尾部懸垂前の運動が廃用性萎縮筋のユビキチン-プロテアソーム系に及ぼす抑制効果

理 学 療法 学 　 第

33

巻 第

2

号 　

76

〜

81

頁 （

2006

年 ）

研 究 報 告

尾

部

懸

垂

前

の

運

動

が

廃

用

性萎

縮

筋

の

ユ

ビ

_{キ チ}

ン ー

_プ

ロ

_{テ ア}

ソ

ー ム

_系

　　　　　　

に及

ぼ

す 抑 制

効

果

＊

藤

野 英 己

1

−

3

）＃

上

月

久 治

3

）

4

）

　

武

田

　

功

D

　

田

崎 洋 光

1

）

　　　　　

近 藤 浩 代

1

＞

　

石 田 寅 夫

2

）

　

梶 谷 文 彦

3

）

5

） 要

旨

　

廃 用 性

筋

萎 縮の予 防 法 と し て プレコ ンディ ショ ニ ング 運

動

の 制

御 機構

につ い て

，

タ ンパ ク

質 分 解

に

作

用 す るユ ビキ チン

ー

プロ テア ソ

ー

ム

系

， 及びタン パ ク

質新

生

・

修 復

に 関

与 す

る

熱

ス トレ ス タ ンパ ク

質 （

HSP

）

につ いて

検

討 し た

。

ラッ トを 用いて

，1

）

2

週 間の

尾 部 懸 垂 群 （

HS

）

，

2

）

HS

直 前

に トレッ ドミ ル

走 行 を行

い

2

週 間の尾 部 懸 垂 を し た 群 （

ExHS

）

，

及 び

3

） 対 照 群 に 分 類 し た

。

ヒ ラ メ

筋

を 摘 出 して

，

筋

原

線 維

タ ン パ ク

質

量 を

計

測 し， リアル タ イム

定

量

PCR

法

でユ ビキ チン リガ

ー

ゼ

E3

， 及び

72k

−

Da

　

HSP

（

HSP72

）

の mRNA を 測

定

し た

。

筋

原

線 維

タンパ ク

質

量 は

，

対 照

群

と 比

較

し て

HS

と

ExHS

で は

有 意

な

低

ド

を示

し た が

，

ExHS

では

HS

に 比 較 して有 意 に 高 値 を示 し た

。一

方

，

ユ ビキ チ ン リガ

ー

ゼ

E3

　

mRNA

は

，

対 照 群 と比 較 して

HS

で

有

意 に

増 加

し

，

　

ExHS

_{で は}

_{増 加}

_{を 示 さ な か}っ た

。

ま た_，　

HSP72

　mRNA は， 対 照 群 と比 較 して

HS

で

有

意 に

減

少 し

，

　

ExHS

で は 減 少 が

抑

制 さ れ た

。

プ レコ ンデ ィショ ニ ング 運

動

はユ ビキ チ ンリ ガ

ー

ゼ

E3

の

活

性

化

を 抑 制 し

，

　

HSP

の低 下 を 減 衰 さ せ た

。

これ らの結 果 か ら プレコ ンデ ィショ ニ ング 運 動 は 尾 部

懸

乖

中

の

筋

タンパ ク

質分 解 系

の

活性 化

を

抑 制 す

る

制 御 機 構

が

働 く

こと が

示 唆

さ れ た

。

キ

ー

ワ

ー

ド

　

ユ _{ビ キ チ}ンリ ガ

ー

ゼ

，

熱

ス ト レス タンパ ク

質

，

mRNA

緒

言

　骨 格 筋

の

廃用 性 萎 縮

は

収 縮

タ ンパ ク

質

の

合

成 と

分 解

の バ _ラン ス

が崩 壊 し

，

タ ンパ ク

質

の

分解 速 度 が 合 成 速 度 を

＊

　

lnhibltory

　

Effects

　 of 　

Exercise

・

preconditioning　

beforc

　

Hindljmb

　

Suspension

　on　

Ubiquitin

−

_proteasome 　

Pathway

　

Actlvity

　

in

　

M

し1sc｝e

　

Atrophy

l

〕 鈴 鹿 医 療 科 学 大 学 保 健 衛 生 学 部

　 （〒

510

−

0293

≡重県 鈴 鹿iij岸 岡町］

1001

−

1

）

　

Hidemi

　

Fuji

［10

，

　

RPT

，

　

PhD

，

王sao　

Takeda

，

　

RPT

，

　

PhD

，

　

Hiromitsu

　

Tasaki

，

　

RPT

、

　

MS

，

　

Hir

【｝yo　

Kondo

，

　

MS

：

FacuLL

｝

・

o！

HealLh

　

Sciences

，

　

Suzuka

　

University

　of　

Medical

　

Sciellc

：e

2

） 同　 東 洋医学研究 所

　

Hidemi

　

Fujin

〔｝

，

　

RPT

，

　

PhD

，

　

Torao

　

Ishidu

，

　

PhD

：

Institute

　〔エ

f

　

Traditio

”al　

Medicine

，

　

Suzuka

　

University

（，

f

　

Medica

ユ

Science

3

）岡 山大 学 大 学 院 医 歯 蘂 学 総 合 研 究 科シス_テム循 環 牛 理 学

　

Hidemi

　

Fujino

，

　

RPT

，

　

PhD

，

　

Hisaharu

　

Kohzuki

，

　

MD

，

　

PhD

，

　

Fumihiko

　

Kajiya

，

　

MD

，

　

PhD

；

Departnlent

of　

Cardiovascutar

　

Physiology

，

　

Okayama

　

University

　

Craduate

　

Schoot

　of　

Medicine

，

　

Dentistry

　and 　

PharmaCeUtiCat

　

SCiellCeS

d

）岡 山 学 院 大 学 人 間 生活 学部

　

Hisaharu

　

Kohzuki

，

　

MD

．

　

PllD

：

Department

　of　

Food

　and 　

Nutrition

．

　

Okayama

　

Gakuin

　

University

5

）川崎 医 科大学 医用 工学

・

川 崎 医療短 期 大学

　

