水産生物を模倣した結晶化制御ナノ技術の開発

水産生物を模倣した結晶化制御ナノ技術の開発

著者

村本 光二

水産生物を模倣した結晶化制御ナノ技術の開発

(課題番号13556031)

平成13年度∼平成15年度科学研究費補助金

(基盤研究(B)(1))研究成果報告書

平成16年5月

研究代表者 村本 光二

(東北大学大学院生命科学研究科)

水産生物を模倣した結晶化制御ナノ技術の開発

(課題番号13556031)

平成13年度∼平成15年度科学研究費補助金

(基盤研究(B)(1))研究成果報告書

平成16年5月

研究代表者 村本 光二

(東北大学大学院生命科学研究科)

平成13年度∼平成15年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(1))

研究成果報告書

研究課題 水産生物を模倣した結晶化制御ナノ技術の開発

課題番号13556031

研究組織

研究代表者:

研究分担者:

研究分担者:

研究分担者:

研究分担者:

研究分担者:

村本光二

小川智久

永沼孝子

神谷久男

神保 充

酒井康夫

(東北大学大学院生命科学研究科 教授)

(東北大学大学院生命科学研究科 助教授)

(東北大学大学院生命科学研究科 助手)

(北里大学水産学部 教授)

(北里大学水産学部 講師)

(宮城化学工業(樵)BS研究所 所長)

交付決定額(配分額) (金額単位:千円)

直接経費 亊I

ｨﾆ

N

合計

13,800

13,800

水産生物が作り出す殻(外骨格)や,蘇,真珠などの硬組織は多様であり,超精密

構造を有しながら,その組成は驚くほど単純である｡すなわち,タンパク質や糖質

などからできた基質(マトリックス)を取り巻いて炭酸カルシウムなどの無機分子が

結晶化している｡この生石灰化(バイオミネラリゼ-ション)の機構解明は,基礎生

物科学分野だけでなく,人工骨･歯,人工真珠･殻,半導体基板,触媒や磁性セラ

ミックなどの新素材開発の応用分野で,ナノテクノロジーの基盤となる重要な研究

課題となっている｡生物のバイオミネラリゼ-ションでは,結晶表面における有機

分子と無機分子の相互作用によって,結晶化の制御,つまり結晶の大きさ･形,強

痩,弾力性や張力などの特性の調節が行われていると推測されるが,このような生

物の働きに倣ったバイオミメティックスと呼ばれる人工的な結晶化制御技術は未だ

完成していない｡

結晶表面での有機分子は,結晶核の生成の調節や結晶化の触媒,あるいは結晶の

鋳型として働いていると考えられる｡例えば,炭酸カルシウムのカルシウムイオン

間の距離(4.7Å)とタンパク質のβ-シートの側鎖官能基間の距離(4.96Å)はほぼ等

しく,両者の相互作用を可能にしている｡また,氷の結晶格子間の距離も4.5Åであ

り,極海に棲む魚類の体内では,無機分子の場合に類似した機構により,不凍タン

パク質が氷の結晶核とナノレベルで相互作用して氷の成長を制御していると推測さ

れる.

本研究ではバイオミネラリゼ-ションを,結晶化が行われる場としてのマトリッ

クス分子,結晶となる無機分子,そして結晶化の制御に関わる有機分子の3要素に

分けて,これらの要素の相互関係を吟味することによりナノレベルでの結晶化制御

の技術を開発することを目指した｡

先ず,われわれがこれまで研究してきた水産甲殻類アカフジツボ(Megabalanus

rosa)のリンパ液に主要タンパク質として存在するマルチプルレクチン(BRA-1,2,3)

