博 士 （ 医 学 ） 村 川 力 彦
学 位 論 文 題 名
cDNA ア レイ デー タか ら特徴選択された 遺伝子による胆道癌神経周囲浸潤の予測
学位論文内容の要旨
背景 と目 的
胆 道 癌 は 早 期 発 見 が 難 し く 予 後 不 良 な 癌 の ー つ で あ る が ， 根 治 の 可 能 性 が あ れ ば ， 積 極 的 に 手 術 す る な ど の 治 療 戦 略 が 構 築 さ れ る べ き で あ る ． そ の 手 術 適 応 は 確 実 な 予 後 予 測 の も と に 決 定 さ れ る べ き で あ り ， 予 測 に 役 立 つ 分 子 生 物学 的 研究 が進 めら れつ っあ る。 今日 ， cDNAア レ イ を 用 い た 癌 の 遺 伝 子 発 現 プ 口 フ ァ イ ル の 解 析 が 可 能 と な り ， 乳 癌J肺 癌 ， 脳 腫 瘍 な ど で 患 者 の 予 後 予 測 に 有 用 で あ っ た と 報 告 さ れ て い る ． 今 回 ， 我 々 は1，289の 癌 関 連 遺 伝 子 を 搭 載 し たcDNAア レ イ を 行 い ， 胆 道 癌 の 遺 伝 子 発 現 を 解 析 し ， さ ら にfeature subset selection algorithmに 基 づい た教 師付 き分 類を 行い ，遺 伝子 発現 パタ ーン によ る 予後 予測 の可 能性 にっ き検 討し た．
方 法
2001年6月 か ら2003年1月 の 間 に 北 海 道 大 学 腫 瘍 外 科 と そ の 関 連19施 設 に お い て イ ン フ オ ー ム ド コ ン セ ン 卜 の 得 ら れ た37例 の 切 除 検 体 か ら5 nim角 の 腫 瘍 組 織 を 摘 出 し ， 急 速 冷 凍 し た ． 癌 組 織 の 存 在 を 確 認 し た サ ン プ ル か らTotal RNA， さ ら にmRNAを 抽 出 ， 逆 転 写 反 応 を 行 い ， さ ら に 増 幅 ，biotinで 標 識 し1，289種 類 の 癌 関 連 遺 伝 子 と11個 の house‑keeping geneを搭 載し たcDNAア レイ フィ ルタ ー(GeneticLab，Sapporo，Japan)上で ノヽ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 行 っ た ． 遺 伝 子 発 現 プ 口 フ ァ イ ル と そ れ に 関 連 し た 統 計 解 析 は プ 口 グ ラ ミ ン グ 言 語 のMATLAB (MathWorks，Tokyo，Japan)で 作 製 し た プ 口 グ ラム 群を 用い た．
今 回 の 検 討 で の ア レ イ デ ー タ の 標 準 化 は 各 症 例 の 全 遺 伝 子 発 現 値 の 中 間 値 の0.1倍 か ら 1.2倍 の 値 を と る 遺 伝 子 発 現 値 の 平 均 値 で 全 遺 伝 子 発 現 値 を 除 算 し て 標 準 化 を 行 っ た ， ま ず 分 類 し た そ れ ぞ れ の カ テ ゴ リ ー で 発 現 に 統 計 学 的 有 意 差 を 認 め る 遺 伝 子 を 選 択 の う え ， 50以 上 の 遺 伝 子 に 発 現 差 を 認 め る 因 子 に 対 し て 特 徴 選 択 を 行 いJ診 断 に 用 い る 遺 伝 子 セ ッ ト を 抽 出 し た ． 特 徴 選 択 に は 前 方 逐 次 探 索 法 を採 用し ，誤 識別 率の 算出 にはleave‑one‑out error交 差 検 定 法 を 用 い ， ま た 識 別 器 と し てk最 近 隣 法 を 用 い た ，
結 果
臨 床 病 理 学 的 因 子 で 判 別 さ れ る 集 団 間 で の 遺 伝 子 発 現 差 を 認 め る 遺 伝 子 数 はStage分 類
ではstageI (1I例）とstage II‑IV (22例）で37遺伝子，pT因子ではpTl‑2 (19)とpT3‑4 (16)で 42遺 伝 子 ，pN因 子（ 陽 性18， 陰性19)で は51遺伝 子 ， 静脈 侵 襲(11，20)では21遺伝 子，
