【Webinar18】はじめようmicroRNA解析_

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1

The world leader in serving science

はじめよう

microRNA

解析

効率的な精製方法と

機能解析手法の最新技術を学ぼう

2014年11月21日（金）ライフテクノロジーズジャパン株式会社サーモフィッシャーサイエンティフィックグループ

(2)

本日の内容

•microRNA

の基礎

•microRNA

の発現解析と機能解析

• さまざまなサンプルからの

RNA

抽出

• RNA

シーケンスによる

microRNA

の探索

• リアルタイム

PCR

による

microRNA

の発現解析

(3)

3 18～25塩基のRNA分子で、植物、動物に認められる特異的で普遍的な転写後の調節因子であり、相補的な配列を持つmRNA に結合して翻訳抑制による遺伝子の発現抑制をおこなう真核生物で広く保存されており、進化的に保存された生命活動の維持に必須な遺伝子発現機構であると考えられるヒトのゲノムには約2000種類のmiRNAがコードされており、約50%の遺伝子がmiRNA による発現調節を受けていると推測される

多くの場合、一つのmiRNA は複数のmRNAの発現調節を行っており、またmRNAの多

くは複数のmiRNAによる発現調節を受ける

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分化・発生

Timing Lee et al. 1993 Cell proliferation Brennecke et al. 2003 Neuron Hatfield et al., 2005

細胞死

Baehrecke 2003 Chen et al. 2006

疾病・疾患

Cancers Calin et al. 2002; 2004 Lu et al. 2005 Voorhoeve et al. 2006 Diabetes Poy et al. 2004 エピジェネティクスエピジェネティクスエピジェネティクスエピジェネティクスエピジェネティクスエピジェネティクスエピジェネティクスエピジェネティクス Bao et al. 2004 Henderson et al. 2006

miRNA

が細胞・生体におよぼす影響

(5)

5

*

成熟miRNA（遺伝子発現調節活性を持つ配列） • プライマリーmiRNA（Pri-miRNA）は核内で転写後、プロセシングを受けて、ヘアピン構造のmiRNA 前駆体（Pre-miRNA）となる • Pre-miRNA は細胞質へ輸送され、 RNA分解酵素 Dicer によるプロセシングを受けて二本鎖のRNA となる • タンパク質の複合体（RISC）に取り込まれたmiRNA は相補的な配列を持つmRNA に結合してタンパク質の発現を抑制する – 成熟miRNA が RISC複合体に取り込まれる – microRNA とmRNA の相同性により結合して、翻訳抑制もしくはmRNA の分解を行う

*

細胞内での

miRNA

合成経路

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• miRNAのののの機能解析機能解析機能解析機能解析 • miRNA mimic ＆＆＆＆ inhibitor ライブラリーによるライブラリーによるライブラリーによるライブラリーによるスクリーニングスクリーニングスクリーニングスクリーニング • miRNA の発現の発現の発現の発現解析＆プロファ解析＆プロファ解析＆プロファ解析＆プロファイリングイリングイリングイリング • 抽出＆抽出＆抽出＆抽出＆シーケンスシーケンスシーケンスシーケンス（探索）（探索）（探索）（探索）どのようなどのようなどのようなどのような miRNAがががが発現している発現している発現している発現している ? いつ、どこでいつ、どこでいつ、どこでいつ、どこで miRNAがががが発現してい発現してい発現してい発現しているるるる? どの遺伝子がどの遺伝子がどの遺伝子がどの遺伝子が miRNAによりによりによりにより発現調節され発現調節され発現調節され発現調節されているているているている? どのようなどのようなどのようなどのような細胞内細胞内細胞内細胞内プロセプロセプロセプロセスがスがスがスがmiRNA による制御をによる制御をによる制御をによる制御を受けている受けている受けている受けている?

miRNA

研究

研究の課題

研究

の課題

1

2

3

4

(7)

7

• miRNA

の抽出はあらゆる

miRNA

解析において重要な第一段階

• 正確な

miRNA

の解析には解析手法やサンプルの種類に適した

miRNA

抽出

技術が必要となる

サンプルの種類エキソソエキソソエキソソエキソソームームームーム組織細胞血液 FFPE Samples LCM

RecoverAll™for Total Nucleic

Acid Isolation Kit for FFPE mirVana™ Kits

LeukoLOCK Total RNA Isolation System RNAqueous-Micro + LCM

Staining Kits (2 separate kits)

