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総 合 研 究 分 担 研 究 報 告 書
ヒトの感染に関与する家畜の探索
西川 禎一
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平 成 ２ ７ 〜 ２ ９ 年 度 厚 生 労 働 科 学 研 究 費 補 助 金
（ 食品の安全確保推進研究事業）
食品での新たな病原大腸菌のリスク管理に関する研究 研究代表者 工藤由起子 国立医薬品食品衛生研究所
分 担 研 究 報 告 書
ヒトの感染に関与する家畜の探索
研 究 分 担 者 西 川 禎 一 大 阪 市 立 大 学 大 学 院 生 活 科 学 研 究 科
研究協力者
坂 瑛里香 大阪市立大学 大学院生活科学研究科 吉田優香 大阪市立大学 生活科学部
大森裕子 大阪市立大学 大学院生活科学研究科 鄭 冬明 大阪市立大学大学院 生活科学研究科 涌嶋美津子 大阪市立大学 大学院生活科学研究科 中台（鹿毛）枝里子 大阪市立大学 大学院生活科学研究科 市川直樹 大阪市立大学 大学院生活科学研究科
腸 管 毒 素 原 性 大 腸 菌 （ET EC） の 宿 主 特 異 性 を 探 る た め ，ET ECの 主 要 な 血 清 型 で あ るO169 : H41（ 以 下O169） の 病 原 プ ラ ス ミ ド の 全 塩 基 配 列 を 決 定 し た ． 全 長14 5,082 bpで ，GC含 量 は ，46.1 5 %で あ っ た ．182の タ ン パ ク 質 コ ー ド 配 列 が ア ノ テ ー シ ョ ン に よ り 推 定 さ れ た ．本 プ ラ ス ミ ド はRepF IIプ ラ ス ミ ド フ ァ ミ リ ー に 属 す る が ， 他 のRepF IIフ ァ ミ リ ー の ヒ トET ECプ ラ ス ミ ド と 比 べ て サ イ ズ が 大 き く ， 挿 入 配 列 の 割 合 が 高 い こ と ，プ ラ ス ミ ド の 安 定 性 に 関 す る 遺 伝 子 が 少 な い こ と ，が 明 ら か に な っ た ．本 菌 がi n vi t roで 容 易 に プ ラ ス ミ ド を 喪 失 す る 原 因 と 考 え ら れ る ．し か し な が ら ， O16 9は 四 半 世 紀 に 渡 り 主 要 なET ECの 地 位 を 占 め て お り ， 病 原 プ ラ ス ミ ド を 落 と さ な い 選 択 圧 が 野 外 で は 働 い て い る ． 本 菌 に は CS6，C S8 -l i ke，K 88 -l i ke， 以 上3種 類 の 腸 管 定 着 因 子 が コ ー ド さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た ．極 め て 不 安 定 で 脱 落 し や す い プ ラ ス ミ ド で あ る に も か か わ ら ずi n vi voで は よ く 維 持 さ れ て い る 理 由 と し て ， 異 な る 宿 主 に 対 応 で き る 定 着 因 子 を コ ー ド し ，O16 9の 感 染 適 応 力 を 増 強 す る 上 で 本 プ ラ ス ミ ド が 大 き く 寄 与 し て い る た め と 推 察 さ れ る ．3種 の 定 着 因 子 遺 伝 子 を 用 い て 組 み 換 え 用 菌 株T OP1 0を 形 質 転 換 し ， 腸 粘 膜 上 皮 細 胞 に 対 す る 付 着 性 と 宿 主 特 異 性 を ヒ ト ，ブ タ ，ウ シ の 培 養 細 胞 を 用 い て 検 討 し た ． そ の 結 果 ， 定 着 因 子K 88 -l i ke遺 伝 子 で 組 み 換 え た 株 は こ れ ら ３ 種 の 細 胞 に 強 い 接 着 性 を 示 し た ．本 プ ラ ス ミ ド は 多 様 な 宿 主 へ の 感 染 力 を O169に 提 供 す る こ と で ， 野 外 で は 保 持 さ れ て い る よ う だ ．O1 69の み な ら ず ，ET E C対 策 に はOne Heal t hも 考 慮 し た 検 討 が 必 要 と 考 え ら れ る ．
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王 麗麗 大連理工大学・大阪市立大学 大学院生活科学研究科 輪島丈明 東京薬科大学薬学部
濱端 崇 国立国際医療センター研究所 和田崇之 長崎大学 熱帯医学研究所 中村寛海 大阪健康安全基盤研究所 安倍博之 大阪大学 微生物病研究所 堀口安彦 大阪大学 微生物病研究所 麻生 久 東北大学大学院 農学研究科 Weiping Zhan カンザス州立大学 獣医学研究科
A. 目 的