F

しlmihik （，　

Kajiya

，

　

MD

　

，

PhD

：

DeparLmenL

　of　

Medical

　

Engineering

，

　

Kawasaki

　

Medical

　

Scho

【）

L

，

　and 　

Kawasaki

　

College

〔）

f

　

Allied

　

Health

　

Pr

〔，

fessi

（，1hS ＃

　

E

−

mail ：

fujino

＠

．

suzuka

．

u

．

ac

．

jp

　 〔受 イ

・

J

日　

2DO5

年

10

月

27

　

H

／受理 日　

2DO6

奪

2

月

2

目 ｝

超

え る た めに

発

生

す

ること が

知

ら れてい る1

−

3〕

。

ラ ッ ト の

尾 部 懸

垂による

不 荷

重

直 後

にはタ ン パ ク

質

の合 成

低

下 が 主

因

で

筋

タン パ ク

質

の

減

少 が 起こ

り

1〕2）

’

1）

，

数

時

間 後 にはタ ンパ ク

質 分 解 速 度

が

増 加

して

，

相 対 的

に タン パ ク

質

の

分 解

が

優 位

と なる と

考

え ら れている 1）

2

）

。

ラ ッ トヒ ラ メ

筋

の タ ンパ ク

質 損

失

経

過 を

観 察

した

研

究で は

，

尾

部

懸 垂

5

時 間後

に ヒラメ

筋

の

筋

タ ンパ ク

質

が

減 少

し

，

2

週

間 ま

で

筋

タ ンパ ク

質

の

分 解

が

促

さ れ て い る

D2

）。 ま た

，

先 行研 究

に お いて

も

2

週

間

の

尾 部懸

垂で

筋 原 線 維

タン パ ク

質 量

が

40

％ 減 少 す

る こと

を確 認 し

て い る51／　6）。 これ ら

筋

原

線 維

タ ンパ ク

質 量

の

減 少

は タ ンパ ク

質

の

分 解系

が

活性 化

され た こ とで生 じ た

現 象

で

あ

ると

考

えら れ る上

一

3）

。

筋

タン パク

質

の

分 解系

と して

働 く経 路

と

し

て

，

リソ ソ

ー

ム

系

，

カ ル パ イン

系

，

及びユ ビキ チン

ー

プロ テアソ

ー

ム

系

が あ り， ユ ビキ チ ン

ー

プロテアソ

ー

ム

系

に よ る

経 路

は

廃

用

性 筋 萎 縮

に お け る タン パ ク

質 分解 系

の

促 進

に

強 く関

与 し てい る と 考 え ら れ てい る3）

。

ユ ビキ チ ン

ー

プロ テ ア ソ

ー

ム

_系

は

3

つ の 酵

素

であるユ ビキ チン

活 性 化 酵 素

， ユ ビキ チン結 合

酵 素

，

ユ ビキ チン

連 結 酵 素 （

ユ ビ キ チンリ ガ

ー

ゼ

E3

） が 関 与 す る 漣 の経 路 で

作

用 す る3）7）

。

Japanese Physical Therapy Association

NII-Electronic Library Service

Japanese _{Physioal 　Therapy 　Assooiation}

尾 部懸重前の運 動が廃用性 萎 縮 筋のユ ビキ チン

ー

プロ_{テ ア ソ}

ー

_ム系に及ぼす 抑 制 効 果

77

HSP ）

はタ ン パ ク

質

の

新

生

，

修

正

等

に 関 与 す る 4〕8）

。

HSP

は 変 性 過 程の タン パ ク

質

を

修

止し_， リボ ソ

ー

ム で 合 成 さ れ た

新

生 ポ リペプ チ

ド鎖

の

伸 張 を補 助 す

る

分

子 シ ャ ペ ロ ン と して の

機 能

を

も

つ 8〕

。

_特

_に

70k

−Da

　

HSP

_ファ ミリ

ー

に

属 す

る

HSP72

は

細 胞 質 内

に

存 在

し，

様

々 なス トレ スに よっ て

誘 導 され

る

HSP

で

あ

る8）

。

　

HSP72

は

一・

過

性

の 運

動

6）9）10）

，

電 気 刺 激

11）や 温 熱

負

荷 12丿に よ り

増 加

し

，

筋

タ ンパ ク

質 分 解

の

抑 制

12 ）や

筋

肥 大 ］

3

） に

関

与 す

る こと

が 報 告

さ れ ている

。

先 行

研 究 で は 尾

部 懸

垂

前

の プレ コ _{ン デ ィ シ} ョ ニ ン グ運 動 で

HSP72

が 誘

導

さ れ

，

そ れに

伴 う尾 部 懸 垂 中

の

筋

原

線 維

タンパ ク

質

量の

_{減 少}

を

抑 制

で

き

る こと

を報 告

し た6）

。

し か し

，

プ レコ ン デ ィシ ョ ニ ン グ運

動

の

筋

萎 縮 予 防 に 対 す る 制 御 機

構

につ い て は

明確

に で

き

なかっ た

。

　

そ

こ で

，

本研 究

で は 尾 部

懸 乖 前

に

行 う

プレコ ン デ ィシ ョ ニ ン グ運

動

が 廃 用 性 筋 萎 縮 を

予

防

す

る制

御機 構

を

検 証

す

る た め に タ ンパ ク

_質

分

解 系

に

働 く

ユ ビキ チ ン

ー

プロ テ アソ

ー

ム

系

のユ ビ キ チン リ ガ

ー

ゼ

E3

　mRNA

，

及

び

分 子

シ ャペ ロ ン

機

能 を もつ

HSP72

　mRNA の

変 化

につ _いて

検

討

した

。

方

法

ユ

．

実

験 動 物

　Wistar

雄 性

ラッ ト

15

匹 （

8

週

齢

，

体 市

ユ

86

±

8g

_）

_を

使

用 し た

．

こ れ らラ ッ ト を 次の

3

群

に

区 分

し た

。

1

）

Morey

法 1

’

t〕15）に よ

り

2

週 間

の

尾 部 懸 垂 を 行

っ た

群

（

HS ，

　n

＝

5）

，

2）

尾

部 懸

垂 を

行 う前

に

25

分 問

の トレッ ドミル走 行 （プレコ ンデ ィシ ョ ニ ン グ

運 動

，

20m

〆

s

， ト り 坂

20

°

）

を して

，

2

週 間

の

尾 部 懸 垂 を 行

っ た

群

（

ExHS ，

　n

≡

5

）

，

及

び

3

） 対 照 群 （

Control

，

　