TaqMan® miRNA ABC Purification Kit

miRNA

の

の抽出

の

抽出

Total Exosome Isolation Reagents

Cells-to-CT™ Kits

MagMAX™FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit

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miRNAを含むを含むを含むを含む

small RNAのピークのピークのピークのピーク

Actin beta mRNA GAPDH mRNA U1 snRNA 5.8S rRNA 5S rRNA Let-7 miR-16 G FF カラム（ m R N A ） m ir V a n a ™ m iR N A Iso la tio n K it

抽出手法によっては

small RNA

が消失

高収量・高純度の

small RNA

抽出の重要性

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9

mirVana™ miRNA Isolation kit

• 組織(0.5～250mg)・細胞(102～107 cells)から簡便に

small RNAを含むTotal RNAを抽出可能

• miRNA、siRNA および10塩基以上のRNA分子の抽出

• オプションで200塩基以下のRNAの濃縮が可能

組織・細胞からの

miRNA

の

の抽出

抽出

Total RNA Small RNA(~200nt)

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80μm以下のFFPE切片をキシレンで脱パラフィンし、洗浄する脱脱脱脱パラフィンパラフィンパラフィン：パラフィン：：：20分分分分プロテアーゼプロテアーゼプロテアーゼプロテアーゼ消化消化消化：消化：：：3時間時間時間時間/ 48時間時間時間時間 3時間（RNA）もしくは48時間（DNA）50℃でプロテアーゼとインキュベーション ↓ 70℃・20分間核酸分離核酸分離核酸分離核酸分離：：：：10分分分分フィルターカートリッジに核酸を吸着させるヌクレアーゼヌクレアーゼヌクレアーゼヌクレアーゼ消化消化消化と消化ととと核酸精製核酸精製：核酸精製核酸精製：：：45分分分分フィルターカートリッジにDnase もしくはRnaseを加えて混合し、（30分インキュベート）、洗浄後、核酸を溶出。（2 X 30μL）

FFPE切片および凍結サンプルよりTotal RNAを抽出し、 TaqMan MicroRNA Assayを用いて、5S、U6、 has-miR-372、has-miR373を測定

FFPE

サンプルからの

miRNA

の抽

の抽出

出

RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit

• 20µmの切片4つあるいは35mgまでのサンプルを処理

• FFPEサンプルからmicroRNAを含むTotal RNAおよ

びDNAを抽出

FFPE = Formalin Fixed Paraffin Embedded

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11

from: The Scientist, July 2011

from: The Scientist, July 2011

・RNAやタンパク質を運ぶ微小胞・すべての細胞から分泌される・様々な体液中に認められる - 血液, 尿, 唾液, 母乳, CSF - 1 µL あたり数百万個・多くの重要な働きを持つ - 細胞間コミュニケーション - 細胞内老廃物の廃棄

エキソソームからの

miRNA

抽出

Total Exosome Isolation Reagents

• インタクトなエキソソームの収量が最大 • 時間のかかる超遠心が不要で、シンプルなプロトコルにより簡単にエキソソームを回収 • サンプル量によってスケールアップ/スケールダウンが可能 • 様々なサンプル専用の試薬及びプロトコールを用意 (培養上清、血清、血漿、尿など）エキソソームとは？エキソソームとは？エキソソームとは？エキソソームとは？

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• RNA

シーケンスは最も精度の高い

miRNA

解析手法であり、新規

miRNA

の

探索を可能にする

• 新規な

miRNA

の数は次世代シーケンス

が広まってから飛躍的に増えている

• Isoform

の正確な検出が可能

0 5000 10000 15000 1 .1 ₁.3 ₁.5 ₂.1 3 4 ₅.1 7 8 ₈.2 ₉.1 1 0 .1 ₁2 ₁4 ₁6 ₁8 N u m b e r o f E n tr ie s miRBase Version Sanger miRBase 登録数の増加登録数の増加登録数の増加登録数の増加

Distribution Run time Throughput

NGS 非常に高い導入およびランニングコスト約2週間 miRNA 解析には必要以上のスループット Ion Torrent (PGM™) 導入容易なランニングコスト約2時間 3種類のsmall RNA サンプル (Ion 318™ Chip)