大腸菌(Escherichia coli) は，恒温動物 の腸内に広く分布しており，ヒトにおい ても出生と同時に腸管内へと急速に広が り常在菌として定着する(1)．しかしなが ら，大腸菌の一部には特殊な病原因子に よって人に下痢症を起こすものがあり，
行政的には病原大腸菌，学術的には下痢 原性大腸菌（Diarrheagenic E. coli，以後 DECと略す）と呼ばれる．
DECは，その病原機構に基づいて①腸 管病原性大腸菌（Enteropathogenic E. coli, EPEC ）， ② 腸 管 毒 素 原 性 大 腸 菌
（Enterotoxigenic E. coli, ETEC），③志賀 毒素産生性大腸菌(Shiga toxin-producing E. coli; STEC)， ④ 腸 管 侵 入 性 大 腸 菌
（Enteroinvasive E. coli, EIEC），以上４群 に長らく大別されてきたが，2012年１月 か ら は ⑤ 腸 管 凝 集 接 着 性 大 腸 菌
（Enteroaggregative E. coli, EAEC），も DECに認定された．他にも分散接着性大 腸菌（Diffusely adherent E. coli, DAEC）， 細胞膨化致死毒素産生性大腸菌(CTEC)，
腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素
（EAST1）遺伝子保有大腸菌（EAST1EC）， 細胞剥脱性大腸菌（CDEC）など，新た な DEC の候補とされるサブグループが 複数存在する．
食中毒事件の調査に際しては，これら
すべてを調査対象に含めることが望まし いとされるが，DECと常在大腸菌を識別 することは極めて難しく，培養法を中心 とする日常的な検査業務では看過されが ちである．我々は，これらDECの多くを 網羅的に検出する方法として，マルチプ レックス・リアルタイムPCR法を適用し た増菌培養液のスクリーニング手法と (2)，スクリーニングで陽性と判定された 検体から DEC を的確に釣菌分離する手 法として疎水性格子膜（HGMF）を用い たコロニー・ハイブリダイゼーション法
（HGMF-CH法）を開発した(3)．
平成 24〜26 年度に実施した食品の安
全確保推進事業では，上記の手法を用い てヒト，家畜，食肉等における各種病原 大腸菌の汚染実態を調査し以下の結論を 得た(4-7)．①検出分離されるEPECのほ とんどが非定型 EPEC（atypical EPEC:
aEPEC）であり，これらはEHECよりも
はるかに高い率で家畜から家禽にいたる まで分布する，②aEPECの分子疫学指標 はウシ由来株と患者由来株の関連を示し ており，ブタや健康者の分離株はヒトへ の下痢原性が低いと推察される，③家禽
由来 aEPEC の病因学的意義は今後の課
題，④EIECは検出されずわが国でのリス クは低い，⑤EAECやDAECの汚染源は もっぱらヒトであり家畜が関与している 可能性は低い，⑥健康者ではETECの保
41 菌は見つからずブタや食鳥が想定以上に 高い率でETECを保菌しておりヒトの汚 染源となり得るか否か，動物由来株と患 者由来株との分子疫学解析が必要．
本研究は，上記⑥について検討するこ とを目的に行った．ETEC O169:H41（以 後O169と略す）は1991年に日本で初め て発見されたが(8，9)，以後， O169 感 染の報告が日米で相次ぎ(10-14)，1990年 代にはETECによる集団感染の多くが本 血清型菌によるものとなった(15)． O169 は他のETECでは見られないHEp-2細胞 への強い凝集接着性を示すことが発見当 初から報告されており(10)，その細胞接
着像はEAggECのHEp-2細胞への接着像
に酷似しているが，EAggEC の凝集接着 に関与する線毛の発現を制御する遺伝子 aggR を保有していない．このことから，
本菌が未知の定着因子を保有する可能性 が示唆された(10)．
ETEC には厳密な宿主特異性があって，
ブタやウシのETECはブタやウシのみに 感染し，ヒトのETECはヒトのみに感染 すると一般に考えられている．しかしな がら，O169が特異な接着像を示したこと，
また 1991 年以降急激に広がったことか ら，その腸管定着因子が従来の定説とは 異なる宿主特異性を有する可能性も否定 できない．そこでETECが人獣共通感染 症を起こす可能性を検討する材料として O169 を取り上げ，その病原プラスミド
（pEntYN10）の全塩基配列を決定し，本 菌の接着因子をコードする遺伝子の解析 から O169 の急激な流行の理由や宿主特 異性を探った．
B. 方 法
１．使用菌株
下痢症患者の便から独自に分離した
ETEC O169:H41 の YN10 株 と ETEC O159のIND株 を実験に供した．いずれ の株も毒素遺伝子であるest (STp)を保持 していた．大腸菌の実験室株として One Shot® TOP10 Chemically Competent E.
