神経血管ユニットの構造的および機能的可塑性に関する生体光イメージング

全文

(1)● シンポジウム 5 新しい脳循環代謝機能イメージング脳画像の進歩. 神経血管ユニットの構造的および機能的可塑性に関する生体光イメージング正本和人1, 2＊，菅野巖2. 要旨神経血管ユニットに関する光イメージングを用いた基礎研究は，二光子顕微鏡法と多様な蛍光タンパクの登場により飛躍的に進展している．本稿では，マウス脳内の微細構造を in vivo で可視化し，画像データを定量的に解析また視覚化するための手法について報告する．二光子顕微鏡法で撮像した脳微小血管に関するマルチスライス画像からは血管の長さ・径を算出し，ネットワーク構造を 3 次元空間に再構成した．一方，神経・グリア細胞に関しては蛍光標識を施し，画像上で細胞の位置情報と共に形態を評価した．さらに形態画像に加えてダイナミック撮像を組み合わせることで，血流やカルシウム応答などの機能情報を同時に取得することが可能である．今後は，各種の細胞環境の画像化や遺伝子・タンパク発現を画像化することで，神経血管連関におけるシグナル機構や細胞環境を介した神経作用について明らかにするために有用なツールに発展すると期待される．（脳循環代謝 26：99∼105，2015）. キーワード : 二光子顕微鏡法，Seylaz-Tomita 法，蛍光タンパク，低酸素，神経血管ユニット. 顕微鏡法であり，励起光に生体透過性が高い近赤外光. はじめに. が用いられている点に特長がある1~3）．通常の蛍光顕微鏡法では，蛍光波長よりも短い紫外・可視領域の光が. 光を用いた生体イメージング技術は，時間応答性に. 励起光に用いられるのに対し，二光子顕微鏡法では近. 優れ，細胞から個体レベルに至る幅広いレンジの空間. 赤外光が励起光に用いられるため，組織のやや深部ま. 分解能を有するという特徴がある．また物質固有の吸. で励起光が到達し厚みのある立体構造の観察が可能で. 収スペクトルに着目することで多因子の解析や，光の. ある．マウス大脳では，脳表から深さ 1.6 mm まで観. もつスペクトルの分別性を利用した複数細胞の同時標. 察が可能である4）．さらに，より深部の観察を目的と. 識観察などが可能である．神経血管ユニットに関する. した三光子顕微鏡法も開発されている5）．本稿では，. 光イメージングでは，二光子レーザー走査蛍光顕微鏡. 二光子顕微鏡法を用いた神経血管ユニットにおける形. 法（two-photon laser scanning fluorescence microscopy;. 態・機能の可塑性を調べるための in vivo イメージング. 1）. 以下，二光子顕微鏡法）による小動物の in vivo イメー. と画像解析の手法について報告する．. ジングが広く普及している．二光子顕微鏡法は，非線. 1．Structure/morphology imaging with two-photon microscopy. 形光学の一つである二光子吸収の原理を応用した蛍光国立大学法人電気通信大学脳科学ライフサポート研究センター 2 独立行政法人放射線医学総合研究所分子イメージング研究センター＊〒 182-8585 東京都調布市調布ヶ丘 1-5-1 電気通信大学脳科学ライフサポート研究センター TEL: 042-443-5930 FAX: 042-443-5930 E-mail: masamoto@mce.uec.ac.jp 1. 二光子顕微鏡下で脳血管は，血中滞留性が良い水溶性の蛍光薬剤を静脈投与することで画像化される6）．我々は，生体アストロサイトの蛍光マーカーであるスルホローダミン 101（SR101）を実験動物の腹腔に投与することで，同一個体での脳微小血管の反復イメージ ─ 99 ─.