_n

≡

5

_{） と}

し た

。

ラ ッ ト は 室 温

22

±

1

_℃の

環 境

．

ドで

個

別 ケ

ー

ジに て飼

育

さ れ

，

食 餌

，

及

び

飲 水

は

自山

と し

た

。

　

本 研 究 は

，

凵

本

生 理

学 会

の

「

生

理 学 領 域

に お

け

る

動 物

実 験 に 関 する基

本 指 針 」

，

及

び

鈴 鹿 医療 科 学

大

学 動 物

実 験

指 針

に

従

っ て

行

い

，

鈴 鹿 医 療 科 学 大 学 動 物 実 験

承 認

（

承 認

番

号

；

第

20

号

） を

得

ている

。

2

．

ヒラメ

_筋

の

総

RNA

抽 出

と

cDNA

合 成

］6）17）

　

HS ，

　

ExHS

は

2

週 間

の

尾 部 懸 垂 を終 了

し た

後

，

ま た

，

Control

は

2

週

間

の

白 由 飼 育 後

にペ ン トバ ル ビ タ

ー

ル

（

50mg

，

ikg

_，

　

i

．

p

．

）

で

麻 酔 し

て

，一

側

ヒラメ

筋

を

摘

出 し た

。

摘 出 し たヒラ メ

筋

の

中 央 部

2

  mg

程 度

を 切 り 出 し

，

1ml

の

TRIzol

　

Reagent

_（

lnvirtogen

_{） を 加 え}

_た16

 

マ _{イ ク} ロチュ

ー

ブ

（

エ ッ ペ ン

ド

ル フ

） 内

で

均 質 化

（

N556

，

コ スモ バ イ オ ） を

行

い

，

200

_μ♂クロ ロホル ム を

加

え

，

15

秒

聞

の

振 盪 を行

っ

た

。

微 量 高 速 冷 却

遠

心 機 （

MX −

301

，

ト ミ

ー

精

工

）

で

遠 心 （

4

℃

，

15

分

，

15

，

000rp

，

m

．

） 後

，

上

清 液

500

μ

に イソ プ ロ パ ノ

ー

ル

500

_μ

t

_加

えて

，

遠 心

（

4

℃

，

15

分

，

15，

000r ．

p

．

m

．

）

処

理 し， 総

RNA

を

沈 殿

さ せ た

。

上

清 液 を取 り除 き

，

エ タ ノ

ー

ル ］ml を

加

えて

沈

殿

を

洗 浄

し_， エ タ ノ

ー

ルを 蒸 発 さ せ た

。

RNase

　

Free

_水

を加 え

て

，

20

μ」の

総

RNA

を

抽

出

・

精 製

し た

。

分 光 光 度

計

（

UV −

1700

，

　

SHIMADZU

_）

で 吸 光

度

（

OD

）

260

／

280nm

の 比 を 求 め

，

精 製 度

の

_{確 認}

を

行

い

，

　

OD

260

／

280nm

比 が

1，

7

以

．

ヒで あっ た

場 合

は

良 好 な精 製

が

行

わ

れ た も

の

と判 断

し た

。

　

次

に ラン ダム プラ イマ

ー

に よる

RNA

逆 転 写 酵 素

（

High

　

Capacity

　cDNA 　

Archive

　

Kit

，

　

Applied

　

Biosystems

）

を使 用

して

，

逆 転

写 を

行

い

，

cDNA を

合成

し た

。

3．

リア ルタ イム

_定

量

Polymerase

　chain 　rcaction

（

PCR

）

　

法

に よ るmRNA の測

定

　

本

研

究 に お い て は

Taqman

（

R

）

Gene

　

Expression

Assays

（

Applied

　

Biosystems

）

_{を使 川 し}

て

，

ユ ビ キ チ ン リ



ガ

ー

ゼ

E3

　mRNA

（

RnOl535853

−

ml

，

　

Applied

Biosystems

）

，

及

び

72

−

kDa

　

HSP

_（

HSP72

_）

_mRNA

（

RnOl487057

−

ml

，

　

Applied

　

Biosystems

） を 測 定

し た

。

ま た

，

内 在 性

の コ ン トロ

ー

ル と して リ ボゾ

ー

ム

18S

mRNA

（

Hs99999901

−

sl

，

　

Applied

　

Biosystems

） を 測 定 し

，

検

量

線 法

で

各

mRNA

量 を計 測

し

た

。

．

各 遺 伝

子の

塩

基

配

列

は

表

1

の

通 り

で

あ

り

，

Taqman

（

R

）

Gene

Expression

　

Assays

では

各塩 基 配 列

の

特 定 部

分のみ を

増

幅

して い る

。

PCR

に はリ ア ル タ

イ

ム

PCR

シス テ ム

（

7500Fast

　

Real

−

time

　

PCR

，

　

Applied

　

Biosystems

_{） を使}

用

し

，

TaqMan 　Fast

　

Universal

　

Master

　

Mix

_試

_薬

（

Applied

　

BiosysteIns

）

で

，

45

サ イ クル の反

応

を

計

測 し た

。

PCR

の

条件

は

FaSt

モ

ー

ドで

全 量

20Pt

の反 応 系 を 用 い て

，

1

サ

イ

ク ル

95

℃

，

3

秒

， 及 び

60

℃

，

30

秒

を

繰 り

返 し た。 ユ ビ

キ

チンリガ

ー

ゼ

E3

　

mRNA

，

及 び

HSP72

mRNA は

各

サ ン プ ル の リボ ゾ

ー

ム

18S

　