coli ( Life technologies )，Competent-high DH5α（TOYOBO，大阪）および JM109
(TOYOBO, 大阪)を実験に供した．
２．培養細胞
ヒト結腸癌由来の上皮細胞である
Caco-2 (16)および喉頭ガン由来のHEp-2
細胞 (17)，ブタ小腸由来の上皮細胞であ
るIPEC-1 (18)およびブタ空腸由来の上
皮細胞であるIPEC-J2 (19, 20)，ウシ腸粘 膜上皮細胞であるBIE (21)について，各 細胞指定の組織培養液を用いて実験に供 した．
３．プラスミドDNAの抽出
O169 YN10株をLBブイヨンに接種
し37℃で振盪培養した．Plasmid DNA Purification KIT BAC 100（タカラ）を用 いて回収した菌体からプラスミドを抽出 し，アガロースゲル電気泳動によって染 色体DNAと分離した．クロラムフェニ コール耐性遺伝子のベクターである
pSV28（Cmr）は形質転換した実験室株を
LBブイヨンに接種し37℃で振盪培養し て菌体を回収後にQIAprep®Spin Miniprep Kit ( QIAGEN )を用いて抽出し た．
４．プラスミドのシーケンス解析 塩基配列の解析はタカラバイオに委託 し，シーケンサー（FLX System; 454 Life Sciences, Roche Applied Science, Branford,
CT）を用いた解析により150のコンティ
グ（塩基配列断片群）情報として得た．
各コンティグのつながりは，GS De Novo
42 Assembler (ver. 2.5.3)を用いて調べるとと もに，隣接するコンティグを跨ぐPCRを 実施して，その産物のシーケンスを学内 の解析サービスまたは FASMAC に委託 して検証した．
PCR産物で依頼する場合は，増幅産物 をアガロースゲルから Wizar® SV Gel and PCR Clean-Up System ( Promega, USA )を用いて切り出し，プロトコールに 従って精製した．サンプルの濃度などの 調整は各委託先の定めに従った．
コンティグの繫がり方が不明になって いる個所については，両コンティグに特 異的なプライマーを設定し，PCR を用い て連結の有無を検討した．プライマーの
設計には GenoFinisher (東北大学大学院
生命科学研究科遺伝情 報動態研究室：
GenomeMatcherプロジェクト）を使用し
た．contig_linkファイルの情報をもとに，
隣接していると考えられるコンティグの プライマーを一つずつ用いて，プラスミ ドをテンプレートにPCRを行った． そ の後，アガロースゲルで電気泳動を行い，
予想通りのサイズの PCR 産物が得られ れば，二つのコンティグが連続している と判断した．
一部のコンティグでは，コンティグの 塩基配列が酷似していてアセンブラーが 1 種類のコンティグと認識してしまって いるが実際には別のコンティグで数か所 の塩基が異なる，いわゆるバリエ一ショ ン問題が存在したり，他のコンティグの 配列と相同性が高かったりして特異的な プライマーを設計できず，隣接するコン ティグ間でPCRをできなかった．その場 合は，そのコンティグをまたぐ形で３つ のコンティグの間で PCR を行い，PCR 産物をテンプレートにシーケンスで塩基 配列を確認した．
５．アノテーション
タ ン パ ク 質 コ ー ド 配 列 （Cording sequence；CDS）の抽出はアノテーショ ン 用 パ イ プ ラ イ ン Microbial Genome Annotation Pipeline (MiGAP)を用いて行 った．推定されたCDSは，BLASTPを用
いてGenBank内に類似のアミノ酸配列を
持つタンパクを探索することで確認した．
同一塩基が連続する領域でシーケンサー
454 FLXが読み取りミスを起こし，結果
としてフレイムシフトによる誤ってアノ テーションされるのを避けるために，そ れらの領域についてSanger法で塩基配列 を決めた．すべての塩基配列とアノテー ション結果を DNA Data Bank of Japan (DDBJ) に 登 録 し た （ Accession No.