(2) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. A. Length 1. Thinning. 2. Segmentation. 3. Quantification of cap. length. length (μm) 200 150 100 50 0. B. Diameter 1. Reconstruction. 2. Quantification of cap. diameter. diameter (μm) 12. 6. 0 図 1．二光子顕微鏡で撮像した脳微小血管画像の形態評価 A：血管長の計測．1．血管画像を細線化し血管の中心線を取得．2．血管の分岐点を同定し，両端に分岐をもつ血管を 1 本として領域分割．3．各毛細血管（cap.）の中心線の長さを計測し，長さに対応したカラーマップで血管の長さを視覚化． B：血管径の計測．1．二光子顕微鏡で撮像した元画像．2．各毛細血管の中心線に沿って血管の径を計測し，血管径に対応したカラーマップで血管径を表示．. ングが可能であることを報告した7）．長期に及ぶ慢性. 動脈の拡張10, 11）など脳血管のリモデリングに関する時. 実験では，実験動物の頭蓋をガラスで置換した閉鎖頭. 系列動態が明らかになりつつある．また著者らは，低. 窓法（closed cranial window）の施行が必要である．. 酸素曝露 2∼3 週間において脳実質毛細血管より血管. Tomita らは Seylaz-Tomita 法を確立し，in vivo におけ. が新生し，脳内に新しい毛細血管ネットワークが形成. る脳虚血後のマウス大脳血管のリモデリングについて. されることなどを明らかにしてきた12）．. 明らかにした8）．さらに，Seylaz-Tomita 法によって，. しかし，これらの報告では二光子顕微鏡法で撮像し. 慢性的な低酸素曝露による脳実質毛細血管の拡張9），. た脳血管の一部分しか評価されていない．脳表動脈か. および慢性低灌流における脳実質毛細血管および脳表. ら脳実質に至る脳微小血管ネットワーク全体を定量的. ─ 100 ─.

(3) 神経血管ユニットの可塑性に関する生体光イメージング. soma processes. Soma volume [μm3]. pixel. soma volume number of processes. 2000. 40. 1500. 30. 1000. 20. 500. 10. 0. 5 µm. pixel. 50. 100. pixel. 200. 300. Number of process. 2500. 3D reconstruction and quantification of glial cell structures. 0. Depth from cortical surface [μm]. 図 2．二光子顕微鏡で撮像したグリア画像の形態評価 SR101 で蛍光標識したグリアの二光子顕微鏡によるスライス画像（左）を 3 次元空間に画像再構成し，細胞体（soma，青）と突起（process，赤）の領域に分割した（中央）．それぞれ，細胞体の体積（青）と突起の本数（赤）について計測し，大脳皮質表面からの深さ（0–350 μm）ごとに比較した．エラーバーは標準偏差を示す（各深さにおいて 11–27 個のアストロサイトを計測）．. に扱うためには，膨大な画像データを取得し解析処理. で，脳表からの深さや血管からの距離など細胞の 3 次. する必要がある．そこで，二光子顕微鏡法で得られた. 元空間上の配置に基いた解析法の開発に取り組んでい. 血管形態のマルチスライス画像から血管の分岐点を自. る．. 動で検出し，各血管の長さと径を算出するためのソフ. 2．Vascular/cellular function imaging with two-photon microscopy. トウエアを作成した（図 1）．これらの形態情報は大脳皮質の深さや動脈からの距離に応じて分類することが可能である．また数値パラメータをカラー表示することで血管ネットワークの 3 次元的な構造様式を視覚的. 脳血管の拡張・収縮に関する機能的計測法に関して. にとらえることが可能である（図 1）．今後は脳微小血. は，脳表および脳実質血管を時間方向の連続画像とし. 管の形態パラメータの変化を長期にわたって評価する. て撮像し，血管径の時系列変化を数値化する手法を確. ことで，脳血管の成長・老化や運動・学習による形態. 立した19）．本手法を用いることで，マイネルト基底核. 的な可塑性，あるいは脳虚血や神経変性における病態. への刺激に対する大脳の血管反応は，脳表動脈よりも. の進行や発症との関わりに関して，脳微小血管の構造. 脳実質細動脈の拡張が支配的であることや，体性感覚. 変化の観点から明らかにされることが期待される．. 刺激に対しては脳表動脈および脳実質細動脈の双方が. 一方，神経・グリア細胞の形態評価に関しては，細. 神経活動から 1 秒以内の瞬時に拡張することなどを明. 胞を標識するための染色手法に大きく依存する．. らかにした20, 21）．後者の感覚刺激に対する血管反応で. SR101 は，アストロサイトの蛍光マーカーとして広く. は脳実質細動脈に続いて脳表動脈が拡張する22）ことか. 利用されている13~17）．しかし，アストロサイトの細か. ら，Itoh ら23）は脳微小血管の機能的拡張に関して. 13）. いプロセスの全てを観察するのには適していない．ま. “proximal integration signaling model”を提唱している．. た，SR101 によってオリゴデンドロサイトも染色され. しかし，最近の研究によって“proximal integration. るため，SR101 陽性細胞の鑑別に関して注意が必要. signaling model”では説明できない現象があることが明. である．神経細胞に関しては，脳を傷害することなく. らかになった．慢性的な低酸素曝露に対する機能的な. in vivo で蛍光標識することは非常に困難である．そこ. 可塑性として，賦活脳血流の増加が低酸素曝露の期間. で，遺伝子工学の技術を用いた蛍光タンパクの導入に. に応じて低下することを報告した24）．またこのとき炭. よる細胞の標識法が有効な手段として用いられてい. 酸ガスに対する脳血管反応および脳賦活に対する神経. る．我々は，これら蛍光標識を施した神経・グリア細. 反応に関しては，低酸素曝露前との相違が認められな. 胞を in vivo で画像化し，細胞形態に関する特徴量とし. い24）ことから，低酸素によって脳血管の反応性や神経. て，細胞体積やプロセスの本数について評価した（図. 機能自体が低下するわけではないことが示唆されてい. 2）．さらに，細胞の位置情報を画像から取得すること. る．さらに二光子顕微鏡法による脳血管反応の直接計. 18）. ─ 101 ─.

(4) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. 測によって，慢性低酸素において感覚刺激に対する脳. をリアルタイムで画像化するための手法や，より生体. 表動脈の拡張性は維持されるにもかかわらず，脳実質. 親和性の高い蛍光プローブの開発が望まれる．このよ. 細動脈の反応性が有意に低下することを明らかにし. うに細胞間での物質輸送や細胞環境，および細胞内の. た21）．また低酸素への適応後は，感覚刺激に対して脳. 機能発現をリアルタイムに画像化することで，in vivo. 実質細動脈よりも脳表動脈が時間的に先に拡張を示. 光イメージング技術は神経血管ユニットにおける脳血. す21）．これらの脳表動脈と脳実質細動脈との血管反応. 流の調節機序の解明と神経血管ユニットの破綻に起因. の相違に関しては，“proximal integration signaling. した神経変性疾患の発症および病態の治療・予防法の. model”では説明ができない．したがって脳表および脳. 開発に大きく貢献するものと考える．. 実質血管への作用点の違いを考慮した脳血管の調節に. おわりに. 関するシグナル経路についてさらに検討する必要がある．脳血流の蛍光イメージング法に関しては，脳血管の. 二光子顕微鏡法を用いた神経血管ユニットの形態・. 走行方向にレーザーを繰り返し走査することで走査ラ. 機能の可塑性を解析するための in vivo イメージングと. イン上の赤血球の動きを画像化し，血流速度を計測す. 画像解析の手法について概説した．神経血管ユニット. る line scanning particle image velocimetry が広く用いら. の形態イメージングに関しては，神経・グリア・血管. れている. ．しかし，この手法では 1 度の計測で 1. に関するマルチスライス画像をもとに，脳血管ネット. 本の血管の血流速度しか計測ができない．毎秒 500 フ. ワークの構造と細胞形態とを同時に直感的に捉えるた. レーム程度の撮像が可能な高速カメラを用いれば，蛍. めの視覚化技術の開発がさらに必要である．一方，細. 光標識を施した血球細胞の個々の動きを追跡し複数血. 胞機能のイメージングに関しては，細胞内カルシウム. 管の血流速度の計測が可能である31~33）．しかし，通常. イオン濃度や膜電位を画像化する手法42~45）が標準とな. の二光子顕微鏡法では毎秒 100 フレーム程度の撮像が. りつつある．しかし，顕微鏡下で脳微小血管における. 限界である．そこで，比較的遅い撮像レートでも血流. 血流の 3 次元的な流れを画像化するためには，技術的. 速度の画像化が可能となる手法を考案した．観察領域. なブレークスルーが必要である．今後は，酸素分圧，. において血管の連続画像を取得し，このとき少量の蛍. pH，温度などの細胞環境を計測するためのイメージン. 光色素を血中に投与し，画像内での蛍光色素の通過時. グ手法が確立され，さらに細胞環境と相互に関連する. 間と通過距離を計測することで血流速度を画像化する. 遺伝子・タンパクの働きをリアルタイムに画像化する. 手法である．このような蛍光色素を用いた希釈法は. ことが可能になると期待される．. 6, 25~30）. 34）. 臨床での indocyanine green （ICG）を用いた近赤外スペクトロスコーピー法による脳血流の評価35, 36）において. 謝辞：本研究の一部は，科研費（No. 25750400）による. も有用である．しかし，本手法で画像化できるのは平. 支援を受けて行われました．本研究のデータ収集・解. 面に分布する血管に限られるため，今後は脳実質内での血流速度の画像化法や 3 次元的に分布する微小血管ネットワークの血流分布に関する画像化法についてさらに検討が必要である．. 析を行った電気通信大学須貸拓馬氏，星川椋氏，新タ雅啓氏，深澤稔氏に感謝致します．また，ご指導をいただきました慶應義塾大学医学部神経内科鈴木則宏教授，冨田裕非常勤講師，ならびに放射線医学総合研究所分子イメージング研究センター先端生体計測研究プログラムのスタッフの皆様に深謝致します．. 3．Future perspective: transportation/transcription imaging with two-photon microscopy. 文献 1） Denk W, Strickler JH, Webb WW: Two-photon laser. 今後の展望として，神経・グリア・血管ネットワーク間での物質の輸送や遺伝子・タンパクの発現に着目した in vivo イメージング手法の開発が期待される．これまでに，二光子顕微鏡下でりん光寿命を利用した脳内の酸素分圧に関するイメージング手法が報告されている37~41）．また，細胞内外の環境変化に応じて発現す. scanning fluorescence microscopy. Science 248: 73–76, 1990 2） Zipfel WR, Williams RM, Webb WW: Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol 21: 1369–1377, 2003 3） Helmchen F, Denk W: Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods 2: 932–940, 2005. る遺伝子やタンパクを標的とした蛍光プローブの開発. 4） Kobat D, Horton NG, Xu C: In vivo two-photon micros-. も進められている．今後は pH や温度などの細胞環境. copy to 1.6-mm depth in mouse cortex. J Biomed Opt 16:. ─ 102 ─.

(5) 神経血管ユニットの可塑性に関する生体光イメージング. 106014, 2011. rosci Methods 169: 84–92, 2008. 5） Horton NG, Wang K, Kobat D, Clark CG, Wise FW,. 16） McCaslin AF, Chen BR, Radosevich AJ, Cauli B, Hillman. Schaffer CB, Xu C: In vivo three-photon microscopy of. EM: In vivo 3D morphology of astrocyte-vasculature. subcortical structures within an intact mouse brain. Nat. interactions in the somatosensory cortex: implications for. Photonics 7: 10.1038, 2013. neurovascular coupling. J Cereb Blood Flow Metab 31:. 6） Kleinfeld D, Mitra PP, Helmchen F, Denk W: Fluctuations. 795–806, 2011. and stimulus-induced changes in blood flow observed in. 17） Nimmerjahn A, Helmchen F: In vivo labeling of cortical. individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocor-. astrocytes with sulforhodamine 101 (SR101). Cold Spring. tex. Proc Natl Acad Sci USA 95: 15741–15746, 1998. Harb Protoc 2012: 326–334, 2012. 7） Masamoto K, Tomita Y, Toriumi H, Aoki I, Unekawa M,. 18） Hill RA, Grutzendler J: In vivo imaging of oligodendro-. Takuwa H, Itoh Y, Suzuki N, Kanno I: Repeated longitu-. cytes with sulforhodamine 101. Nat Methods 11: 1081–. dinal in vivo imaging of neuro-glio-vascular unit at the peripheral boundary of ischemia in mouse cerebral cortex.. 1082, 2014 19） Sekiguchi Y, Masamoto K, Takuwa H, Kawaguchi H,. Neuroscience 212: 190–200, 2012. Kanno I, Ito H, Tomita Y, Itoh Y, Suzuki N, Sudo R, Tan-. 8） Tomita Y, Kubis N, Calando Y, Tran Dinh A, Méric P,. ishita K: Measuring the vascular diameter of brain surface. Seylaz J, Pinard E: Long-term in vivo investigation of. and parenchymal arteries in awake mouse. Adv Exp Med. mouse cerebral microcirculation by fluorescence confocal microscopy in the area of focal ischemia. J Cereb Blood. Biol 789: 419–425, 2013 20） Hotta H, Masamoto K, Uchida S, Sekiguchi Y, Takuwa H,. Flow Metab 25: 858–867, 2005. Kawaguchi H, Shigemoto K, Sudo R, Tanishita K, Ito H,. 9） Yoshihara K, Takuwa H, Kanno I, Okawa S, Yamada Y,. Kanno I: Layer-specific dilation of penetrating arteries. Masamoto K: 3D analysis of intracortical microvascula-. induced by stimulation of the nucleus basalis of Meynert. ture during chronic hypoxia in mouse brains. Adv Exp. in the mouse frontal cortex. J Cereb Blood Flow Metab. Med Biol 765: 357–363, 2013. 33: 1440–1447, 2013. 10） Guo H, Itoh Y, Toriumi H, Yamada S, Tomita Y, Hoshino. 21） Sekiguchi Y, Takuwa H, Kawaguchi H, Kikuchi T, Okada. H, Suzuki N: Capillary remodeling and collateral growth. E, Kanno I, Ito H, Tomita Y, Itoh Y, Suzuki N, Sudo R,. without angiogenesis after unilateral common carotid. Tanishita K, Masamoto K: Pial arteries respond earlier. artery occlusion in mice. Microcirculation 18: 221–227,. than penetrating arterioles to neural activation in the. 2011. somatosensory cortex in awake mice exposed to chronic. 11） Tajima Y, Takuwa H, Kokuryo D, Kawaguchi H, Seki C,. hypoxia: an additional mechanism to proximal integration. Masamoto K, Ikoma Y, Taniguchi J, Aoki I, Tomita Y,. signaling? J Cereb Blood Flow Metab 34: 1761–1770,. Suzuki N, Kanno I, Saeki N, Ito H: Changes in cortical. 2014. microvasculature during misery perfusion measured by. 22） Tian P, Teng IC, May LD, Kurz R, Lu K, Scadeng M,. two-photon laser scanning microscopy. J Cereb Blood. Hillman EM, De Crespigny AJ, D’ Arceuil HE, Mandeville. Flow Metab 34: 1363–1372, 2014. JB, Marota JJ, Rosen BR, Liu TT, Boas DA, Buxton RB,. 12） Masamoto K, Takuwa H, Seki C, Taniguchi J, Itoh Y,. Dale AM, Devor A: Cortical depth-specific microvascular. Tomita Y, Toriumi H, Unekawa M, Kawaguchi H, Ito H,. dilation underlies laminar differences in blood oxygen-. Suzuki N, Kanno I: Microvascular sprouting, extension,. ation level-dependent functional MRI signal. Proc Natl. and creation of new capillary connections with adaptation. Acad Sci USA 107: 15246–15251, 2010. of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under. 23） Itoh Y, Suzuki N: Control of brain capillary blood flow. J. chronic hypoxia. J Cereb Blood Flow Metab 34: 325–331, 2014. Cereb Blood Flow Metab 32: 1167–1176, 2012 24） Takuwa H, Masamoto K, Yamazaki K, Kawaguchi H,. 13） Reeves AM, Shigetomi E, Khakh BS: Bulk loading of cal-. Ikoma Y, Tajima Y, Obata T, Tomita Y, Suzuki N, Kanno. cium indicator dyes to study astrocyte physiology: key. I, Ito H: Long-term adaptation of cerebral hemodynamic. limitations and improvements using morphological maps.. response to somatosensory stimulation during chronic. J Neurosci 31: 9353–9358, 2011. hypoxia in awake mice. J Cereb Blood Flow Metab 33:. 14） Nimmerjahn A, Kirchhoff F, Kerr JN, Helmchen F: Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the. 774–779, 2013 25） Chaigneau E, Oheim M, Audinat E, Charpak S: Two-pho-. neocortex in vivo. Nat Methods 1: 31–37, 2004. ton imaging of capillary blood flow in olfactory bulb. 15） Kafitz KW, Meier SD, Stephan J, Rose CR: Developmen-. glomeruli. Proc Natl Acad Sci USA 100: 13081–13086,. tal profile and properties of sulforhodamine 101─Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus. J Neu-. 2003 26） Schaffer CB, Friedman B, Nishimura N, Schroeder LF,. ─ 103 ─.

(6) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. Tsai PS, Ebner FF, Lyden PD, Kleinfeld D: Two-photon. 84: 178–187, 2012. imaging of cortical surface microvessels reveals a robust. 35） Kuebler WM, Sckell A, Habler O, Kleen M, Kuhnle GE,. redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS. Welte M, Messmer K, Goetz AE: Noninvasive measure-. Biol 4: e22, 2006. ment of regional cerebral blood flow by near-infrared. 27） Drew PJ, Blinder P, Cauwenberghs G, Shih AY, Kleinfeld. spectroscopy and indocyanine green. J Cereb Blood Flow. D: Rapid determination of particle velocity from spacetime images using the Radon transform. J Comput Neuro-. Metab 18: 445–456, 1998 36） Leung TS, Tachtsidis I, Tisdall M, Smith M, Delpy DT,. sci 29: 5–11, 2010. Elwell CE: Theoretical investigation of measuring cerebral. 28） Autio J, Kawaguchi H, Saito S, Aoki I, Obata T, Masa-. blood flow in the adult human head using bolus Indocya-. moto K, Kanno I: Spatial frequency-based analysis of. nine Green injection and near-infrared spectroscopy. Appl. mean red blood cell speed in single microvessels: investi-. Opt 46: 1604–1614, 2007. gation of microvascular perfusion in rat cerebral cortex.. 37） Estrada AD, Ponticorvo A, Ford TN, Dunn AK: Microvas-. PLoS ONE 6: e24056, 2011. cular oxygen quantification using two-photon microscopy.. 29） Kim TN, Goodwill PW, Chen Y, Conolly SM, Schaffer. Opt Lett 33: 1038–1040, 2008. CB, Liepmann D, Wang RA: Line-scanning particle image. 38） Finikova OS, Lebedev AY, Aprelev A, Troxler T, Gao F,. velocimetry: an optical approach for quantifying a wide. Garnacho C, Muro S, Hochstrasser RM, Vinogradov SA:. range of blood flow speeds in live animals. PLoS ONE 7:. Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphores-. e38590, 2012. cence. Chemphyschem 9: 1673–1679, 2008. 30） Santisakultarm TP, Cornelius NR, Nishimura N, Schafer. 39） Sakadzić S, Roussakis E, Yaseen MA, Mandeville ET,. AI, Silver RT, Doerschuk PC, Olbricht WL, Schaffer CB:. Srinivasan VJ, Arai K, Ruvinskaya S, Devor A, Lo EH,. In vivo two-photon excited fluorescence microscopy. Vinogradov SA, Boas DA: Two-photon high-resolution. reveals cardiac- and respiration-dependent pulsatile blood. measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vas-. flow in cortical blood vessels in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 302: H1367–1377, 2012. culature and tissue. Nat Methods 7: 755–759, 2010 40） Lecoq J, Parpaleix A, Roussakis E, Ducros M, Goulam. 31） Ishikawa M, Sekizuka E, Shimizu K, Yamaguchi N,. Houssen Y, Vinogradov SA, Charpak S: Simultaneous. Kawase T: Measurement of RBC velocities in the rat pial. two-photon imaging of oxygen and blood flow in deep. arteries with an image-intensified high-speed video camera system. Microvasc Res 56: 166–172, 1998. cerebral vessels. Nat Med 17: 893–898, 2011 41） Parpaleix A, Goulam Houssen Y, Charpak S: Imaging local neuronal activity by monitoring PO2 transients in. 32） Tomita M, Osada T, Schiszler I, Tomita Y, Unekawa M,. capillaries. Nat Med 19: 241–246, 2013. Toriumi H, Tanahashi N, Suzuki N: Automated method for tracking vast numbers of FITC-labeled RBCs in. 42） Helmchen F, Waters J: Ca2+ imaging in the mammalian brain in vivo. Eur J Pharmacol 447: 119–129, 2002. microvessels of rat brain in vivo using a high-speed confocal microscope system. Microcirculation 15: 163–174,. 43） Grienberger C, Konnerth A: Imaging calcium in neurons. Neuron 73: 862–885, 2012. 2008 33） Unekawa M, Tomita M, Tomita Y, Toriumi H, Miyaki K,. 44） Knöpfel T: Genetically encoded optical indicators for the. Suzuki N: RBC velocities in single capillaries of mouse. analysis of neuronal circuits. Nat Rev Neurosci 13: 687– 700, 2012. and rat brains are the same, despite 10-fold difference in. 45） Tian L, Akerboom J, Schreiter ER, Looger LL: Neural. body size. Brain Res 1320: 69–73, 2010 34） Kawaguchi H, Masamoto K, Ito H, Kanno I: Image-based vessel-by-vessel analysis for red blood cell and plasma dynamics with automatic segmentation. Microvasc Res. ─ 104 ─. activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Prog Brain Res 196: 79–94, 2012.

(7) 神経血管ユニットの可塑性に関する生体光イメージング. Abstract In vivo optical imaging of structural and functional plasticity of neurovascular unit Kazuto Masamoto1, 2 and Iwao Kanno2 1Brain Science Inspired Life Support Research Center, University of Electro-Communications, Tokyo, Japan 2Molecular Imaging Center, National Institute of Radiological Sciences (NIRS), Chiba, Japan A precise understanding of the cellular interplay in the neurovascular unit is fundamental to develop a way of preventing neurodegenerative disorders resulting from cerebrovascular disturbance. A new imaging technique using in vivo two-photon microscopy with a variety of animal models that genetically express fluorescence proteins in the cells enables us to explore the structural and functional plastic changes in the neurovascular unit. Here we report the optical imaging and analytical techniques to visualize and quantify the neurovascular structures and functions. For imaging of brain microvasculature, a capillary length and diameter was automatically measured and their threedimensional images were reconstructed by using custom-written matlab software. For brain cell imaging, either neurons or glias were fluorescently labeled, and their morphological parameters were determined along with a location of the measured cells. In addition to the static imaging, a dynamic scanning method allows for acquiring a functional property of the cerebral blood flow and/or intracellular calcium concentrations. Finally, a future work should focus on a development of the imaging and quantification methods for cellular environment and genetic and/or protein expressions. Further technical improvements with in vivo two-photon microscopy with a variety of fluorescent proteins will provide a powerful tool for understanding the long-term neurovascular plasticity in health and disease. Key words: two-photon microscopy, Seylaz-Tomita method, fluorescence protein, hypoxia, neurovascular unit. ─ 105 ─.

(8)