_mRNA

_{で補 正} し

，

Control

を キ

ャ リブ レ

ー

タ

（

Control

を

1

と して正 焼

化 ）

と し た。

表

1



リ ア ル タイム定 量

PCR

に

使

用 し た mRNA

，

及び

Taqman

（

R

）

Gene

　

Expression

　

Assays

mRNA

Taqman

（

R

）

Gene

　

Expression

　

Assays

_{塩 基 配 列} ユ ビキ チン リ ガ

ー

ゼ

E3

72k

−

Da

　

HSP

リ ボゾ

ー

ム

18S

RnO1535853

　_ml

RnOl487057

　_ml

Hs99999901

　_sl

5

’

−

GCCATACTTGTTTTAACCGCCTGGA

−

₃

’

5

’

−

CTATGAAAAGGGATGGATCTTTACA

−

₃

’

5

’

・

ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC

−

₃

，

各

mRNA は 塩基 配 列の

一

部 を増 幅してい る

．

　

Taqman

（

R

）で使用 さ れて い るプライマ

ー

などの詳 細は非公 開 と なっ てい る

，

N工 工

一

Eleotronio _Library

78

理 学

療法

学

　第

33

巻

第

2

号

4

．

筋 原線 維

タンパク 質の 抽 出⊥8 ）と

定 量化

　RNA

抽 出

した 反

対

側

後

肢 か らヒラメ

筋

を

摘 出

し

，

液

体 窒 素

で

冷 却

し た イソ ペ ンタン

内

で

瞬 間凍 結 し

，−

80

℃ に

冷 凍 保 存

し た

。

摘 出 筋の 中 央 部

20mg

程 度 を切 り出

し

，

20

倍 量 （

v ／w

）

の

抽 出 溶 液 （

シ ョ

糖

250mM

，

塩 化

カ リ ウ ム

100mM

，

イ ミ ダ ゾ

ー

ル

20

　mM

，

　

EDTA

　

5

　

mM

） を

加

えて

，

超 音 波

ホモ ジ ナ イ ザ

ー

（

Sonifier

　

S−

150D

，

BRANSON

）

で

均 質 化

し た

。

均 質化

し た

抽 出溶 液 を

4

℃ で

遠心 分 離 （

3

，

000r

．

p

．

m

，

101nin

）

し

，一

ヒ

清 液 を取 り除

き

， ペ レッ トを 回

収

し た

。

次 に

2

種 類の溶 液

（

塩 化

カ リ ウム

175mM ，0．

5

％

ト リ トン

X

−

100

，

_及

び

塩

化カ リウ ム

150mM ，

イ

ミ ダ ゾ

ー

ル

20

　mM

）

を 用 い て

，

膜 結 合

ATPase

を

取 り除

き

，

筋 原 線 維

タンパ ク 質 を 回 収 し た

。

Bradford

法 （

Protein

　assay

，

　

Bio

−

Rad

_）

に よ り， 分

光 光

度 計

（

UV −

1700

，

　

SHIMADZU

_）

_で

595

　nm の

OD

を測 定

し た

。

OD

から

筋 原 線 維

タ ンパ ク

質

量 を 算 出 し

，

ヒ ラ メ

筋

lg

重 量 当 た り

の

筋 原 線 維

タンパ ク

質

量

（

mg 〆

g

）

と し て

表 示

し

た

。

5

．

統 計 処

理

　

得

ら れ た

測 定 値 は平 均

±

_{標 準 誤 差}

で

表示

し た

。

検定

は

Kruskat

−WaUis

検 定

， 及び

事 後 検 定

と して

Dunn

検

定 を

使

用 し た

。

ま た，

有 意 水 準

5

％

によ

り有 意 差

を

判 定

し た

。

結

果

　2

週

間

の尾

部 懸 垂

に よ

り

HS

，

及

び

ExHS

の ヒラメ

筋

湿

重 量 は そ れ ぞ れ

53

士

2mg ，

54

±

3mg

_と

_{な り}

，

Control

の

91

±

2mg

に 比べ て

有 意

に

減 少

を

示

した

。

　

ユ ビ キ チン リ ガ

ー

ゼ

E3

　_mRNA

_（

_a

．

_u

．

_）

_は

Control

に

比

較

して

，

HS

で は

3

．

5

±

2

．

3

で

有 意

に

増 加 を 示 し

た が

，

ExHS

で は

1

，

2

±

0

，

3

と

変 化

し な か っ た

（

図

1

）

。

一

方

，

HSP72

　_mRNA

_（

_a

．

_u

．

_）

_は

Control

_{に 比}

較

_{し て}

，

HS

は

0

，

3

±

0

．

1

と

_有

意に

低

下 し た が

，

ExHS

で は

0，

8

±

0．

2

_と

_変

化 を 示 さ な

かっ た

（

図

2

）

。

筋

原

線 維

タ ン パ ク

質 量

は

Contro1

が

ll3

±

3mg

／

g

で あ るの に 比

較

し，　

HS

で は

70

±

13mgfg

_と

_有

_意に

減

少 し た が

，

　

ExHS

_{で は}

107

±

7mglg

と

筋 原 線 維

タン パ ク

質

量の

_減

少 を

減 衰

させ た

（

図

3

）

。

考

察

　

本研 究

で は

廃 用 性 筋 萎 縮

の

予 防 対 策

と し て 尾 部

懸 垂 前

の 運

動 を 行

っ た。 その

結 果

，

2

週

間

の

実

験

期

間

内

でラ ッ トヒ ラメ

筋

の

筋 原 線 維

タ ン パ ク

質

量の

損 失

を

減

衰 で き た

。

この

制 御 機 構

と

し

て

，

タン パク

質分 解 系

で あ るユ ビ キ チン リガ

ー

ゼ

E3

の

活 性 化

を

抑 制

してい ること が

検 証

で き た

。

ま た， タンパ ク

質

の

分 子

シ ャペ ロ ン

作 用

を もつ

HSP

の

低

下

を減 衰 す

る こと がで

き

た。 こ れ らの

結 果

か ら尾 部 懸

垂 前

の

運 動

は

尾 部 懸 垂 中

の

筋

タ ンパ ク

_質

分

解

系

8

　 　 　 　 　

