微生物由来の細胞傷害性タンパク質パラスポリン4の作用機構解明
－大腸菌組み換え体からのパラスポリン4の精製方法－
奥村 史朗*1 齋藤 浩之*1 片山 秀樹*1 日下 芳友*1 井上 國世*2 水城 英一*1
Study on the Mode of Action of the Parasporin-4, a Cancer Cell-killing Protein Produced by Bacillus thuringiensis
- A Novel Method of Purification of Parasporin-4 from Inclusion Bodies by the Recombinant Escherichia coli -
Shiro Okumura, Hiroyuki Saitoh, Hideki Katayama, Yoshitomo Kusaka, Kuniyo Inouye and Eiichi Mizuki
Bacillus thuringiensis A1470株が産生するパラスポリン4(PS4) はCACO-2，Sawano，MOLT-4などのヒト培養ガ ン細胞に対して細胞破壊活性を示すが，ヒトT細胞などの正常細胞には作用を示さず，溶血活性も示さない1）こと から，ガン細胞特異的なトキシンとしてその応用が期待されている。PS4遺伝子を大腸菌に導入して培養すると，
PS4組み換え体を封入体として得ることが出来る2）。この封入体を可溶化・活性化後に陽イオン交換クロマトグラ フィとゲル濾過クロマトグラフィにより精製を行い，活性化直後のサンプルに対して比活性21倍の精製物を得るこ とができた。
1 はじめに
Bacillus thuringiensis （BT）は，胞子形成時に パラスポーラルインクルージョン（PI）と呼ばれる封 入体のタンパク質を産生し，このPIが特定の昆虫に対 して殺虫活性を示すことでよく知られている。BTはホ 乳類，鳥類，爬虫類などには病原性を示さず，このた めPIから得られた殺虫活性を持つタンパク質はしばし ば遺伝子組み換え作物に応用されている。近年殺虫活 性を持たないPIからガン細胞特異的に細胞傷害活性を 示すタンパク質が発見されパラスポリンと命名されて いる3）。PS4は4番目に発見されたパラスポリンである
4）。
PS4はBTのA1470株が産生するPIに含まれており，プ ロテアーゼ処理により活性化するとヒト白血病細胞由 来であるMOLT-4細胞に対して細胞障害活性を示す1）が，
溶血活性は示さない1）ことから，ガン細胞特異的なト キ シ ン と し て 期 待 さ れ て い る 。 PS4 遺 伝 子 をpET- 30a(+)に連結し大腸菌BL21(DE3)株に導入して培養し たところ，PS4組み換え体を封入体として得ることが 出来る2）。この封入体をBT由来タンパク質を調製する 際の定法に従い，炭酸ナトリウム緩衝液（pH10.5）で 可溶化後，proteinase K処理により活性化すると20μ
g/mL程度の低濃度溶液しか得られない2）。そこで，著 者らは封入体を10mM塩酸で可溶化し，ペプシンで活性 化することで，より高濃度の溶液が得られる調製方法 および精製方法を開発した5 ）。こうして得られたPS4 精製物はSDS PAGEによる分析において単一なバンドを 示したが，立体構造解明のために結晶化を試みたとこ ろアモルファスな凝集体を形成し，結晶体を得ること ができなかった。そこでより高精製なPS4を得るため に精製方法の改善を試みた。
2 研究，実験方法
2-1 組み換え体大腸菌の培養と封入体の精製
PS4遺伝子を導入した組み換え体大腸菌をカナマイ シン20μg/mLを含むLB培地200mLで120rpmで振とうし ながら37℃で一晩培養した。次に培養液を8,000×g, 15minで遠心して集菌し，菌体を－20℃で2時間以上凍 結 し て お い た 。 こ れ を 解 凍 し ， 10mLの 溶 解 液 （ 50mM Tris-HCl(pH8), 25% Sucrose, 1mM EDTA）を加えて分 散 さ せ ， 10mg/mLリ ゾ チ ー ム を 0.5mL入 れ て ， 室 温 で 30min イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 そ の 後 ， 超 音 波 破 砕 機
