要 約：近年，埼玉県の加須市，本庄市において，グリホ サート抵抗性とみられるオヒシバが発生しており，問題と なっている。現地から採種したオヒシバにグリホサートカリ ウム塩を 132 g a.i./10 a 処理するといずれの系統も残草し，抵 抗性個体が含まれると考えられた。一方で，グリホサートと は異なる作用機序をもつ除草剤については，供試した剤（ジ クワット・パラコート，フルアジホップ P，グルホシネート） はすべて有効であり，グリホサートに特異的な抵抗性である と推察された。グリホサート抵抗性を示した個体の遺伝子解 析の結果，採種した系統の一つで，グリホサートの標的タン パク質である EPSPS アミノ酸配列中に日本国内では初確認 である抵抗性型の変異（T102I, P106S）が認められた。また， 遺伝子配列の差異から，少なくとも 2 か所以上の複数箇所で 独立に抵抗性個体群が進化したものと考えられた。 キーワード：グリホサート抵抗性，オヒシバ，EPSPS，埼玉県
緒 言
オヒシバ （Eleusine indica (L.) Gaertn.） は，環境適応性が広 く，増殖速度も早いため，強害雑草の一つとして位置付けら れている（Chen et al. 2015a）。中でも，近年報告が増加して いるグリホサート抵抗性オヒシバは，世界各地で問題となっ ており，日本でも 2015 年に報告されている（永井ら 2015）。 グリホサートは，篩部を介して浸透移行し，植物の生存 に 必 須 で あ る シ キ ミ 酸 経 路 の 重 要 な 酵 素 で あ る 5- Enolpyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase（EPSPS）に結合し， その機能を阻害することで植物を枯死させる（冨永 2015）。 一般的には，グリホサートへの抵抗性は，EPSPS の変異や
EPSPS 遺伝子の増幅に起因するものが多い（Patterson et al.
2018; Gaines et al. 2019）。しかし，ABC トランスポーターの 活性化による排出など（Ge et al. 2010），抵抗性機構によっ ては多剤抵抗性となる可能性もある。そのため，防除方針を 立てる上では機構を明らかにすることが重要となる。
オヒシバにおいても，EPSPS のアミノ酸変異や（Yu et al. 2015; Franci et al. 2020），EPSPS遺伝子のコピー数の増加 （Chen
et al. 2015b），EPSPS 遺伝子の転写量の増加による抵抗性機 構が報告されている（Gherekhloo et al. 2017）。 近年，埼玉県の加須市，本庄市の圃場や非農耕地において， グリホサートに抵抗性とみられるオヒシバが確認されてお り，問題となっている。そこで，現地圃場からオヒシバ種子 を採種し，グリホサートの効果について調査した。
材料および方法
1．現地におけるオヒシバの採種と発生状況調査 オヒシバ採種地点の状況を第 1 表に示した。Sai_1 を採取 した圃場では，水田畦畔の防除にグリホサート含有剤を連用 しており，近年オヒシバの残草が増加してきた。Sai_2 の水 路脇の非農耕地では，管理に約十年以上前からグリホサート 含有剤を連用しており，3 年ほど前から急速にオヒシバが優 占してきた。Sai_3 の圃場では，過去 20 年以上にわたり管理 にグリホサート含有剤を使用しており，2017 年以降にはグ リホサート処理後もオヒシバが残草するようになり，コムギ 作付の準備において作業機に絡まるなど，農作業の支障と なっていた。Sai_4 の圃場は，Sai_3 と同生産者の水田の畦 畔であり，オヒシバが発生していたが，現状では顕著な被害 は確認されていなかった。これらのグリホサート抵抗性と考 えられるオヒシバが問題となっている現地 4 箇所で，2018 年 12 月下旬に採種した。 2．現地で採種したオヒシバへの除草剤処理 採種した種子は常温保存して随時試験に使用した。セル トレイ（6 cm × 6 cm × 深さ 5 cm）にホーネンス培土 3 号 （ホーネンアグリ，新潟） を入れ，オヒシバ種子をトレイ当た り 30 粒ほど播種した。オヒシバの種子は休眠性が強く発芽 率が極めて低いが，機械的な傷をつけることで吸水・発芽が 促進される（Kanzler and van Staden 1984）ため，種子を紙や すりで 10 回ほどこすってから播種した。播種後はグロース キャビネット（コイト電工，神奈川） を用いて，明期 30°C 8 時間，暗期 30°C 16 時間で適宜灌水しながら生育させた。 オヒシバの多くの個体が 3–4 葉期になった播種 28 日後に除 草剤を噴霧処理した。除草剤の処理量は，商品の標準処理量 を参考に設定し，グリホサートカリウム塩（日産化学，東京） 132，396，1320 g a.i./10 a，ジクワット・パラコート（シンジェ ンタジャパン，東京）74・53 g a.i./10 a，フルアジホップ P（石 原バイオサイエンス，東京）77 g a.i./10 a，グルホシネート （BASF ジャパン，東京）204 g a.i./10 a で処理し，対照区とし て水を噴霧処理した区を設けた。処理前に区画ごとの個体数 を計数し，処理 2 週間後に，殺草できなかった生存個体（新 葉が展開してきたもの）を計数した。除草剤処理以降に発生埼玉県内のオヒシバにみられたグリホサート作用点抵抗性