6

　 　 　 　 　

4

　 　 　 　 　

　

2

　 　 　 　 　

0

＜

耄

の ゜。

霍

註

瞭  

器

b。 ＝

驀

哨

9

哨

＾

5

＊

†

Controi

HS

ExHS

図

1



ユ ビ キ チンリ ガ

ー

ゼ （

Ubiquitin

　

ligase

_）

E3

　mRNA の

変

化

　

萎縮筋 （

HS

）で はユ _{ビ キ チ}ンリ ガ

ー

ゼ

E3

　mRNA が増加し

，

筋タンパク

質

分

解系

の活 性 化が促 進 されて いる

．

プレコ ンディ ショ ニ ング

筋

（

ExHS

＞

で はユ ビキチンリ ガ

ー

ゼ

E3

　mRNA が 抑 制さ れ て

，

筋タンパ ク質分解 系の活 性 化が抑 制 されて いる

．

ユ ビ キ チン リ ガ

ー

ゼ

E3

　mRNA は各サンプル の リボ ゾ

ー

ム

18S

mRNA で補正 し

，

正

常 筋 （

Control

） をキャ リブ レ

ー

タ と して 表 示し てある

．

＊

，

Control

に対 する有 意 差 （

p

＜

0

．

05

）；†

，

HS

に対 する

ExHS

の有 意差 （

p

＜

0

．

05

）

．

＜

7

［

舷

鬟

の QQ

一

』 ＼

N

卜 贏 Qり

2

1

0

＊

COBtrol

†

HS

ExHS

図

2

　

72k

−

Da

熱ス トレ スタン パ ク

質 （

HSP72

）mRNA の変化

　

萎 縮 筋 （

HS

）では

HSP72

　mRNA が 減 少 し

，

筋タン パク質 合 成系が低 下して いる

，

プ レコ ンディショ ニ ング運 動 筋 （

ExHS

） では

HSP72

　mRNA の減少が

抑制

さ れ て

，

筋タン パク質合 成 系の 低下 が減 衰 して い る

．

HSP72

　 mRNA は各サンプル の リボ ゾ

ー

ム

18S

　mRNA で補正し

，

正 常 筋 （

Control

）を キャ リ ブ レ

ー

タ と し て表示 し てある

．

＊

，

CQntrol

に対 す る 有 意 差 （

p

＜

O

．

05

＞

；†

，

HS

に

対す

る

ExHS

の 有 意差 （

p

＜

O

．

05

）

．

の

活 性 化 を抑 制

で

き

，

廃 用 性 萎

縮の

進 行

を 予

防

で

き

るこ と

を示 唆

し ている と

考

え ら れる

。

　

筋 萎 縮

は

主

に

筋

タンパ ク

質分 解 系

の

促

進 で 生 じる

筋 線

維

の

縮小

19）20）や

筋 細 胞 核 断 裂

の

結 果

で 生 じ る

筋 線 維 数

の

減 少

21

−

23）に よっ て

も

た ら さ れ る

。

尾 部 懸 垂 に よ る

廃

用

性 萎 縮 筋

で

は尾 部 懸 垂 直 後

か ら

HSP70

の

_低

下 を

伴

っ て タンパ ク

質

の

合 成

が

抑 制

さ れ る こ と が

報

告

さ れ てい

Japanese Physical Therapy Association

NII-Electronic Library Service

Japanese _{Physioal 　Therapy 　Assooiation}

尾部 懸垂前の運 動 が 廃 用 性 萎 縮 筋のユ ビキ チン

ー

プロ _{テ ア ソ}

ー

_ム系に及ぼす 抑 制 効 果

79

（ 。

｛

8

鬢

。の ＼

b

。

ヨ

）

蕩

蒼

脅

郎

辱

蒻

鼠

芝

i50

lOO

50

0Control

HS

ExHS

　

図

3

筋原線 維タン パ ク質 （），

lyofibrillar

　

_protein

_）量の変 化

　

正常 筋 （

Control

）に 比較して

，

萎 縮 筋 （

HS

）の筋 原 線 維タ ン パ _{ク質量 （mg}

．

〆

_g

_{）は有 意に低下 し た}

，

　