RNA

シーケンスによる

miRNA

の探索

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13

高感度

配列

の識別能

ダイナミックレンジ

相関性

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Ion Total RNA-Seq Kit v2

• small RNA と whole transcriptome ライブラリを構築可能

• 発現ストランドの方向性維持を可能にするユニークな原理

• input RNA

• 1 ng enriched miRNA

• 1 ng poly(A) RNA or 25ng rRNA-depleted RNA

• ライブライ作製にかかる時間は5-6時間 • ゲルによるサイズセレクト不要 • バーコード対応（1-16）アダプターアダプターアダプターアダプターのライゲーのライゲーのライゲーのライゲーションションションション逆転写反応逆転写反応逆転写反応逆転写反応増幅増幅増幅増幅

ライブラリー作製

トランスクリプトームライブラリーの作製

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15 TaqMan® MicroRNA Assays TaqMan® Pri-miRNA Assays

Pri-miRNA, miRNA,

全

Non-coding RNA

の発現解析

TaqMan® Assays

• 様々なRNAの信頼性の高い発現解析を可能にする • 高感度、高い特異性、広いダイナミックレンジそして品質の高いデータの提供が可能 • 直ぐに使用可能 • デザイン済み • 全てのアッセイが同一条件でワーク

• Pri-miRNA、miRNA および

non-coding RNA をそれぞれ特異的に検出

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Mature miRNA (21nt)

Step1

：

：逆転写

逆転写

miRNA特異的RTプライマーを

用いた逆転写反応

・miRNA Specific RT primer

F

Q

Step2

：

：リアルタイム

リアルタイム

PCR

・miRNA Specific forward primer ・reverse primer

・miRNA Specific TaqMan probe

① ① ①

①miRNA Specific Looped RT primer

② ② ②

②miRNA Specific forward primer

③ ③ ③

③miRNA Specific TaqMan®probe

reverse primer

(17)

17

Expression Suite

TaqMan® MicroRNA Assay

のワークフロー

miRNAのののの抽出抽出抽出抽出逆転写反応逆転写反応逆転写反応逆転写反応データ解析データ解析データ解析データ解析リアルタイムリアルタイムリアルタイムリアルタイム PCR反応反応反応反応試薬調製試薬調製試薬調製試薬調製

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18 SYBR Greenを用いたmiRNAのRT-qPCR

リアルタイム

PCR

による

miRNA

発現解析システムの比較

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19 成熟miRNAのアンチセンスオリゴであり、miRNAに結合して miRNAの働きを抑制する細胞へトランスフェクションされると、目的の成熟miRNAがmiRNAパスウェーに入り、ターゲット遺伝子の発現調節を行う

mirVana™ miRNA inhibitors

mirVana™ miRNA mimic

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TaqMan® assayによるスクリーニングによるスクリーニングによるスクリーニングによるスクリーニング & miRNA Mimics/Inhibitorsによるバリデーションによるバリデーションによるバリデーションによるバリデーション

例：mirVana mimic 例：mirVana inhibitor

正常細胞疾病細胞 miRNA TaqMan®による発現プロファイリング結果結果結果結果：疾病細胞でmiRNAの発現量低下発現量低下発現量低下発現量低下疾病細胞へmirVana Mimicをトランスフェクションして表現系が正常に戻るか確認 miRNA TaqMan® による発現プロファイリング機能解析

miRNA

の機能解析のプロセス

正常細胞疾病細胞結果結果結果結果：疾病細胞でmiRNAの発現量増加発現量増加発現量増加発現量増加疾病細胞へmirVana inhibitorをトランスフェクションして表現系が正常に戻るか確認

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21

pMR-REPORTTM

miRNA binding site

Luciferase

miRNA

の結合領域の解析

pMIR-REPORT™ miRNA Expression Reporter Vector System

• miRNAの結合領域（配列）解析のためのレポーターベクター

• レポーター遺伝子の下流にmiRNA結合領域を組み込む

• mirVana miRNA mimic/ inhibitorをコトランスフェクションレポーターベクター

レポーターベクターレポーターベクター

レポーターベクター + mirVana miRNA mimic → レポーター遺伝子の発現抑制レポーター遺伝子の発現抑制レポーター遺伝子の発現抑制レポーター遺伝子の発現抑制レポーターベクター