丹野和幸
★ 埼玉県農業技術研究センター玉井試験場 〒360-0853 埼玉県熊谷市玉井 195-1 ★ [email protected] （2020 年 12 月 7 日受付，2021 年 1 月 28 日受理）した後発個体は計数しなかった。以上の処理を各区とも 2 反 復行った。 3．統計処理 同一系統内で処理薬剤の水準に対して，生存個体の割合に 差があるかどうかについて，カイ二乗検定と残差分析によっ て検定した。除草剤処理 2 反復の結果は一括で解析した。 4．オヒシバの EPSPS 遺伝子における抵抗性変異の確認 グリホサートカリウム塩 132 g a.i./10 a 処理区で生存したオ ヒシバから各区 2 個体ずつ選び，緑葉から ISOPLANT（ニッ ポンジーン，東京）を用いて個体別に DNA を抽出した。抽 出のプロトコルはキット付属のものに従った。抽出した DNAを， イントロンを含むオヒシバのEPSPS遺伝子の部分配 列を増幅するプライマー （Ng et al. 2002, F: 5ʹ-GCGGTAGTT GTTGGCTGTGGTG-3ʹ, R: 5ʹ-TCAATCCGACAACCAAGTCGC- 3ʹ）を用いて PCR により増幅した。酵素は Ex Taq（TaKaRa， 滋賀） を用い，98°C 2 分× 1 → 98°C15 秒・55°C 30 秒・72°C 18 秒× 30 → 72°C 7 分× 1 → 4°C 静置のサイクルで行った。 増幅した PCR 産物を精製し，ダイレクトシークエンスを行っ た。シークエンス解析には，Big Dye Terminator v3.1 および ABI 3500（Thermo Fisher Scientific， 東京）を用いた。
結 果
1．採種したオヒシバの除草剤抵抗性 グリホサートカリウム塩 132 g a.i./10 a 処理区では，Sai_1 の供試個体の50％が枯死し，それ以外の系統では全個体が 生存した（第 2 表）。一方で，ジクワット・パラコート，フ ルアジホップ P，グルホシネート処理区では全個体が枯死 した（第 1 図，第 2 表）。そのため，いずれの系統もグリホ サート抵抗性個体を含むと考えられた。また，Sai_2 は， 1320 g a.i./10 a のグリホサートカリウム塩の処理でも生存率 や生育に対する影響が軽微であったため，強いグリホサート 抵抗性を有する個体群を含んでいると考えられた（第 1 図， 第 2 表）。 2．EPSPS 遺伝子における抵抗性変異の有無 グリホサート抵抗性であると考えられた個体のEPSPS 遺 伝子の部分配列を増幅すると，いずれのサンプルでも約 100 bp のイントロンを含む 300 bp ほどの配列が確認された （第 2 図）。 これらの配列をシークエンス解析し，NCBI から取得した グリホサート感受性型のオヒシバの EPSPS 遺伝子配列と アラインメントした。その結果，Sai_2 では，DNA を抽出し 配列を解析した 2 個体の両方に，EPSPS タンパク質の 102 番目のトレオニンがイソロイシンに置換する変異（T102I, ACT → ATT） と，106 番目のプロリンがセリンに置換する変 異（P106S, CCA → TCA）が確認された。オヒシバの EPSPS アミノ酸配列の変異は国内では初報告である。また，イント ロン部分にも 5 bp の挿入が確認され，明らかに他採種地の オヒシバとは由来が違う個体群であると考えられた。一方 Sai_2 水路脇 ― 加須市 LC517087 Sai_3 水田転換畑 コムギ（11～翌 6 月） 本庄市 LC517088 Sai_4 水田畦畔 イネ（5～10 月） 本庄市 LC517089 第 2 表 除草剤処理 2 週間後のオヒシバの生存率 処理薬剤 10 a 当たりの薬量 / 希釈水量 （w/v） 生存個体数 / 供試個体数Sai_1 Sai_2 Sai_3 Sai_4 水 0 g/100 L 10/10 a 10/10 a 16/17 a 30/31 a グリホサートカリウム塩 132 g a.i./25 L 5/10 a 8/8 a 10/10 a 19/19 a 396 g a.i./25 L 6/13 a 5/9 a 15/15 a 20/20 a 1320 g a.i./25 L 0/10 b 6/7 a 9/21 b 4/18 b ジクワット・パラコート 74 g a.i.・53 g a.i./100 L 0/18 c 0/21 b 0/23 c 0/34 c フルアジホップ P 77 g a.i./100 L 0/16 c 0/53 b 0/8 c 0/30 c グルホシネート 204 g a.i./100 L 0/28 c 0/33 b 0/43 c 0/27 c 1）データは除草剤処理試験 2 反復の結果をまとめた合計を示した。 2） 異なるアルファベットが示されたデータは，カイ二乗検定と残差分析の結果有意水準 5％で有意差があったことを示す。なお，検定は同一 系統内で処理薬剤の水準に対して実施した。
