

Gene B

Gene C

情報解析工程

NGS

Functional gene DB KEGG/COG

Ref genome DB (6,200 genomes; 2,373 clusters )

Whole genome

shotgun sequencing

DNA

0%

10 %

20 %

30 %

40 %

50 %

60 %

70 %

80 %

90 %

10 0%

O the r gene ra

@Er ysip elo tr i chaceae_ge nus

Pr evot el la

Do re a

Col li nsel la

Par abact er oi des

Cl ost ri di um

Faecal ib acte ri um

Eub acte ri um

Bl aut ia

Rum i nococcu s

Bi fi dob acte ri um

Bact er oi des

0%

10 %

20 %

30 %

40 %

50 %

60 %

70 %

80 %

90 %

10 0%

Cel l m ot il it y

Secondar y m etabo lit es b iosynt hesis, tr anspor t and cat abol ism

Cel l cycl e cont ro l, cell di visio n, ch rom osome par ti t ioni ng

I ntr acell ular t r aff i cki ng, secret ion, and vesicul ar tr anspor t

Lipi d t r ansport and m et aboli sm

Funct ion unknown

Nucl eoti de t r anspor t and m et aboli sm

Post tr anslat io nal m odi fi cati on, pr otei n t ur nover , chaperon es

Coenzym e t ran spor t and m etabol ism

Signal t r ansducti on m echanism s

Ener gy pr oduct ion and conver sion

Def ense m echanism s

Cel l w all /mem br ane/envelope biogenesi s

Tr anslat ion, r ib osom al str uct ur e and biogenesi s

I norgani c i on t r ansp ort an d m etabol ism

Tr anscri pti on

Am ino acid tr anspor t and met aboli sm

Repl icat ion, r ecom binat ion and r epai r

Gener al f uncti on pr edi cti on onl y

Car bohydr ate t ranspor t and met abol ism

20

種数

遺伝子機能数

（

KE

G

G

）

0.9

0.92

0.94

0.96

0.98

1

100 1,00010,00

0

_100,

000

1,0

00,

000

10,

000,

000

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

100 1,000 10,00

0

_100,

000

1,0

00,

000

10,

000,

000

相関係数

（

KE

G

G

）

相関係数

（

種組成

）

0

200

400

600

800

1,000

1,200

100 1,00010,00

0

_100,

000

1,0

00,

000

10,

000,

000

0

500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

4,500

5,000

100

10,

000

_1,0

00,

000

0.99

0.999

0.999

0.99

a

b

c

d

メタゲノムデータ量と菌種/機能組成との関連

/

10M

(person)

0

20

40

60

80

100

16S

2007

International Human Microbiome

Consortium (IHMC)

hit

16S

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

apr 01. 1 apr 02. 1 apr 03. 1 apr 09. 1 apr 12. 1 apr 16. 1 apr 17. 1 apr 39. 1 apr 40. 1

Bacteria

Unknown Virus Fungi

Human

9

Wet

•

_DNA

Kit)

•

(-80℃)

*

*

RNAlater

etc,,,

IHMC

Protocols

(ビーズ法)

熱処理

(Qiagen kit)

酵素法

Beads破砕

●

酵素反応

●

SDS

●

●

●

フェノクロ処

理

●

カラム精製

●

●

PEG処理

●

Gram − :

Gram + :

再現性

16Sリージョン

(V12 vs V34)

16Sリージョン

(V12 vs V68)

16Sリージョン

(V34 vs V68)

シークエンサー

(454 vs MiSeq)

(酵素法 vs

抽出法

Beeds法)

個人内

個人間

(日本人健常者)

(UC患者)

個人間

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

個人間

(日本人健常者

vs UC患者)

16S

V12 vs V34

V12 vs V68

16S

V34 vs V68 454 vs MiSeq

16S

•

•

•

•

10 M

Year

Subject#

Country

NGS

Reference

2010

124

Denmark, Spain

Illumina

Qin J. et al., Nature

2012

345

China

Illumina

Qin J. et al., Nature

2013

96

Russia

SOLiD

Tyakht AV. et al., Nature Com.

145

Sweden

Illumina

Karlsson FH. et al., Nature

2014

237

China

Illumina

Qin N. et al., Nature

196

France, Germany

Illumina

Zeller G. et al., Mol. Sys. Biol.

2015

156

Austria

Illumina

Feng Q. et al, Nature Com.

212

China

Illumina

Zhang X. et al., Nature Med.

900

Israel

Illumina

Zeevi D. et al., Cell

2016

106

Japan

454, IonPGM, Illumina

Nishijima S. et al., DNA Res.

1,179

Netherlands

Illumina

Zhernakova A. et al., Science

Short-read NGS data with ≤150 bp

read-length

PacBio RS II (SMRT sequencing) →

~10 kb.

2

To

ta

l b

as

es

/r

un

100Mb

1Gb

10Gb

100Gb

1Tb

100bp

1,000bp

10,000bp

0bp

_Read-length

HiSeq

IonPGM

PacBio

IonProton

454

NGS

MiSeq

~3kb

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