AP014654）．
６．ペアワイズアライメント
塩基配列から推定されたアミノ酸配列 の類似度は，EMBOSS needle programを
ウ ェ ブ サ イ ト EMBL-EBI
(http://www.ebi.ac. uk/Tools/psa/)で用いる ことで比較した．
７．系統樹の作成
アミノ酸配列に基づいた系統発生樹は，
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) 6.06.41を使用した500レプリケ ー シ ョ ン ブ ー ト ス ト ラ ッ プ 分 析(500 replicate bootstrap analysis)および近隣結 合 法 (Neighbor-Joining method with a poisson)を使用して作成した(12)．ブート ス ト ラ ッ プ コ ン セ ン サ ス 系 統 樹 (Bootstrap consensus trees) には，平均ブー トストラップバリューを記入した．
８．In-fusionクローニング
接着因子の安定的な発現には，プロモ ーターより上流の領域も必要なのではな
43 いかと考え，先行研究(22)にならい，
YN10のCS6の前後1500 bpを含んだ領 域を挟み込むプライマーを設計しiProof High Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad, USA)を用いて増幅した．さらに，
CS8(CFA/III)の前後1000 bpを含んだ領域，
K88(F4)-likeの前後1000 bpを含んだ領域 についても同様にプライマーを設計し増 幅した．
pSV28を制限酵素EcoR I-HF® (NEB)
とBamH I-HF® (NEB)で処理し，1%アガ
ロースゲル(SeaKem® Gold Agarose, LONZA,USA)で泳動してから切り出し Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare)を用いて 精製しベクターとした．
前記の直鎖状ベクターと，同様にアガ ロースゲルから切り出し精製した標的遺 伝子領域のPCR産物を混合して
In-Fusion® HD Cloning Kit (TAKARA, 滋賀)を用いてTOP10の形質転換を行っ た．Cm耐性を獲得して生育したコロニ ーを採り，PCRとその産物のシーケンス により目的の遺伝子が含まれているか確 認した．
９．接着性試験
10 % ウシ胎児血清加イーグルMEM
培地（EMEM，日水製薬）を用いて25 cm2 のフラスコに細胞がフルシートになるま で培養した．フルシート後はPBSで洗浄 し，トリプシン処理した後3 倍に希釈し て継代した．トリプシン処理したフルシ
ートのHEp-2細胞をEMEM 12 mlで懸濁
し，24穴プレートの各ウェルに0.5 ml ずつ分注し，CO2インキュベータで48 時間培養した．その後上清を除き，メチ
ルα−D−マンノピラシド(和光純薬)を
0.5%含むEMEMを0.5 ml加えた．供試
菌株を培養したLBブイヨンを10 μlずつ
接種し(50倍希釈)，3時間培養した．細 胞をメタノール固定後，10 %ギムザ液で 細胞を染色し，鏡検した{Nishikawa, 1995
#102}．
１０．モノクローナル抗体の作製
K88-likeの特異的な接着性に関与する
と推察される遺伝子faeG1とfaeG2の塩 基配列に基づきアミノ酸9個分の合成ペ プチドを抗原としてラットの後足裏に接 種し、約3週間飼育後に腸骨リンパ節を 取り出した。細胞融合により、ハイブリ ドーマを作製した。96ウェルプレートで 培養し、抗原と反応する抗体を産生する
細胞をELISA法と凝集反応試験により
選別した。スクリーニングにより、抗体 の産生が確認された細胞群を限界希釈、
シングルコロニーとなるまで培養し、
ELISA法でモノクローナル抗体が作製さ
れていることを確認し、以降の実験で利 用した．
１１．免疫電顕
供試菌は，O169およびO169cured，
Top10，K88-like組込み株を使用した．親
水化処理した炭素膜グリッドに菌懸濁液 をのせて吸着させた後，1% TritonX-100 で菌体の中身を抜いた．2% BSAで10倍 希釈した1次抗体および金コロイドで標 識した抗ラット2次抗体と1時間反応さ せ，2% モリブデン酸アンモニウムで染 色し，乾燥後，電子顕微鏡で観察した．
１２．ウエスタンブロット
供試菌はBuffered Peptone Waterで16 時間培養後，超音波処理破砕によりタン パクを回収し，SDS-PAGE（12.5%）を行 った．1次抗体として作製したモノクロ ーナル抗体，2次抗体としてHRP標識さ れた抗ラットIgG抗体を用いた．検出に