レポーターベクターレポーターベクター

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Star (Passenger) strand

Mature miRNA (Guide) strand

miRNA

Luc

miRNA Target Luc _{Reverse Target}

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 miRNA mimic 1 miRNA mimic 2 miRNA mimic 3 miRNA mimic 4 miRNA mimic 5 miRNA mimic 6 Neg F o ld C h a n g e 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 miRNA mimic 1 miRNA mimic 2 miRNA mimic 3 miRNA mimic 4 miRNA mimic 5 miRNA mimic 6 Neg F o ld C h a n g e

mirVana™ miRNA mimic

mirVana™ miRNA mimicのmature strandは特異的に機能し、

(23)

23

mirVana™ miRNA mimic

の機能確認

レポーターアッセイ

(24)

レポーターアッセイ

(25)

25

miRNA

プロファイリングとターゲット遺伝子（

mRNA

）推測

miRNA Predicted Gene Target

miR-143 breakpoint cluster region (BCR)

miR-143 MCF.2 derived transforming sequence (MCF2) miR-143 von Hippel-Lindau tumor suppressor (VHL) miR-143 v-Ki-ras2 sarcoma oncogene (KRAS2) miR-143 v-Ki-ras2 sarcoma oncogene (KRAS2)

miR-143 Cas-Br-M retroviral transforming sequence (CBL) miR-143 Cas-Br-M retroviral transforming sequence (CBL) miR-145 Cas-Br-M retroviral transforming sequence (CBL) let-7 nRAS, kRAS, nRAS (multiple binding sites)

let-7 MYC (multiple binding sites)

TaqMan microRNA Arrayを用いたプロファイリングにより肺がん組織で

Let-7の発現量の低下を確認

データベース検索によりLet-7がターゲットとする

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肺がん組織での

Let-7

と

RAS

の発現レベルの相関性の確認

・肺がん組織では著しいLet-7 の発現量の低下とRAS タンパク質の発現量増加を確認・Let-7 の発現量とRas タンパク質量の高い相関関係を確認

・RAS mRNA 発現量とRAS タンパク質量との相関関係は低い

(27)

27

Gain-of-Function

: mirVana miRNA mimic →

タンパク質減少

Loss-of-Function

：

mirVana miRNA inhibitor →

タンパク質増加

48-72

時間培養

Let-7

が

RAS, MYC

の発現抑制効果を示すか確認

mirVana miRNA mimic (let-7)および

mirVana miRNA inhibitor (let-7)の細胞への導入

(28)

Negative Control miRNA mimic (let-7) MYC 抗体 RAS 抗体 let-7分子の導入ターゲットmRNAからの翻訳が阻害され、RAS, MYCタンパク質の発現が抑制される。 HepG2細胞は内在性let-7が低発現なのでターゲットmRNAからの翻訳が抑制されず、RAS, MYCタンパク質の発現が見られる。

HepG2細胞へのmiRNA mimic (let-7)の導入 (HepG2細胞では let-7が低発現)

miRNA mimic (let-7)の導入によりRAS、MYCの発現量低下

(29)

29 let-7 inhibitorsの導入

Negative Control miRNA inhibitor (let-7)

MYC 抗体 RAS 抗体 HeLa細胞は内在性let-7が高発現なのでターゲットmRNAからの翻訳が抑制され、RAS, MYCタンパク質の発現が抑えられる。内在性のlet-7が阻害され、ターゲットmRNAからの翻訳が促進、 RAS, MYCタンパク質の発現が増加する。

HeLa細胞へのmiRNA inhibitor (let-7)の導入 (HeLa細胞では let-7が高発現)

miRNA inhibitor (let-7)の導入によりRAS、MYCの発現量増加

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肺がんにおける

miRNA Let-7

の関与モデル

Let-7

の発現

の減少

RAS

、

MYC

の

発現の誘導

細胞の異常な

増殖の誘導

癌化

Let-7

によるがん遺伝子（

RAS

、

MYC

）の発現制御ができなくなり、

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31

• Taqman® MicroRNA Assays • miRNA Mimics &

Inhibitors • Transfection reagents • Reporter Assays • Ion PGM™ Sequencer

• Ion RNA-seq kits • mirVana™ miRNA Isolation kits • RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit