シラカンバ材のセルラーゼによる糖化 : 前処理の効果

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シラカンバ材のセルラーゼによる糖化 : 前処理の効果

その他（別言語等）

のタイトル

Saccharification of shirakanba wood with cellulase : Effect of pretreatments

著者三宅基夫, 市川和義, 中島洋幸, 奥山寛

雑誌名帯広畜産大学学術研究報告. 第I部

巻 15

号 4

ページ 287‑292

発行年 1988‑06‑30

URL http://id.nii.ac.jp/1588/00002063/

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＃大研報Ⅰ，15（1988）：287〜292

₂₈₇

シラカンパ材のセルラーゼによる糖化

前処理の効果

三宅基夫・市川和義・中島洋幸・奥山寛

（受理：1987年1】月30口）

Saccharification of Shirakanba wood with cellulase Effect of pretreatments

Moto MIY＾K三ニ，Kazuyoshilc川K∧W∧，HiroyukiNAKA］rM．A and HiroshiOL（UYAMA

摘要

シラカンパり抽混町紳叫即妙加）材をバイオマスとして利用する基礎研究の一つとして，

セルラーゼによる糖化を行った。苛性ソーダ，シュウ酸による前処理および水煮煮前処理を試みた。シュウ酸前処理は効果がなかったが，苛性ソーダと水素煮前処理は顕著な効果が見られた。この糖化率向上の主な原医は．前処理による細胞壁構成成分の悦離による細胞壁構造の変化のためだけでなく．アセナル基の除去が原田と考えられた。

育し成長も速い。然るに，ウダイカンパなとと巣なり，

早生樹で大径木が少なく，比較的容積密度も，物理的強度も低く，建築・家具などのような物理的利用に対する評価は低い。

だが，一方．バイオマスとしてエネルギーや化学⊥

業，飼料などの資源と考えた場合．種々の特徴ある性

質が見出きれる。簡単な前処理で酵素に対する反応性が向上し‖，反葡動物の飼料とした時の可消化性が高

くなることなどが知られているつ〜与）。

この報告では．シラカンパをバイオマスとして化学

工業の原料や家畜の飼料とする時の基礎となる研究の

一つとして．酵素に対する反応性を高めるための前処理条件を検言寸した。

1緒

人目の増大と経済生活の高射ヒは，資源の多消費をもたらし．新しい資源の開発や有効利用技術の確立が

強く望まれている。掛こ太陽エネルギーを固定化する

ことで生産されるバイオマスは∴再生産のきく資源と

してだけでなく，環境汚染をもたらさない資瀕として．

これの生産と利用技緬の確立が強く要望されている。

適度の気候と降水に恵まれた我が国においては，このバイオマスの生産性が高いことからも，一層重要性が高い。

シラカンパ（麒血血イ血頻画材眈）は北海道全土に普遍的に生育する広義樹で．しばしば山火跡地や皆

伐跡地では純林を形成している。立地条件を選ばず生

箱広畜産大学農産化学科林産化学研究室

Lat〉【】rat口ry〔〉f Forest Products Chemistry．Departmモnt Of AgriculturalChemistry】Obihjro Universityりf Ag■riculture and Veterirlary Medicine，Obihiro，Hokkaid0080，Japan．

33

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三宅基夫・市Jll和義・中島洋幸・奥山寛

謝

理時間は所定温動こ到達してからの時間で．この所定温度に達するまでの時間は，12D℃で約亜分，1即℃で約70分であった‖薫煮処理後の試料は吸引濾過し，熱水で洗浄した。

2．3 酵素による糖化

使用した脊索は，市販のγrよc九0（ゴermqび右ridg起源のセルラーゼONOZUK∧ R10（近畿ヤクル

ト製重工業）であった。

糖化の条件は，基質濃度2％，酵素濃度0．4％，PH 4．5（酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液），温度40℃を標準