リ ンパ 管 侵 襲(17，15)で は14遺 伝 子 ，神 経 周囲 浸 潤(13，18)では100遺 伝子 がそ れぞれ 有意に発現差を認めた．
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教 師 な し学 習 法EM‑algorithrnにて37例中32例(86％）が正 しく分類 された． 続いて，
有意差 を認めた51遺伝子を 用い，前 方逐次探 索法を用いたleave one out error交差検定で 37例 を 分 類し う る 最適 遺 伝子 セ ッ トを 抽 出し ，k最 近 隣法 に より 診 断 する と24から28遺 伝 子を 選 択 する こ とによっ て，リン バ節転移 の有無を 誤診率5.4％ で診断し 得た，胆管 癌 (15例）， 胆嚢癌(11例 ），乳頭 部癌(11例） に分けて検討するとりンバ節転移の有無に関し て 有意 差 を 認め 選 択さ れ た 遺伝 子 は それ ぞ れ，88，75174遺伝 子 であ り ， この うち，は じ め の51遺 伝 子 と 共 通 し た遺 伝 子 はそ れ ぞ れ19，5，11遺 伝子 で あっ た ．3つ の癌 す べ てに共通する遺伝子は存在しなかった．
袖経圃囲浸潤Q王瀏 ．
EMalgorithmに よ る教 師 なし 分 類 では ，31例 中27例が 正しく分 類された(87％），有 意 差 を認 め た100遺 伝 子か ら 前 方逐 次 探 索法 に より46から60遺伝 子 を選 択 す るこ とによっ て100％神 経周囲浸 潤を診断 すること が可能で あった． Stage IB以上の症例（陽性13例I 陰 性12例 ）で は147遺 伝子に有意 な発現差 を認めた ．このう ち，74遺伝 子が，先 に選択さ れ た100遺 伝 子と 共 通で あ っ た． こ の147遺 伝子と74遺伝子か ら神経周 囲浸潤の 有無を 判 別す る 最 適遺 伝 子セ ッ ト を選 択 す ると ， それ ぞ れ3〜118遺 伝 子，3〜21遺伝 子が選択 さ れ， こ れ らに よ り神経周 囲浸潤は100％の正診 率で予測 すること が可能で あった．胆 管 癌 （陽 性7例I陰 性7例） の み では ，204遺伝 子 におい て発現に 有意差が 認められ ，はじめ の100遺 伝 子 と 共 通 す るも の は42遺 伝子 で あ った ． この204遺 伝子 と42遺 伝 子か ら 神 経 周 囲浸 潤 を 予測 す る遺伝子 を選別す るとそれ ぞれ4〜152，2〜35遺伝子 が選択さ れ，とも に100％の正診率で予測可能であった，
考察 とまとめ
今回 申 請者 は ，cDNAアレ イ によ る データ の中にあ る全く関 係のない遺 伝子の存 在，あ るい はノイズ の存在など による解 析精度の 低下を避 ける目的 で前方逐次探索法を用いた．
これ により診 断に必要な 遺伝子セ ットのみ を抽出し ，診断率 を向上させることができた．
こ う して 選択した 遺伝子群 を用いてk最近隣法 を行い， 各症例の識 別を行っ た．胆道 癌の 神 経 周囲 浸潤の有 無で100遺伝 子以上に 発現差が 認められ ，これらの 遺伝子が 胆道癌の 浸 潤度 を増す遺 伝子ネット ワークの 一員と推 測された ，また， 神経周囲浸潤で発現差を認め たこ れらの遺 伝子から特 徴選択を 行い，遺 伝子を選 択するこ とによって100u/oの診断率で 神経 周囲浸潤 を予測する ことが可 能となっ た．その 臨床的意 義を考えると神経周囲浸潤が 胆道 癌にとっ て有意な予 後不良因 子である こと，ま た，手術 時切除断端における癌組織の 有無 が神経周 囲浸潤の有 無に大き く影響さ れること から癌組 織中の遺伝子異常により，こ れ ら を予 知 する 価 値 は大 き い， 一 方 ，リンバ 節転移の 有無で51遺伝 子に発現 差を認め た