で，その他の系統では，解析した部分の EPSPS 遺伝子配列 に変異は確認されず，抵抗性の機構は Sai_2 のものとは異な ると考えられた（第 3 図）。なお，解析した範囲の配列には ダブルピークはみられず，いずれの個体も解析した遺伝子領 域についてホモ接合であると考えられた。
考 察
埼玉県内で発生したグリホサート抵抗性オヒシバ グリホサート抵抗性と考えられるオヒシバが発生した箇所 では，いずれも管理にグリホサート含有剤を連用しており， これによりグリホサート抵抗性個体が優占していると考えら れた。 先行研究では，27 g a.i./10 a のグリホサート処理でオヒシ バのグリホサート感受性個体群は枯死したという報告があ る（Yu et al. 2015）。除草剤処理試験の結果，いずれの系統 でもグリホサートカリウム塩 132 g a.i./10 a（グリホサート 108 g a.i./10 a 当量）では枯死しない個体が確認された（第 1 図，第 2 表）。したがって，これらの個体群はグリホサート 第 1 図 オヒシバの除草剤抵抗性の評価 除草剤処理 2 週間後の写真。 第 2 図 オヒシバの EPSPS 遺伝子の増幅 グリホサートカリウム塩 132 g a.i./10 a 処理区で生存した個体を，各 区 2 個体ずつ個体別に DNA 抽出し，PCR 増幅した。M: 50 bp DNA Ladder（日本ジェネティクス，東京）。いずれの区でも約 100 bp のイ ントロンを含む約 300 bp の配列が増幅された。 第 3 図 オヒシバ EPSPS 遺伝子の部分配列 グリホサートカリウム塩 132 g a.i./10 a 処理区で生存した個体の EPSPS 遺伝子の部分配列を，各区 2 個体ずつ個体別に解析した。一 番上には，NCBI から取得した，グリホサート感受性オヒシバの EPSPS 配列（エキソン部分）を示した。KM387415.1 の配列にある ギャップ部分はイントロンの配列にあたる。解析した配列のアクセッ ション番号は，第 1 表に示した。構は，多剤抵抗性というより，グリホサートに特異的な抵抗 性である可能性が高いと考えられた。 オヒシバのグリホサート抵抗性機構 本研究では， Sai_2 のグリホサート抵抗性オヒシバが T102I と P106S のアミノ酸変異を有することが確認された（第 3 図）。ダブルピークはみられなかったため，ホモ接合で変異 を有すると考えられた。T102I と P106S の変異が同時に起こ ることは TIPS と呼ばれ，グリホサート 1080 g/10 a 処理でも 枯れない強い抵抗性を得るとの報告がある（Yu et al. 2015; Han et al. 2017）。日本での既報のグリホサート抵抗性オヒシ バでは，EPSPS 遺伝子中に変異は確認されなかった（永井 ら 2015）ことから，日本国内ではオヒシバのグリホサート に対する作用点抵抗性は初確認である。 Sai_3， 4 は， グリホサート抵抗性が強い個体群を含んでい ると考えられた（第 1 図，第 2 表）。Sai_2 以外の系統に抵抗 性変異は確認されず（第 3 図），該当塩基にダブルピークは 観察されなかったため，ヘテロ接合で抵抗性アリルを有する 可能性も低い。そのため，今回解析した配列の変異以外の要 因で抵抗性を獲得していると考えられた。 その他のオヒシバのグリホサート抵抗性機構としては，今 回解析しなかった領域における EPSPS 配列中の変異（P381L, Franci et al. 2020）や，EPSPSの発現量が増加するような変異 （Gherekhloo et al. 2017）などが報告されており，こうした機 構によって抵抗性を獲得している可能性がある。また，オヒ シバでは報告されていないが，トランスポーターの活性化に よる液胞への隔離（Ge et al. 2010）といった非作用点抵抗性 である可能性もある。 本研究では採種したいずれの箇所でもグリホサート抵抗性 のオヒシバが存在することが判明したが，Sai_2 とその他の 系統の EPSPS 遺伝子配列は抵抗性に関連する変異だけでな く，イントロン部分にも 5 bp の挿入が確認された（第 3 図）。 したがって，Sai_2 とその他の系統は由来が異なると考えら れ，埼玉県内のグリホサート抵抗性オヒシバは，少なくとも 2 か所以上で独立に抵抗性が進化したものと考えられる。 