条件とし，所定の時間処理した【1

糖化浅葱はガラスフィルターで吸引漉過，洗浄，乾燥後定量し．試料の減少蜃を糖化率とした。

また．濾液中の還元糖量をS8mロgyi変法により定量した‖。な虻．糖ほグルコースとして算出した。

他に下記で述べる方法に準じて．G】」Cで中性糖組成

を調べた．〕

酎ヒのための前処理試料は，成分の脱離により生成

すると考えられる細孔が乾燥により滑れるのを防ぐた

め，洗浄後乾燥させないで使用した。

2．4 試料および処珪物中の多糖とリグニンの分析

脱脂読札前処理試軋掛ヒ残漆などの木質試料吼

Saemanらの法†）で加水分解後，生成した中性糖を還元後アセナル化しアルデトールアセテートとして，

イノシトールの内部標準でGIJC定量をした8）前記 2 実験

2．1空電料

試料は本学構内に自生したシラカンパ（樹齢15年，

樹高9．5m）を剛、た。材部を1．5XIX4cm程度のチップとし，ウイレーミルで粉砕し，亜〜00メッシュ画分をアルコール・ベンゼン（1：2 V／V）で脱脂し試料とした。

2．2 前処理 2．2．1苛性ソーダ処理

脱脂試料に50倍屋の1％苛性ソーダ溶液を加え2時

間沸騰潟浴中で処理した。その後ガラスフィルタ￣で吸引濾過し，熱水10％酢酸溶液，熱水の順で洗浄し

前処理物とした。

2且2 シュウ酸処理

前記と同様に試料の50店屋の1タ電シュウ酸溶液を加えZ時間沸騰湯浴巾で処理し．波過，熱水洗浄した。

なお．処理後の収率昂1％苛性ソーダの時とほぼ同じにするため．3％シュウ駿溶液で4時間処理を行った前処理物も造った。

2．2．3 水素煮処理

約4【伽】容ステンレス製ビーカーに脱脂試料と10倍量の水を加え，それを500血1答の電熱式オートクレ￣

プに入れ，所定の温度で所定時間処理した。なお，処

粛一義前処理による試料中の成分組成の変化

計リグニン合計試料前処理収率構成中性多糖

条件ラムナンアラビナンキシランマけンガラグタングルカン

67．8（100）19，3（100）87．1 76．7 21．2 97．9

60．5（89）16．7（87）

64．T 21．7 86．4

57．7（85J19▼7（畑2）

63．6 25．8 89．4

0．8（100）40．5（100）

0．g 50．0

0．7（組〕39＿4（97）

0．7 40，8

8．6（75）36．4（90）

0．6 48．9 未処理川0 0．3（100）1，1（100）22，3（100）2・8〔100）

0．2 1．1 22．8 l．7

哨雄ソーダ 78．8 0．2（67）0．9（82）18．0こ81）1．3（46）

0．2 0．7 19．3 3．0

ユ％タユウ複

89．2 0．2（67）0．6（55）17．2（77）2．7（粥）

0．1 D．4 10．8 2．8

班シュウ應

77．3（）．1（33）0，3（27）8．3（37）2．2（7g）D＿5（63）37・8（93）49・2（72）19・9（103）

処精条件：沸騰湯浴．2hr，3％シュウ酸は4hr 収率：未処理脱脂試料に対する％

成分値∴L段は各前処理試料に対する‰下段は未処理脱胎試料に対する％・

（）は未処理脱胎試料の各成分に対する％

34一

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シラカンパ材のセルラーゼによる糖化

28g

のSaeman らの法による酸加水分解の残債をリグニ

ン量として定呆した。

2，5 試料および水蒸煮前処理試料中のアセチル基の

定量

脱脂試料および前処理試料の7セチル基の謹呈は．

ナトリウムメトキシドでメタノリシスすることにより

生成する酢酸メチルを，内部療準としてn一吉革鞍メチルを用いGLCで定量分析した㌔

3 結果および考案

3．1苛性ソーダとシュウ酸前処理による試料の成分

組成の変化

苛性ソーダとシュウ散で嗣処秤Lた試料中の成分組成の変化を第1表に示した。各処理試料の分析値の上段の債は各試料に対する成分組成値で．F投の値はそ

の各組成値に収率を掛け未処理試料に対する値に換算

した値である。括弧内の値は未処理試料中の各成分に対する百分率である。

脱脂の未処理試料では酸加水分解で生ずる中性糖と

浅漬のリグニンとの和が87．1％に過ぎないし−これは，

両者以外の物質がtO％以⊥あることを意味する。この

羊な物質ほ，ウロン酷顎やアセナル茹である。

このような中性多糖とリグニンとの和が則戯以下で