（Branson model 450D）を用いて強度3，50% dutyで 3min超 音 波 処 理 を 行 っ た 。 次 に 10mLの 界 面 活 性 剤 液
（ 0.2M NaCl, 1% デ オ キ シ コ ー ル 酸 ナ ト リ ウ ム , 1%
Nonidet P-40）を加えて，室温で30minインキュベー トし，30,000×g, 30minで遠心して封入体を回収した。
*1 生物食品研究所
*2 京都大学大学院農学研究科
これを洗浄液（1% TritonX-100, 1mM EDTA）で洗浄し，
続いて蒸留水で洗浄した。洗浄は各2回行った。
2-2 封入体からのPS4の可溶化・活性化・精製 2-2-1 封入体の可溶化とPS4の活性化
湿重量にして40mgの組み換え体の大腸菌によるPS4 封入体に10mLの10mM塩酸を加え，よく撹拌して37℃で 60minインキュベートして可溶化し，4,500×gで15min 遠心して上清を回収し，これを可溶化液とした。10mL の 可 溶 化 液 に 10mg/mL ペ プ シ ン を 200 μ L 加 え 37 ℃ で 90minインキュベートして活性化し，1mg/mLペプスタ チン を200μL加え て 氷冷 し 反応 を 停止 し た。 そ の後 4,500×gで15min遠心して上清を回収し，これを活性 化液とした。
2-2-2 陽イオン交換クロマトグラフィによる精製
活性化液を20mM Glycine, pH3.0で平衡化した1mLの Resouse Sカラム（GEヘルスケア）に通し，活性化し たPS4をカラムに結合した後，20mM Glycine, pH3.0, 3M NaClで数回洗浄し，不要なタンパク質をカラムか ら取り除いた。次にrunning bufferを20mM Glycine, pH10.0に変更し，溶出してくるPS4を回収した。一連 の操作は流速0.5μL/min, 4℃で行った。
2-2-3 ゲル濾過クロマトグラフィによる精製
SuperdexG-75担体（GEヘルスケア）を0.1M炭酸ナト リウム, pH10.0, 150mM NaClで平衡化し，XK16/70カ ラム（GEヘルスケア）に充填し，Resouse Sカラムに よ る 精 製 に よ り 回 収 し た サ ン プ ル 1mLを 投 入 し て ， 1mL/minで平衡化に用いたものと同じ緩衝液を流して サンプルを分子量により分画した。280nmの吸光度に より溶出してくるタンパク質濃度をモニターし，溶出 画分を回収してCACO-2細胞による細胞傷害活性を測定 した。
2-3 タンパク質の分析方法
2-3-1 CACO-2細胞に対する傷害活性の測定
CACO-2細胞をMEM培地に20%FBSを加えた培地を用い て37℃で5%二酸化炭素存在下で培養し，2.2×105細胞 /mLの濃度で96ウェルマルチウェルプレートに90μLず つ分注した。この96ウェルマルチウェルプレート中で 細胞をさらに24時間培養し，試験に用いた。細胞傷害 活性については各ウェル中のCACO-2細胞に，サンプル 10μLを加え20時間後に細胞を顕微鏡により観察して 調べた。半数影響濃度（EC50）は各ウエル中に2倍ず つ段階希釈でサンプル10μLを投入し20時間後の細胞
生 存 率 を 市 販 の MTT 試 薬 （ CellTiter96 AQueous One Solution Reagent [プロメガ製]）を用いてMTT法によ り測定し，「タンパク質濃度－細胞生存率曲線」から プロビット法により算出した。
2-2-2 その他の測定
タンパク質濃度はウシ血清アルブミンを標準として BCA法6）でおこなった。SDS-PAGEはLaemmliの方法7）に より10-20%のグラジエントゲルを用いて行い，銀染色 法により染色を行った。
3 結果と考察