が，神経周囲浸潤に比較し，遺伝子ネットワークの変化が小さいかあるいは他の交絡因子
による見かけ上の遺伝子発現差である可能性も考えられ，遺伝子発現バターンを用いたり
ンパ節転移診断には限界があるものと考えられた．本研究によルアレイデータを基にして
神経周囲浸潤を予測することが可能となり，このことは胆道癌の治療戦略を構築する上で
極めて有用性が高いと考えられた．
学位論文審査の要旨
学位論文題名
cDNA アレイデータから特徴選択された 遺伝子による胆道癌神経周囲浸潤の予測
胆 道癌 は 難 治癌 の ーっ と されてい る．今回 ，申請者 は胆道癌 を遺伝子発 現プ 口 ファ イ ル に基 づ き， 癌の個 性化診断 を行うこ とを目的 として，cDNA ア レ イ を 行 っ た ， 胆 管 癌15例 ， 胆 嚢 癌11例 ， 乳 頭 部 癌11例 の 合 計37例 の胆 道 癌切 除 検 体を 対 象と した．1，289種類の 癌関連遺 伝子が搭 載された array filterを用い，症例の識別にはk‑nearest neighbor法に基づくleave‑one‑out 交差 検 定法 を 用 い， 診 断に 有用な 遺伝子の 抽出する 特徴選択 には前方逐 次 探索法を用いた，
結 果で あ る が， リ ンバ 節 転移と神 経周囲浸 潤の有無 で発現差 を認める遺 伝子 が 多く ， そ れぞ れ51と100の遺 伝 子 が抽 出 され た ． 胆道癌の りンパ節 転移の有無 で発現差 を認めた51遺伝子か ら特徴選択を行い，leave‑one―out 法による識 別率を計 算すると ，24〜28遺伝 子の組み合わせを用いることで，
94.6a/oの正診断率 で診断可 能であっ た．また ，胆管癌 ，胆嚢癌 ，乳頭部癌 で，リンノ ヾ節転移 の有無で 発現差を 認める遺伝子を抽出すると，それらす べてに共通 する遺伝 子はなく ，胆道癌 のりンノ¥節転移に は特徴的な 遺伝子 の存在が考 えられる が，それ らはそれ ぞれの癌の発生部位により異なってい ると 考 えら れ た ，神 経 周囲 浸 潤 の有 無 につ い て は発 現 差を 認めた100遺伝 子から特徴 選択を行 い，leave‑one‑out法に よる識別率を計算すると，3〜60 遺伝子の組 み合わせを選択することで，1000'/0の正診断率で診断可能であっ た．StageIB以上 の 症 例で 検討す ると神経 周囲浸潤 の有無で147遺伝子に 発 現差を認め ，特徴選択を行い，leave‑one‑out法による識別率を計算すると，
100％の正診断 率で診断 可能であ った．ま た，胆管 癌症例の みで検討す ると 神 経 周 囲 浸 潤の 有 無 で204遺 伝 子に 発 現差 を 認 めJ同様 に1000/0の 正 診断
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教 教
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率で識別可能であった．癌の発生部位を限定することで，より多くの遺伝 子に発現差を認めたが｜これは胆嚢癌，乳頭部癌の影響が排除され より 胆 管 癌 と し て の 生 物 学 的 特 徴 を 反 映 し た も の と 考 え ら れ た ．
以上の結果から，遺伝子発現/ ヾ夕ーンを基に胆道癌神経周囲浸潤の有無 を診断することが可能であり，臨床診断への応用の可能性が示された．ま た｜胆道癌はその発生部位により，特徴的な発現バターンを示すと考えら れ ， 今 後 各 部 位 別 に 検 討 す る こ と が よ り 重 要 と 考 え ら れ た ，
口頭発表においては，吉木敬教授より症例数の妥当性，リンパ節のさら に詳細な病理学的検討の必要性について。っづいて守内哲也教授より最適 遺伝子に含まれる遺伝子に関する質問があった。また，加藤紘之教授より 胆道癌に関して予後因子と報告されている分子との関連，発生部位により 抽出される遺伝子が異なる理由についての質問があったが申請者はおおむ ね妥当な回答をした，