ある現象ほ．ヘミセルロースとして，ウロン酸やアセチ／レ葺合量の高いキシランの多い広葉樹やササなどで多く見られるが1U）シラカンパではヰシラン含量がとく

に多いことからこのような現象が顕著であるし−

1％苛性ソーダ2時間，3％シュウ懐3哨間の前処理の収率はほぼ同じであるが，その処世により抽出除

去きれる成分はかなり異なるヨシュウ懐荊処輝ではキ

シランを中心とするヘミセルロースの除去か寺体であ

り，定量される中性多糖の総量の減は．処軌こよる収率の減量を上回っている、d然し，リグニンの除去はない（やや増加しているのは処理により成分に何等かの変化が生じたためかも知れない）。また，巾佐多糖とリグニンとの和は．3％シュウ酸処理の時でも89＿4％

に過ぎず未処理試料と近似で．ウロン酸やアセチ／レ基が脱離していないことが推定された。

一方一苛性ソーダ前処理の収率は78．8％で，全体で 2】．2％の減である。中性多糖は各多糖で多少の羞はあ

るが全体で7％程度の睨離であり．リグニンは3％軽度の除去であった。したがってこの両者の計は約10％

に過さず．収率の約21％減と比べ大きな差がある。この原因は．中性多糖の合計とリグニンとの和が97．9％

と大きく向上したためで，未処理試料巾に存在したウロン酸類や7セチル基が睨離し除去されたためと推定された。

3．2 苛性ソーダとシュウ酸前処理試料のセルラーゼ

による糖化

3．2．1糖イヒ率と生成楯敷こおよぽす前処理の効果

前処理条件の遭いによる糖化率と生成糖鼻を第2蓑に示した。シュウ酸処理は効果がなく，1％シュウ顧処理では未処理より糖化率が低い。

木質試料を前処理すると酵素に対する反応性が高ま

る原因として，細胞壁成分の部分的脱離により，細孔が生ずるため，高分子の酵素と多糖類との接触面が多くなることが考えられている。

前述したが，3％シュウ酸処理ほ1％苛性ソーダとほぼ同程度の成分脱離であり．脱離成分はキシランを主体とする多糖で．苛性ソーダ処理より細孔生成はむ

第2表試料の糖化率と生成糖量におよばす前処理の効果

前処理方法

未処理

^{1％苛性ソーダ} ^{1％シュウ酸}

^{3％シュウ酸}

糖化率生成糠星糖化率生成機豊橋化率生成糖呆糖化率生成培量

2 6 4 ﹁コ︵り 2 6 0 ￠U 6 2 ワ︼ 3 3 4

7 2 7 2 月U 3 4 ごU 8 qU

ごU 2 4 8 2 1 2 4 7 エリ＋ハ﹁り 2 6 6 2 2 4 ﹁へ∪ 6 9 7 1 2 ﹂． 24 31 39 亜 56 3 1 ハtU 9 2 ウ山﹂︼ 4 4 ﹁〇

2 5 0 8 ﹂

∩ヽU rnU 亡U EU 7 ﹁J 6 7 7 へヽリ 3 4 5 艮U 7 5 2 9 日O 4 ．4 6 7 免U 9

各試料にする％

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三宅基夫・市川和義・中島詳幸・奥山貰

200

これは，キシランは細胞壁のマト■ノックス成分であるが，セルロースは大部分が結晶構造を取っており分解されづらいためであると思われる。

糖化液中の中位糖をGLC分析し第4表に示した。

ベントーザン乗削ま残存豊から推定される億とほぼ一致

したが．へキソーザン類ではマンナン，ガラクダンの値が．試料中に最初から存在する値や糖化され生成す

る値と比べて大き過ぎる。へキソーザン類の線量としては．残存重から推定される値と一致することから糖

化処理中に異性化が起きていることが考えられる。

3．3 水薬煮前処理

3．3．1水蒸煮前処理による成分組成の変化葉煮の最高温度保持時間＝時間で．最高温度100℃

までの種々の温度での試料の成分組成の変化を，第5 表に示した。1400c以下では成分の分解は少ないが，

160℃以上ではキシランを中心にヘミセルロースの分

解が多く起き抽出される。これとともにリグニンの分解も起こるがセルロースは比較的安定で分解は少ない。

この分解の型は当然のことであるが∴前述のシュウ

鞍前処理の型と近似である。然し，定量された成分のしろ多いのではないかと思われた。然るに．セルラー

ゼに対する反応性が低い。この原因はこの処理では悦服しないアセナル基やウロン酸が．酵素活性を阻害し

ているためと思われる。

Somogyi法で定量された還元糖iは．処捜による減量から算出された糖化率よりかなり多い。これは．

還元梅里は加水分解された単糖豊であるが，減量での糖化率は，多糖として算出されているためと．キシロースがかなり存在するにもかかわらず，すべてグルコースとして定量したためである。

3．2．2 セルラーゼ糖化による苛性ソーダ前処理試料

中の構成多糖の変化

苛性ソーダ前処理試料中の多糖が，処理時間とともにどのように変化するかを，試料中に残存する多糖を分析することにより調べ第3表に示した。試料中の多

糖の主体はキシランと主にセルロースを構成するグル

カンであるが，この実験に使用したセルラーゼはキンランも良くI酎ヒし，6時間で50％が糖化され，72時間で兄の残存量となった。これに対して．グルカンでは 6時間で22％しか糖化されず．72時間でも約焔が残る。

第甘嘉1％苛性ソーダ前処理試料中の多糖類のセルラーゼ糖化による変化

構成中性多糖（残存率）

糖化時間

hr

ラムナンアラビナンキシランマンナンガラクタングルカン

78．T（100）

糾．5（71．1）

49．8（朗．9）

44．5（≡道，0）

37．1（48．3）

30．4（39．6）

0 0．2（100） 1．】（1〔旧）22．8（100）1．7（100） 0．9（100） 50．0（100）

0．7（78） 38．8（78）

0．6（67） 36．5（73）

0．4〔舶） 33．7（67）

0．4（44） 29．0（58）

0，3（3：j） 23＿4（47）

6 0．3（150） 1．3（118）1l．4（別） 2．0（118′）

12 0．2（100） 0．8（75）10．3（45）1．4（82）

24 0．1（50） 0．6（55）臥6（38） 1．1（65）

亜 0．1（50） 0．4（36） 6．1（27） 1▲1（65）

72 痕跡（0）仇4（36） 5．3（23） 1．0（59）

前処理試料に対する％．（）は試料の各多糖に対する％

第4嘉1％苛性ソーダ処理試料のセルラーゼ糖化液中の中性格組成（％）

ラムナンアうビナンキジランマンナンガラクタングルカン

7 6 7 9 9 0 爪U O O O Q︶ q︶ q︶￠U ハJ ・■1 8 2 3 nV 2 2 りJ 4 一hJ

∧U ハU ＜U O O 9 7 7 nO 3 g ll12迅17 nO 2 0 ウ﹈ 0 1 2 2 3 3 g O 3 nO 3 2 3 3 3 4 5 ︻dノ 1 8 丁 7 1 4 9・﹂︼ l l l ワW

61224亜72

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シラカンパ材のセルラーゼによ多糖化

策5義水飛煮による試料中の成分組成の変化

291

脚温度牌pH7セ封レ塞

隕成中世多糖

℃

ラ、ムナンアラビナンヰシランマンナンガラクタングルカン

未処理1払ちa（価）仇ユ（1師）11（】00）228て1伽）2・8ル師）l‖（1開）qn5〔㈹ 7月・l亡1師）1g▼3（1（貯）92■4

抑蹄臥紺野6897矧

郷⁝叫榔肌

用鯉70鑓柁4972射

躯泌耶 87

蝕姻d33g訂396135

6 5 0 仝け 8 2 J 糸 2 つー⁝一し L l − nV

叫ハ≠ ︑小い＝

．■ ︑■ ・ ︑・︑りし・・l ■︑﹁J

L hU L 打︶ l甘心O ︹ひ ▲・

即断策 33

口占ヮー∩と︻＋∩と l J l l

乃 ︑為ほ沌

サJ 2 7 5 1 8 5 3

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1朝

⊥ 丸 ⁚V ＝︑

19Zlは別1隠狙廿

抑．5 4．5

鋸U7 31

酪．5 3．0

57．5 3Ⅷ

蒸煮時間：1hr

収率：末弟煮脱脂試料に対する髄

成分値二上段は各兼患済み試料に対する％．下段は兼薦煮脱脂試料に対する％

（〉は未発素腹脂試料の各成分に対する％

合計が1鮒℃のとき弧7％，Ⅰ80℃のとき97．5％と大きく，シュウ醒前処理のと毒と異なりアセチル基が凄とんど脱解している、。

3．3．2 水素煮温度および糖化処理時間と糖化率 12β℃から1800cまでの各種最高温度で素意前処理した試料を72時間まで棒化処理した結果を欝6泰に示した。糖化率は試料全体の減量で測定した値であるので，

試料中由糖類のみめ減少として計算すると右欄の値と

なる。ユ80℃蒸煮試料でほ，多糖の59．7％が焉酎ヒされた。こゐ試料は第5蓑で示したが，議案処理で多糖￠

43鞘が低分子化され抽出されている。残存した57％のうち59．7％がここで糖化されたのだから一重郡で約75 鱒が低分子軋埠化されたことになり．多糖の低分子化条件として優れた方法である。然しl水素煮液の処理法や高温でのベントサンのフルフラール化など．今

後処理条件について割こ研究が必要である℃

第7表に糖化処理時間と糖化率の関係を示した。開始から24時蘭で，72暗闇までの糖化呈の約半分が糖化される凸亜時間までは，ほぼ直線的に毒酎ヒ率は同上するが以後は遅くなら亜時間から柁時間までの24時間の糖化率は．初めの24時間の1／5以下である。72時間以上では効率の問題だけでなく．雑菌による汚染の間堵が起こる。

試料のメッシュを小さくす尋と糖化が早まることも

見出もているし▲1），第2褒で示したが1％苛性ソーダ前処理試料では，72時間の最終糖化率は殆ど変わらな

いのに，4時阻までの初期の糖化率が大きく，反応速

第6真水議案前処理温度の異なる試料の糖化率前処理温度糖化率

℃ 試料に対する％構成多糖に対する％

理処2048飢80

束1 1 1 1

6 ごU nJV −hU 2 軋9．ン 1941亜 0 6 6 ウん 7

臥13訂57鯛

糖化時間：72時間

第7衰180℃，1時間水素煮試料の司郎ヒ処理時間

と糖化率糖化時間

br 試料に対する％構成多糖碇対する％

2 6 ∩▲U qU 7

八け八b Q︶ 4 9 1 つ︸﹁a ra

﹁∂ ︵‖V 2 3 2 ・4−ク︸ l aJ 3 1 2 3 ■A▲

4 1224亜 72

庶が非常に異なる。処断こよる細胞壁構造変化が襲うためと考えられるが，試料の形状の問題とともに，処

理時間についても吏に検討が必要である。

4 結論

シラカンパ材は．沸騰潟浴中での1貼苛性ソーダ前

37

(7)

三宅基美・市川和義・中島洋幸・奥山竜

2翫≡

処理や．160〜180℃での水煮貴所処理などの筒単な前処理により，セルラーゼに対する反応性が著しく高まる。両処理とも処理済み試料の約45軋処理済み試料申の糖類のみに対して言えぽ60％が糖化される。

1％苛性ソーダ前処理でほ試料の20％嵐1邸℃の水菜煮では30％強が分解抽出される。これの主体は糖

類であるめで】この節処理彼の取り扱いの研寒が必要

である。水素煮前処理液の方が取り扱い易い。また一

この場合高温ではベントサンからのフルフラールの生

成について注意する必要がある。

まぁこの二つの前処理ではセルラーゼ権化反応の

活性を高吟るが，シュウ酸処芦別ま前処理法としては効

果がない。前処理により反応性が高まる原因が細胞壁からの成分脱離によ恕細孔の生成とすれば．この結果

ほ菜膚する。キシランのアセチル基がセルラーゼの活性を阻害している可能性が高い。

シ＝Lウ板前処理はキシランを選択的に分解袖出するので，キシリトール製造法としで利用出来ると思われる。

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SⅦmm8ry

As a run（1a爪enLalstudy（）n utllizati（】n（〕∫

w80d for biomass，Sbirakanba〔放と匹ねpZα己y【

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efreCt呂ロn eTlオy汀18ti【：Sa（：（：上Ia州iぐ】且tion with eellulase．1tis pTeSume止tllat【1if如erlL efrect

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ー38

シラカンバ材のセルラーゼによる糖化 : 前処理の 効果