図1にSuperdexG-75カラムによるゲル濾過クロマト グラフィの結果を示した。このゲル濾過クロマトグラ フィにおいては主に3つのピークが得られた。それぞ れのピークについてCACO-2細胞に対する細胞傷害活性 を検討したところ，2番目のピークは強い細胞傷害活 性を示したが，1番目と3番目のピークについては活性 が全く認められなかった。2番目のピークは，通常こ のカラムにおいて約30kDaのタンパク質が溶出する位 置であり，活性化PS4の分子量が約27kDaであることか ら，これが精製PS4であると考えられた。1番目のピー クは溶出位置から分子量は80kDa以上と推定され，ま た，260nmと280nmの吸光度比がタンパク質と異なって いることから，培養によって生じたなんらかの有機物 と推定された。3番目のピークは溶出位置から分子量 3kDa以下と推定され，ペプシン処理によって生じたペ プチド断片の可能性が高いと考えられた。
図1 ゲル濾過クロマトグラフィによるPS4の精製
図2に各精製過程におけるサンプルのSDS PAGEによ る分析結果を示した。可溶化液で見られる約30kDaの バンドはPS4の前駆体で，そのほかのサンプルで見ら れる約27kDaのバンドは活性化PS4である。各レーンに は総量として300ngのタンパク質を流した。精製過程
が進むにつれて活性化PS4のバンドが太くなっており，
サンプル中に含まれる活性化PS4の割合が増加してい ることがわかる。活性化PS4のバンド以外に目立った バンドが存在しないという点では活性化液の精製度が 高いように見えるが，これはペプシン処理により生じ た低分子のペプチド断片が多く含まれ，これらのペプ チドが銀染色で染色されないためと考えられた。
4 まとめ
PS4の遺伝子を導入した組み換え体大腸菌からPS4を 可溶化，活性化，精製する新規な方法を示した。本精 製方法により，従来法に比較して5.3倍比活性の高い PS4を得ることができるようになった。今後この高精 製PS4を用いて，PS4の立体構造の解明や培養ガン細胞 における受容体の解明などを試みていき，PS4のガン 診断・治療への応用につなげていきたい。
5 参考文献
1)S.Okumura,H.Saitoh,T.Ishikawa,E.Mizuki,K.
Inouye:Biotechnol.Annu.Rev.,Vol.14,pp.225-252 (2008)
2)S.Okumura,H.Saitoh,T.Ishikawa,N.Wasano,S.
Yamashita,K.Kusumoto,T.Akao,E.Mizuki,M.Ohba, K.Inouye:J.Agric.Food Chem.,Vol.53,pp.6313- 6318 (2005)
3)E.Mizuki,Y.S.Park,H.Saitoh,S.Yamashita,T.Akao, K.Higuchi,M.Ohba:Clin.Diagn.Lab.Immunol.,Vol.
7,pp.625-634 (2000)
図2 SDS PAGEによるPS4精製過程の分析 4 ) K . I n o y e , S . O k u m u r a , E . M i z u k i : F o o d S c i . B i o - std:分子量マーカー，1:可溶化液，2:活性化液，3:陽
イオン交換クロマトグラフィによる精製物，4:ゲル濾 過クロマトグラフィによる精製物。stdを除いて各レ ーンに300ngのタンパク質を投入した。
technol.,Vol.17,pp.219-227 (2008)
5)S.Okumura,H.Saitoh,N.Wasano,H.Katayama, K.
Higuchi,E.Mizuki,K.Inouye:Protein Expr. Purif., Vol.47,pp.144-51 (2006)
6)P.K.Smith,R.I.Krohn,G.T.Hermanson,A.K.Mallia, F.H.Gartner,M.D.Provenzano,E.K.Fujimoto, N.M.
表1 PS4の精製過程
Goeke,B.J.Olson,D.C.Klenk:Anal.Biochem.,Vol.
150,pp.76-85 (1985)
7)U.K.Laemmli:Nature,227,pp.680-685 (1970)
表1に精製過程におけるタンパク濃度，CACO-2細胞 に対する細胞傷害活性のEC50，細胞傷害活性の比活性 を示した。最終的にはゲル濾過クロマトグラフィによ り活性化液より21倍高い比活性を得ることができた。
これは以前の方法による3.9倍5）と比較して5.3倍高い 値であり，この新規精製方法によりPS4の精製度を大 きくあげることができたことを示している。