44 はECL Prime Western Blotting Detection Reagentを用いた．
１３．凝集反応試験
供試菌はLuria Brothで16時間培養後，
1%ホルムアルデヒド添加生理食塩水で 処理し，実験に供する際にはホルムアル デヒド添加生理食塩水を除き，生理食塩 水で再懸濁した．96ウェルプレートにモ ノクローナル抗体を段階希釈し，死菌懸 濁液を加え，室温で一晩静置した．
C. 結 果
pEntYN10の全塩基配列解析
pEntYN10は，全長145,082 bpで，GC
含量は，46.15 %であった．本プラスミド
には，incFII グループの repA1 と repA2 複 製 遺 伝 子 が コ ー ド さ れ て お り ，
pEntYN10 プラスミドは，RepFIIプラス
ミドファミリーに属することが分かった．
他のRepFIIファミリーのヒトETECプ
ラスミドと比較して，pEntYN10 プラス ミドは，サイズが大きいこと，ISの割合 が高いこと，プラスミドの安定性に関す る遺伝子が少ないこと，が分かった．
pEntYN10上の定着因子遺伝子
pEntYN10 は，推定定着因子として，
CS6, CS8(CFA/III)-like, K88(F4)-likeの3 遺伝子群を保有していた．
CS6の構造サブユニットの1つである CssAは，既知のものと比較して5つのア ミノ酸変異を持っていた．サブユニット CssBは既知のもと100% 一致した．
pEntYN10 の CS8-like は，以前に報告 されたCS8の配列との相同性は低かった が，CS8の主要構造サブユニットである CofA の ア ミ ノ 酸 配 列 を 比 較 す る と 73.2%の相同性を有していた．
YN10のK88(F4)-like遺伝子は，主要構 造サブユニットとされる，faeGが2つコ ードされていた．faeGの配列の系統発生 樹では，これらの2つのfaeGは，他の大 腸菌株よりも Salmonella Infantis のもの と近かった．
O159 IND株の定着因子の検討
アノテーションによりpEntYN10は，3 つの推定定着因子，CS6，CS8（CFA/III）
およびK88 (F4)-likeを保有することが分
かった．O159 INDのCS6も，pEntYN10 と同じ位置に5つのアミノ酸変異を持つ ことが当研究室の涌嶋によってすでに報 告されている(13)． そこで，pEntYN10 のCS8，K88(F4)-like上に設計されたプラ イマーを用いて，PCR を行ったところ，
O159 IND も pEntYN10 と同じ CS8-like
およびK88-like遺伝子を保有することが
示された．K88-like についてシーケンス を行った結果，pEntYN10 の K88-like と 99%一致していることがわかった．
ヒト由来のHEp-2に対する細胞接着性
実験室株 TOP10 にCS6 遺伝子を含む
領域を組み込んだpSV28CS6を導入して 形質転換した TOP10CS6 株も，CS8-like の 遺 伝 子 領 域 を 組 み 込 ん だ
pSV28CS8-like で 形 質 転 換 し た
TOP10CS8-like 株も，弱い分散接着像を
示すにとどまり，野生株のような接着性 は 見 ら れ な か っ た ． し か し な が ら ，
K88-like 遺伝子を含む領域を組み込んだ
pSV28K88-like で 形 質 転 換 さ れ た TOP10K88-like株はO169野生株と同様の 凝集接着像を示した．
ブタ由来のIPEC-1およびIPEC-J2に対す る細胞接着性
O169野生株は，HEp-2細胞に比べると
45 弱いものの，IPEC-1およびIPEC-J2細胞 に対しても凝集接着性を示したのに対し，
実 験 室 株 の TOP10， 病 原 プ ラ ス ミ ド pEntYN10が脱落したO169cured株，CS6 遺伝子で形質転換された TOP10CS6 株，
CS8-like 遺伝子領域で形質転換された
TOP10CS8-like 株，いずれも全く接着性
を示さなかった．しかしながら，K88-like 遺伝子で形質転換された TOP10K88-like 株は O169 野生株に類似した接着像を示 した．
ウシ由来のBIEに対する細胞接着性 O169野生株は，HEp-2細胞に比べると 弱いものの，BIE 細胞に対しても凝集接 着 性 を 示 し た ． 一 方 ，CS6 遺 伝 子 や
CS8-like の遺伝子領域で形質転換された
菌株は接着しなかったが，K88-like 遺伝 子 を 含 む 領 域 で 形 質 転 換 さ れ た TOP10K88-like株はO169野生株と同等の 凝集接着像を示した．