HS

_前に プレコ ンデ ィシ ョニ ング 運動 を行っ た群 （

ExHS

）

で は

Control

に比 較 して

，

筋 原 線 維タ ン パ ク質量の低下 が み ら れ る が

，

HS

に比較 して高 値 を 示した

．

＊

，

ContrQl

に 対 す る 有 意 差 （

p

く

0

．

05

）；†

，

HS

に対 する

ExIIS

の有 意 差 （

p

〈

O

．

05

）

．

る。

ま

た，

Thomason

ら 1）

2

）_は

尾 部 懸 垂

の

数 時 間後

か

ら

タ ンパ _ク

_{質 分 解 系}

の

活 性

化 が お こ

り

，

タン パ ク

質 合 成

よ

り分 解

の

速

度 が 増 加 して

，

筋 原 線

維

タン パ ク

質

の

減 少

が 生 じ る こ とを 明 ら か に してい る。

2

週 問

の

尾 部 懸 垂

で は

筋 線 維 数

の

減 少

21

−

23）_も

観 察

さ れ る が

，

筋

タ ンパ _ク

_{質 分}

解系

の

促 進

が 主 体 に な る3）

。

筋

タン パ ク

質

の

分 解

に関

与

す

る

も

の とし て

，

リソ ソ

ー

ム

_系

，

カル パ

_イ

ン

系

，

ユ ビ キ チン

ー

プロテア ソ

ー

ム

_系

が

知

ら れて い る

。

リソ ソ

ー

ム に は

多

くのプロテ ア

ー

ゼ が

存 在

し

，

数種 類

の カ テ プ シ ンが

筋

原

線 維

タンパ ク

質

の

_分解

に

関 与 し

ている と

考 え

ら れ て い る3 ）

。

ま た

，

カル シ ウ ム

依 存 性

の プロテア

ー

ゼで

あ

る カ ル パ イン は

Z

線の タン パ ク

質

を

分 離 す

ると

考 え

ら れ る 3）24

−

26 ）

。

これ ら はユ ビキ チ ン

_{活 性 化}

・

_{結 合}

・

_{連 結 酵}

素

に よ りユ ビキ チ ン

_化

さ れ

，

ユ _{ビ キ チ} ン

ー

プロテアソ

ー

ム

系

で 処 理 分

解

さ れる

3

）7）

25

）

。

Bodine

ら27）は

_萎

縮

筋

で ユ ビキ チン

ー

プロ テ ア ソ

ー

ム

_{系 が 活 性 化}

_{さ れ て}い るこ と

を 報 告

してい る

。

ま た

，Jones

ら28〕 は ヒ トの

研 究

で

2

週 間の不 動 化 に よる

筋 萎 縮

で

E3

リ ガ

ー

ゼ

を含

めた タン パ _ク

_質

_分

_{解 系}

_の

_{酵 素 活 性}

_{が 上}

_{昇 し}

_{て い るこ}

_{と を報 告}

_{し て} い る

。

本 研 究 で もユ _{ビ キ チ}ン

連 結 酵 素

で

あ

るユ ビ キ チ ン リガ

ー

ゼ

_E3

　mRNA の

測 定

を

行

い

，

萎 縮 筋

で は

有

意 な

増

加

が

認

め ら れ た。

　

タンパク

質

の

新

生

，

修

止

等

の

分 子

シ ャペ ロ ン

作

用 を も つ

HSP72

が

萎

縮

筋

で

減 少 す

る こと が

多

く報

告

さ れてい るn）

6

）12）

29

）

_。

_Ku

_らa〕_は

₁₈

時 間

の

尾 部 懸 垂

でヒラ メ

筋

の

HSP70

が

減 少

してい る こと

を確 認

し

，

後 肢 懸 垂 直 後

か ら タンパ ク

質

合 成が

低

下

す

る こ と

を

示 し た

。

Naito

ら12） は

8H

問

の

尾 部 懸 垂

で

HSP72

が

著

明 に

減 少

し てい る こ と を

報 告

している。

ま

た

，

Goto

ら

29 ）や

先 行

研

究

f｝_にお い て も 尾

部 懸

垂に よ る

萎 縮 筋

で は

HSP72

の

_減

少 が

確 認

さ れてい る。

本

研

究

に おいて

も

HSP72

　mRNA の

低

ドが

観 察

さ れてお

り

，

萎 縮 筋

で は タンパ ク

質 合 成

・

保

護機 能

も

低

下 して い る ことが

示 唆

さ れ るc これ らの

結 果

か ら

，

タン パ ク

質 分 解 系

の

増 加

， お よ び タンパ ク

質 合

成

・

保 護

系

の

低 下

に よる

相 乗 効 果

で

筋 萎 縮

が

生

じ る もの と

考

え ら れる

。

　

そ

こ で

，

廃 用 性 筋 萎 縮

を 予 防

す

る

方 法

と して

，

尾 部 懸

垂 前

の プレコ ンディ ショ ニ ング 運 動 を 試み た

。

運 動

は

HSP72

を

誘 導 す

る こ とが

知

ら れて お

り

6）　9

’

　，　10〕

，

　

HSP72

が 筋 萎 縮 を 抑 制

す る こ と が

示

さ れ て い る 6）12）。

Febbraio

ら

30）_{はヒ ト を 用 い た}

研

究で

運 動

が

HSP72

mRNA を 増 加 させ るこ と を

報 告

してい る。

ま

た

，

　

Naito

ら

12）は

尾 部 懸 垂 前

に

1

時 間

の

温 熱 負 荷

を

行 う

こ と で

HSP72

が

増 加

し

，

8

日 間の尾

部 懸

垂で の

筋 萎 縮 を抑 制

す る 可

能 性

を

示

唆 してい る。

HSP72

が 筋 萎 縮

の

制 御

に 深

く

関 わっ てい る と

考

え

，

プレコ ン デ ィショ ニ ング

運動

で

尾 部 懸 垂 す

る

前

に

HSP72

を

誘 導

して

筋 萎 縮

の

抑 制

が で き ないか と

考

え た

。

そ

の

結 果

，

筋 原 線 維

タ ンパ _ク

_{質 量}

の

低

下 を

減 衰

さ せ るこ と が

可 能

で

あ

る こ と

を先 行 研 究

6〕 で

報告

し た

。

し か し

，

先

行研 究

で は

萎 縮

予

防

の

制 御 機 構

ま で

確 認す

るこ と がで

きな か

っ た。

本研 究

で は プレコ ン ディショニ ング

運 動

の

予 防 効 果

の

制御 機 構 と

して

，

タン パ ク

質

分

解

系

のユ _{ビ キ}チ ンとタ ンパ ク

質合 成

・

保 護 系の

HSP72

に

注

目 して

検 証 を 行

っ

た

。 その

結

果， ユ ビキ チ ン

E3

リ ガ

ー

ゼ mRNA は

萎 縮 筋

よ

り

プレコ ン デ ィショ ニ ン グ 運

動

を

行

っ た

骨 格 筋

で

低

ドし

，

タンパ ク 質 分 解の ユ ビキ チン

ー

プロテ ア ソ

ー

ム

系

の

活 性 化

が

抑

え ら れてい る こ と が

検 証

で

き

た。

ま

た

，

タ ンパ ク

質 合 成

・

保 護

系

の

HSP72

　mRNA は

萎 縮 筋

で

低

ドしてい た が

，

プレコ ンデ ィショニ ング

運 動

で は

HSP72

　

_mRNA

の

低

下 が

抑

え ら れ てい ること が

検 証

で

き

た。

HSP72

は

分 子

シ ャ ペ ロ ン

機

能

を もつ こと か ら

変性 過 程

の タ ンパ _ク

_質

_{と 結 合}

・

_リブ

t

一

ルデ ィング

し

，

機 能 型

タンパ _ク

_質

へ

_{修 復}

_{を サ ポ}

ー

_トS）

す

るこ とで

変性

タ ンパ_ク

_質

の

蓄 積 を抑 制

した と

考

え ら れ る

。

　

これ らの

結 果 か

ら

，

2

週

間の尾

部 懸 垂 前

のプ レコン デ ィショ ニ ング

運動

は

筋

タン パ ク

質 分 解

の

抑

制 と

筋

タン パ ク

質

合 成の

低

下 を

減 衰

させ る こ とが

検

証で き た

。

し か し

，

本 研 究

で

得

ら

れ た 結 果

は

2

週 間の 限 ら れ た 期

間

での

予 防

効 果

で

あ り

，

2

週 間 以

F．

の

尾 部 懸 垂

の

場 合

の

_{変 化}

な どに つ いて

も

，

今後

，

継 時

的 な 変 化 を 観 察 してい く 必 要 も あ る と

考 え ら

れ る。 さ ら に 運

動

強 度 やユ ビ キ チ ン

ー

プロテ ア ソ

ー

ム

系

や

HSP72

な ど を 制 御

す る

他

の

負 荷 方 法

につ いて

も研 究

を

進

め てい く必 要 性 が あ る と考 え ら れる

。

　

謝 辞

：

本 研 究

は

文 部 科 学 省 科

学 研

究

費

基 盤

研 究 （

課 題

番 号

16300188

，

17300187

）

，

萌 芽 研 究

（

課

題

番 号

N工 工

一

Eleotronio _Library

so

-\utik\

17650171),

X4orfi

(t/'vevease15700384,

16700432),

thKtL-CXtuLk.

!

wt

1)

Thomason

DB,

Biggs

RB,

etal:

Protein

metabelism and

beta-myosin

heavy-cbain

mRNA

in

unweightcd soleus

muscle.

Am

J

Physiol

Regutatory

Tntegrative

Comp

Physiol

257:

30e-305,

1989.

2)

Thomason,

DB,

Booth

F"/:

iltrophy of

the

soleus

cle

by

hindlimb

unweighting,

J

Appl

Physiol

68:

1-l2,

1990.

3)

Jackman

RW,

Kandarian

SC:

The

molecular

basis

of

skeletal mvscle atrophy.

Am

J

Physiol

Celt

Physiol

287:

C834-C843,

20e4.

4)

Ku

Z,

Yang

J.

et al./

Decreased

polysomal

HSP-70

rnay

stow

polypeptide

etengation

during

skeletal muscle

phy,

Am

J

Physiel

268:

C1369-C1374,

1995,

5)

Fujino

H,

Kohzuki

H,

et al:

Regrcssien

of capi!tary

work

in

atrophied soteus muscle

induced

by

hindllmb

unweighting.

J

Appl

Physiol

98:

1407-1413,

2005.

6)

eewn-ptE,

l-.Hza.ifi

･

fik

:

7v

Feti-Bma.eut/]oVL.u

;if

I

tx

g =

lf

p'meutth{zaM･[Cffifma

l･:Mt:';-'i

Mblk.

ge"

fii･kt}E

32(7):

400-405,

2005.

7)

Taillandier

D,

Combaret

L,

etal,:

The

role of

proteasome-dependent

proLeolysis

in

the

remodelling of

skeletal muscle,

Proc

Nutr

Sec

63(2):

357-361,

2004.

8)

Beckmann

RP,

Mizzen

LE,

et al./

Interaction

of

HSP

70

with newly synthesized

proteins/

implieutions

for

protein

folding

and assembly.

Science

248{4957}:

850-854,

1990.

9)

Skidmore

R,

Gutierrez

JA,

et al.:

HSP70

induction

in.or

exercise and

hcat

stress

in

rats:rele ef

internal

perature,

Am

J

Physiol

268(1

Pt

2}:

R92-97,

I995,

10)

Milne

KJ,

Neble

EGi

Exercisc-induced

elevation or

HSP70

is

intensity

depe]denl.

J

i'lppt

Physiol

93:

561-568,

2002.

11)

Neufer

PD,

Ordway

GA,

et at.:

Continuous

contractilc

activit>,

induces

fiber

type

specific expression of

HSP70

in

skeletal musclc.

Am

J

Physiol

Cell

Physiol

271:

1828-1837,

1996.

I2)

Naito

H,

Powers

SK,

et al:

Heat

stress attenttates

talmuscle atrophy

in

hindlimb-unweighted

rats.

J

Appl

Physiol

88:

359-363,

2000,

]3)

Uehara

K.

Goto

K,

et al:

Heat-stress

enhances

arive potential

in

rat soleus muscle.

Jpn

J

Physiol

54:

263-271,

2004.

1･D

Morey

ER/

Spuceflight

and

bone

turnover/

corretation

with a new rat model of weightlessness.

Bioscience

29/

168-172,

1979.

15)

Morey

ER,

Sabelman

EE,

et al:

A

new rat model

utating some aspects of space

flight.

Physiologist

22:

S23-S24,

1979.

eg33tsca2e

16)

Chomczynski

P,

Sacchi

N:

Singie-step

method of

RNA

isolation

by

acid

guanidinium

form

extraction.

Anal

Biochcm

162:

156-159,

1987,

17J

I'Iildebrandt

AL,

Neufcr

PD:

Exercise

attenuaies

the

ing-induced

transcriptional

activation of metabolie

genes

18)

19)

20)

20

22)

23)

24)

25)

26)

27)

28)

29)

30)

in

skeletal muscle.

Am

J

Physiol

Endocrinol

Metab

278/

1078-1086,

2000.

Tsika

RW,

Herrick

RE,

et al.:

Interaction

ef compen-satory overload und

hindlimb

suspension on myosin

iso-form

expression.

J

Appl

Physiol

62:

2180-2186.

1987,

Desplanches

D,

Mayet

MII,

et al./

Structural

and

func-tional

responses to

prolon.cred

hindlimb

suspension

in

rat

muscle.

J

Appl

Physiol

63:

558-563,

1987.