グリホサート抵抗性オヒシバの防除 現在，グリホサート抵抗性オヒシバの発生は，非農耕地か， 水田または転換畑などの湛水可能な圃場にしか発生していな いが，今後畑地等に拡大した場合，湛水による防除ができず に大きな被害を受ける可能性があり，防除体系について検討 する必要がある。防除については，ブラジルで詳細な圃場試 験が行われている （Takano et al. 2018）。この研究でグリホ サート抵抗性オヒシバに有効であるとされている除草剤のう らのうち水田畦畔に農薬登録がある剤を供試し，いずれも有 効であった（第 1 図，第 2 表）。しかし，グルホシネートに 関しては，単独処理では抵抗性の有無にかかわらずオヒシバ への防除効果が不十分な事例が報告されている（Molin et al. 2013; Takano et al. 2018）。そのため，茨城県の畦畔管理マニュ アルにあるように，水田畦畔に登録のある土壌処理剤と茎葉 処理剤を組み合わせて防除することが有効であると考えられ る（茨城県県北農林事務所 2018）。今後は，特定の薬剤によ る選択圧が上がらないように，複数の作用機序をもつ薬剤を 組み合わせた体系を普及していく必要がある。
謝 辞
本研究を遂行するにあたり，埼玉県農業技術研究センター の志保田尚哉技師，小山浩由技師，宗方淳技師，平野泰志専 門研究員，山本和雄担当部長には調査に協力頂いた。本庄農 林振興センターの根岸勉担当部長，加須農林振興センターの 小澤貴弘担当部長，JAほくさいの富塚賢一営農渉外担当に は，現地情報の提供にご協力頂いた。また，農研機構中央農 業研究センターの内野彰上級研究員には，原稿執筆にあたっ て多くの助言を頂いた。ここに記して感謝の意を表する（所 属は研究当時）。 引用文献Chen, J., H. Huang, S. Wei, C. Zhang and Z. Huang 2015a. Characterization of glyphosate-resistant goosegrass (Eleusine indica) populations in China. J. Int. Agr. 14, 919–925.
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Occurence of target site resistance to
glyphosate in goosegrass (Eleusine indica
(L.) Gaertn.) in Saitama prefecture, Japan
Kazuyuki Tanno
★Summary
Goosegrass (Eleusine indica (L.) Gaertn.) plants suspected to be resistant to glyphosate were collected at four locations in Saitama
prefecture, Japan. Application of 132 g a.i./10 a glyphosate potassium had little effect on viability, suggesting resistant to glyphosate. On the other hand, diquat-paraquat, fluazifop and glufosinate were effective against these goosegrasses. This suggests that mechanism of resistance is likely specific to glyphosate. One of the isolates had glyphosate-resistant mutations (T102I, P106S) in the amino acid sequences of EPSPS, the target protein of glyphosate. This is the first report of target site glyphosate-resistance of goosegrass in Japan. In addition, comparison of EPSPS DNA sequences revealed glyphosate-resistant goosegrass likely occurred independently in multiple regions.
Keywords: glyphosate-resistance, goosegrass, EPSPS, Japan
Saitama Agricultural Technology Research Center Tamai Branch, 195-1 Tamai, Kumagaya, Saitama 360-0853, Japan