ヒト，ブタ，ウシ由来の腸粘膜上皮細胞 に対する接着性
光学顕微鏡観察だけではなく，接着し ている菌を回収し培養法で菌数を算定し た定量試験でも接着性が再確認された．
すなわち，O169野生株とK88-like遺伝子 を含む領域を組み込んだ pSV28K88-like で形質転換されたTOP10K88-like株は，
付着試験後のヒト由来HEp-2細胞，ブタ
由来 IPEC-1 細胞，ウシ由来BIE 細胞か
ら 107前後の菌が回収された．一方，病 原 プ ラ ス ミ ド pEntYN10 が 脱 落 し た O169cured株，実験室株のTOP10 ，CS6
遺伝子やCS8-likeの遺伝子領域で形質転
換された株は 1-2桁低い菌数にとどまっ た．
モノクローナル抗体の作製
ELISA法による抗体産生チェックによ
り，抗FaeG1として29個，抗FaeG2と
して25個の陽性サンプルが確認された．
TOP10K88-like を抗原としてこれらの凝
集反応試験を行ったところ，それぞれ 2 個ずつの陽性が確認された．これら４サ ンプルを限界希釈し，FaeG1で1クロー ン，FaeG2で2クローンのモノクローナ ル抗体産生細胞を得ることができた．
モノクローナル抗体の特異性
免疫電顕に用いてみたが，菌体間で金 コロイド数に有意な差は見られず，抗
K88-like 抗体が強く反応している様子は
見られなかった．
ウエスタンブロッティングに適用した ところ，抗K88-likeモノクローナル抗体 の３クローンはいずれも明瞭なバンドを 生じさせなかった．陽性対象として抗 CS6 抗体を 1 次抗体とした試験を行い
TOP10CS6 で有効なバンドを確認できた
ので，実験手技や定着因子の発現に問題 はなかった．
96 穴プレートを用いた凝集試験を試 みた．3 種のモノクローナル抗体いずれ
もがTOP10K88-likeを凝集したが，本来
陽性と期待される O169 では確認できな かった．ネガティブコントロールである
べき Top10 に対して陽性反応を示した．
今回作製したモノクローナル抗体はK88 様定着因子と特異的に反応するものでは ないことが明らかとなった．
D. 考 察
ETEC は宿主の腸粘膜への定着，すな わち上皮細胞への接着と局所での増殖，
を果たしながらエンテロトキシンを産生 して下痢症を引き起こす．ETEC はヒト のみならずブタやウシそしてニワトリの
46 下痢症原因ともなるが(22-24)，そのエン テロトキシンLTとSTの毒性は家畜とヒ トに共通のものが多い(25-28)．しかし，
腸粘膜への接着因子が異なるため，家畜 のETECは家畜の間で，ヒトのETECは ヒトの間だけで感染を循環させており相 互の行き来はないとされている(29)．し かしながら，先行して行われた「食品の 安全確保推進事業」において健康なブタ から比較的高率にETEC遺伝子陽性検体 が検出され(6)，このような家畜に由来す るETECがヒトの汚染源となる可能性を 検討する必要があった．
ETEC の宿主特異性や感染の成否に接 着因子は極めて重要な病原因子であるが，
Caco-2 細胞が使われるようになる前は，
in vitro での接着試験に有用な培養細胞
はなく(16)，赤血球凝集試験(30)や菌体疎 水性試験(31)などが接着性の指標として 使われていた．そのような時代にHEp-2 細胞に凝集接着するETECとして出現し たO169は異色の存在であった(10)．
今回の解析により，O169のプラスミド pEntYN10がCS6, CS8, K88(F4)-likeの3 種の定着因子候補遺伝子群を保有するこ とが明らかになった(32)． 既知のヒト腸 管定着因子である CS6 は，cssA および cssBの2つの構造タンパクから構成され ている．アミノ酸配列の違いにより，cssA はAI，AII, AIIIの3種に，cssBはBI, BII の 2 種に型別できる(33)．pEntYN10 の CS6のcssAはAIIタイプと似ているが5 つのアミノ酸変異を持つ新規サブタイプ であった．cssBはBIIタイプと100%一致 した． 本来，BIIは，in vitro試験で弱い 接着性を示すタイプと報告されており，
O169 の強い凝集接着性と合致しない．
CS6 領域を組み込んだ TOP10CS6 株が O169より弱い接着性を示したことから，
O169の特異な接着力は CS6 以外の定着
因子による．
CS8 (CFA/III) は，ETEC表面に線毛を 形作り，ヒトの腸細胞に特異的に付着す ると報告されている(34, 35)．CS8の主要 構 造 タ ン パ ク 質 で あ る CofA は ，V.
choleraeの主要線毛構成要素であるTcpA
と高い構造相同性を有している(36)．
pEntYN10 の CofA のアミノ酸配列は，
ETEC 260-1 株 の プ ラ ス ミ ド で あ る
pSH1134 がコードする CofA と 73.2%の
相同性を有していた．近年，TcpAタンパ ク質のうち，ある5つの残基が，線維状 の構造を構築するために高度に保存され て い る と い う 報 告 が あ り(36, 37)，
pEntYN10のCofAにもこれらの残基が保
存されていることが分かった．したがっ てCS8としての機能も保持されていると 考えられる．しかし，CS8 抗体を用いた ドットブロットテストでは陰性であった (10)．アミノ酸配列の違いから抗体が反 応しなかった可能性が考えられるが，電 子顕微鏡観察でもCS8様の線毛は観察さ れておらず(10)，O169はCS8を発現して いない可能性もある．
pEntYN10のK88-like 遺伝子群は，主 要線毛サブユニットをコードする faeG と相同性のある配列が2つ保有されてい た．faeG 配列の系統発生樹によると，2 つのfaeG遺伝子は，ブタから分離された 大腸菌のfaeGよりも，ヒトから分離され た Salmonella enterica serovar Infantis の faeGと近いことが分かった．ブタETEC の定着因子であるK88 (別名F4)は線毛を 形成するが，O169の電子顕微鏡観察では K88 様 の 線 毛 は 観 察 さ れ て お ら ず ，
pEntYN10 の K88-like が非線毛性の接着
因子としてヒトへの感染のために働いて いる可能性も考えられる．
O169 の特異な付着に関係する定着因 子を解明するため上記3つの遺伝子のク
47 ローニングを行い，組換え体を作製した．
その結果，K88-like を組み込んだプラス ミドで形質転換したTOP10K88-likeが凝 集接着性示し，in vitroにおけるO169の 特異な接着性が本遺伝子によることが明 らかになった．
O169は容易にプラスミドを落とす(10,
32)．pEntYN10 プラスミドのアノテーシ
ョンを行った結果，そのサイズの大きさ の割にプラスミドの維持に関係する遺伝 子は少なく，外部からの挿入配列が全体
の45.6%を占めていた． pEntYN10の属
する RepFII プラスミドは，一般的に
stbABおよび psiAB を保有しているが，
pEntYN10 からは stbAB オペロンが欠落
していた．hok/mok/sokシステムやsopAB のようなプラスミドの維持に関する遺伝 子もコードされていなかった． O169が 容易にプラスミドを落とす原因と考える．
しかしながら，pEntYN10 のように in vitro で は 脱 落 し や す い プ ラ ス ミ ド が O169に保たれていると言う事実は，本菌 が常に効率よく感染を繰り返し in vivo で保たれていることを示唆する．本プラ スミド上にコードされた3種の定着因子 遺伝子を使い分けることによって O169 が多様な宿主に感染する能力を得ている とすれば，脱落しやすいプラスミドが保 持され続けるのも理解できる．K88はも ともとブタETECの定着因子であり，ヒ トに感染するためのCS6やCS8などと宿 主に合わせた使い分けを O169 がしてい るとすれば，ETEC 感染症対策について 考えを改める必要も生じる．ヒト ETEC の汚染源が本当にヒトだけなのか，新し い視点で調べ直す必要がある．
そこで，K88-like 抗原を簡便に検出し たり，その菌体における局在や宿主細胞 との結合に重要なエピトープを決定した りする目的でモノクローナル抗体の作製
を試みた．しかしながら，免疫電顕でも ウェスタン・ブロッティングでも明瞭な 反応が出ず，凝集試験によって K88-like で組み替えた菌体のみならず TOP10 自 体とも反応していることが判明した．抗 原として作製した合成ペプチドと同様の
抗原を TOP10 が保有している可能性を
予想せず，合成ペプチドを用いたELISA
とTOP10K88-likeの凝集試験でクローン
の選別を進め，陰性対照としてTOP10を 凝集試験に置いていなかったことが失敗 の原因である．基本に立ち返り，再度挑 戦する予定である．
E. 結論
ETECの中でも検出頻度が高いO169に ついて，その特異な凝集接着性に寄与す る因子を探ったところ，既知のヒト腸管 定着因子であるCS6とは別に新規接着因 子を２つ保有していること，その一つで あるK88-like遺伝子がO169に特異な接着 性を付与していること，K88-like接着因 子はヒトのみならずブタやウシ由来の腸 粘膜上皮細胞に対しても強い接着性を有 すること，が明らかとなった．また、ETEC としてもう一つの主要な血清型である O159もO169と同じ3種の接着因子を保有 していた．ETECがこれらの接着因子を使 い分けることで複数の種類の宿主に感染 し人獣共通感染症を起こしている可能性 が考えられる．
F. 文 献
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鄭 冬 明 ，坂 瑛 里 香 ，大 森 裕 子 ， 中 臺 枝 里 子 ， 山 口 良 弘 ， 和 田 崇 之 ，工 藤 由 起 子 ，西 川 禎 一. 上 皮 細 胞 に 対 す る 腸 管 毒 素 原 性 大 腸 菌 Ｏ16 9：Ｈ4 1の 特 異 な 接 着 性 に 寄 与 す る 新 規 付 着 因 子 ， 日 本 栄 養 食 糧 学 会 第55回 近 畿 支 部 大 会 ， 平 成28年10月22日 帝 塚 山 学 院 大 学 p.52
鄭 冬 明 ， 坂 瑛 里 香 ， 大 森 裕 子 ， 中 臺 枝 里 子 ，和 田 崇 之 ， 工 藤 由 起 子 ， 西 川 禎 一 ． 腸 管 毒 素 原 性 大 腸 菌O169：H41の 特 異 な 細 胞 接 着 性 に 寄 与 す る 新 規 付 着 因 子 ， 第69回 日 本 細 菌 学 会 関 西 支 部 学 術 集 会 ， 平 成28年11月19日 大 阪 市 立 大 学 p. 45
柳 田 咲 ，玉 井 沙 也 加 ，能 重 匠 ， 谷 本 佳 彦 ， 松 崎 壮 宏 ， 中 臺 枝 里 子 ， 山 口 良 弘 ， 児 玉 年 央 ， 飯 田 哲 也 ， 西 川 禎 一 ． 上 皮 細 胞 か ら の サ イ ト カ イ ン 分 泌 に お け る 分 散 接 着 性 大 腸 菌 の 抑 制 効 果 ， 第90回 日 本 細 菌 学 会 総 会 ， 平 成 29年3月1 9 -21日 仙 台 国 際 セ ン タ ー WS4 -4 (P -216) 優 秀 発 表 賞 受 賞
鄭 冬 明 ，坂 瑛 里 香 ，大 森 裕 子 ， 池 崎 沙 耶 加 ， 中 臺 （ 鹿 毛 ） 枝 里 子 ， 和 田 崇 之 ， 工 藤 由 起 子 ， 西 川 禎 一 ． 上 皮 細 胞 に 対 す る 腸 管 毒 素 原 性 大 腸 菌O169 : H41の 特 異 な 接 着 性 に 寄 与 す る 新 規 付 着 因 子 ， 第71回 日 本 栄 養 ・ 食 糧 学
53 会 大 会 ， 平 成29年5月19 -21日 沖 縄 コ ン ベ ン シ ョ ン セ ン タ ー 2A -E52(p .243)
柳 田 咲 ，玉 井 沙 也 加 ，能 重 匠 ， 谷 本 佳 彦 ，松 崎 壮 宏 ，竹 内 成 美 ， 中 臺 枝 里 子 ， 山 口 良 弘 ， 児 玉 年 央 ， 飯 田 哲 也 ， 西 川 禎 一 ． 培 養 細 胞 か ら の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 分 泌 に 対 す る 分 散 接 着 性 大 腸 菌 の 抑 制 機 構 ， 第71回 日 本 栄 養 ・ 食 糧 学 会 大 会 ， 平 成29年5月 19 -2 1日 沖 縄 コ ン ベ ン シ ョ ン セ ン タ ー 2A -E 53(p. 244)
谷 本 佳 彦 ，竹 内 成 美 ，玉 井 沙 也 加 ， 柳 田 咲 ， 中 台 枝 里 子 ， 山 口 良 弘 ， 西 川 禎 一 ． 上 皮 細 胞 か ら の サ イ ト カ イ ン 分 泌 に 対 す る 分 散 接 着 性 大 腸 菌 の 抑 制 効 果 に 関 与 す る 因 子 の 探 索 ， 第38回 日 本 食 品 微 生 物 学 会 学 術 総 会 ， 平 成29 年10月5 -6日 あ わ ぎ ん ホ ー ル 1C02 (p .51)
谷 本 佳 彦 ，竹 内 成 美 ，玉 井 沙 也 加 ， 柳 田 咲 ，中 臺（ 鹿 毛 ）枝 里 子 ， 山 口 良 弘 ， 西 川 禎 一 ． 健 康 者 由 来 の 分 散 接 着 性 大 腸 菌 はV I型 分 泌 装 置 に よ っ て 上 皮 細 胞 か ら の IL -8分 泌 を 抑 制 す る ， 第70回 日 本 細 菌 学 会 関 西 支 部 学 術 集 会 ， 平 成29年11月25日 大 阪 府 立 大 学 I-si t eな ん ば 若 手-1 4