Templeton

GH,

Sweeney

HL,

et al,/

Changes

in

fiber

composition of soleus muscle

during

rat

hindtimb

sus-pension.J

Appl

Physiol

65:

1191-1195,

1988,

Siu

PM,

Pistilli

EE,

et al.:

Apoptotic

respenses to

hindlimb

suspension

in

gastrocnemius

musc]es

from

yeung adult and aged rats,

ilm

_J

Physiol

Regul

lntegr

Comp

Physiel

289:

RIO15-RI026,

2005.

Siu

PM,

PistMi

EE,

et al.:

Aging

infiuences

cellular and molecu!ar responses of apoptosis

to

skeletal muscle unloading.

Arn

J

Physiol

Cell

Physiol

288:

C338-C349,

2005.I.eeuwenburgh

C,

Gurley

CM,

et al,:

Age-related

differ-ences

in

apoptosis with

disuse

atrophy

in

soteus muscle,

Am

_J

?hysiol

Regul

Intcgr

Comp

Physiol

288:

R1288-R1296,

2005.

Goll

DE,

Thompson

VF,

et al,:

The

calpain system.

Physiol

Rev

83/

731-SOI,

20e3.

Taillandier

D,

Aurousseau

E,

etal,/

Coerdinate

activation of

tvsosornal,

CaLi'-actix,ated

und

ATP-ubiquitin-depen-dent

proteinases

in

the

unweighted rat soleus muscle.

Biochem

J

316:

65-72,

1996.

Witliams

AB,

Decourten-Myers

GM,

etal:

Sepsis

stimu-lutes

release of myofi]aments

in

sketetal rnuscle

by

a cal-cium-dependent mechanism.

FASEB

J

13/

1435-14.t3,

1999,Bodine

SC,

Latres

E,

et al./

ldentification

ol ubiquitin

tig-ases required

tor

skeletat musc]e atrephy.

Science

294:

1704-1708,

2eOl.

Jones

SW.

Hill

RJ,

et al./

Disuse

atrophy and exercise rehabilitatien

in

humans

profoundly

affects

the

expres-sion of

genes

associated wiih

the

regulation of sketetal muscle mass.

FASEB

J

18:

le25-1027,

2004.

Goto

K,

IIonda

M,

etal.:

Heat

stress

facilitates

thc recos,-er}, of atrophied so]eus muscle

in

rat.

Jpn

J

Physiol

54:

285-293,

2004.

Febbraio

MA,

Koukoulas

I:

HSP72

gene expression

pro-gressively

increascs

in

human

skeletal muscte

during

protonged,

exhaustive exercise,

J

Appt

Pbysiol

89/

1055-1060,

2000.

Japanese Physical Therapy Association

NII-Electronic Library Service

JapanesePhysicalTherapy Association

EffB,fi.M.gBt'

a)

me

ru

DstesM･me

ifnrm

a)

L

tl

}f

)-f

p

fiL

7

v

-

Ak

l･:Ucg-l'

pm

fiU

rt

ve

<Abstract>

81

Inhibitory

Effects

of

Exercise-preconditioning

before

Hindlimb

Suspension

on

Ubiquitin-proteasome

Pathway

Activity

in

Muscle

Atrophy

Hidemi

FUJINO,

RPT,

PhD

Fkieugty

of

IIbalth

Scienee,

Su2uka

U}ziversity

of

Medieal

Sciences

Institute

of

7>'aditional

Mledicine,

Suxuka

Uhiversity

of

MbdicaJ

Sciences

Dqpartment

of

Cardiovascular

Physiology,

Okayama

University

Graduate

School

of

Mledicine,

Dentistr:y

and

Pharmaceutical

Sciences

Hisaharu

KOHZUKI,

MD,

PhD

Dqpartment

of

Cardiovascular

Physiolqgy,

Okayama

U}ziversity

Graduate

School

of

Medicine,

Dentistr)r

and

Pharmaceutical

Sciences

Department

of

Fbod

and

Nutrition,

Ohayama

Gahuin

Uhiversity

Isao

TAKEDA,

RPT,

PhD,

Hiromitsu

TASAKI,

RPT,

MS,

Hiroyo

KONDO,

MS

thcult3,

of

IIbalth

Science,

Suxuha

U}ziversity

of

Mledical

Sciences

Torao

ISHIDA,

PhD

Institute

of

Z-aditional

Mbdieine,

Suzuka

University

of

Mbdical

Sciences

Fumihiko

KAJIYA,

MD,

PhD

Dqpartment

of

Cardiovascular

Pdysiolqgy,

Ok[ayama

Uhiversity

Graduate

School

of

Medicine,

Denttstr),

and

Pharmaeeutical

Scienees

Dqpartment

_of

Mbdical

Engineering

Kdwasahi

Mbdical

School,

and

Kdwasaki

Collage

ofAllied

Health

Proflessions

Exercise-preconditioning

attenuates muscle atrophy

due

to

hindlimb

suspension

{HS).

However,

the

molecular mechanism

by

which exercise-preconditioning exerts

these

effects remains

poorly

understood.

The

present

study

investigated

whether exercise-preconditioning attenuates

HS-induced

muscle atrophy via

inhibition

of

the

ubiquitin-proteasome

_pathway

and whether

heat

shock

protein

(HSP}

mediates

this

inhibition

in

rat soLeus muscle.

Rats

were randomized

to

the

fo11owing

groups:

2-wk

HS,

treadmill

running

before

2-wk

HS,

and aged-matched control,

HS-induced

atrophy was associated with

increased

_proteotysis

{decreased

myofibrilLar

_protein},

upreguLation of components of

the

ubiquitin-proteasome

pathway

(ubiquitin

ligase

E3

mRNA activity) and

downregu}ation

of

HSP72

mRNA

in

the

soleus muscle.

However,

exercise-preconditioning attenuated

HS-induced

atrophy and reduced ubiquitin

ligase

E3

mRNA.

Furthermore,

exercise-preconditioning

did

not

decrease

HSP72

mRNA.

These

findings

suggest

that

exercise-preconditioning att.enuates

IIS-induced

atrophy

through

muscle-specific

inhibitien

of

the

ubiquitin-proteasome

_pathway,

and

is

an effective countermeasure

to

muscle atrophy

induced

by

HS.