のバイオミネラリゼ-ションにおける機能性を多面的に調べた｡レクチンは糖鎖認

識結合タンパク質であり,免疫グロブリン様の活性を示すことから,水産生物のレ

クチンは生体防御物質として捉えられてきた｡しかし,われわれは,活性発現にカ

ルシウムを必要とするBRAの構造解析,生体内分布と変動,カルシウムとの相互作

用,さらに過飽和炭酸カルシウム溶液における強力な結晶化阻害作用などから, C

タイプ･レクチンファミリーに属するBRAのバイオミネラリゼ-ションにおける働

きを提案した(Comp. Biochem. Physio1., 107B, 395-399 , 401-409 (1994))｡これ

を支持するものとして, BRAと,ヒトの障臓結石タンパク質や極海に棲むノトセニア

亜目魚属の血液中の不凍タンパク質との構造的相同性や,最近相次いで報告された

ウニの林やアワビの殻におけるCタイプ･レクチンモチーフをもったタンパク質の

発見があげられる｡

甲殻類アカフジツボのリンパ液に含まれる3種類のガラクト-ス結合性レクチン

(BRA-1,2,3)の構造解析を行い, Cタイプ･レクチンに特徴的な2つのSS結合ループ

から形成された糖鎖認識結合ドメインを明らかにした｡このドメイン構造は,バイ

オミネラリゼ-ションと深い関わりを持つ謄臓結石タンパク質や軟骨プロテオグリ

カンにも共通したものであった｡さらにレクチンとカルシウムイオンとの相互作用

を調べ,次のことを明らかにした｡ ①炭酸カルシウムの過飽和状態にあるフジツボ

リンパ液の主要タンパク質はレクチンである② レクチンのカルシウムとの結合定

数は1.4-2.2Ⅹ10 M-1である③ レクチンは体内レベルの1/100以下の0.003 mg/ml

でもカルシウム塩結晶化阻害活性を有する ④蛍光標識レクチンは結晶に取り込ま

れる⑤レクチンの立体構造を破壊すると阻害活性は低下する｡

タンパク質分解物によって腸管における可溶性カルシウム濃度を高め,カルシウ

ムの受動輸送による吸収向上を図ることを目的にして行った｡各種食品タンパク質

を基質特異性の異なるプロテアーゼで分解し,それらの分解物の各種溶媒でのカル

シウム塩結晶化阻害作用を調べた結果から次のことが明らかになった0 ①分解物を

構成するペプチドの化学構造が阻害作用を発現する②ペプチドの酸性アミノ酸ア

ミド体を脱アミド化すると作用が増強する ③食塩やクエン酸,ラクト-スを反応

液に添加すると作用が増強する ④炭酸カルシウムだけでなくリン酸カルシウムで

も阻害作用がみられる⑤阻害作用は,結晶核の生成と結晶の成長の阻止の両方に

因る｡

一方,アカフジツボと近縁関係にあるミネフジツボ(Balanus rostratus)のリンパ

液から単離したガラクト-ス結合特異性レクチンの構造を解析したところ, Cタイ

プ･レクチンファミリーであるにもかかわらず,カルシウム塩結晶化阻害作用を持

たないことが分かった｡フジツボレクチンの構造の比較から,糖鎖認識結合ドメイ

ン内のカルシウムとの相互作用に与るカルポニル酸素を側鎖にもつアミノ酸残基の

密度分布の違いによって阻害作用が変化したと考えられる｡また,レクチン共存下

で生成した炭酸カルシウムの結晶は走査電子顕微鏡下でそれぞれ特徴的な形状を示

した｡特にミネフジツボレクチンでは,窪みを持った円盤状の結晶が観察された｡

さらに,こうしたカルシウム塩結晶化阻害作用を示す有機分子には,マトリック

ス-の結合の有無で全く性質を異にする場合があり,マトリックスに結合すると結

晶化の促進に働くものも知られている｡なお,食品タンパク質分解物のカルシウム

塩結晶化阻害作用の強さは,レクチンBRAの1/10以下(重量比)であり,阻害作用に

おける立体構造の影響も非常に大きいことを明らかにした｡

バイオミメティックスによるミネラルの結晶化制御には相異なる2つのアプロー

チがみられる｡ 1つは,有用な結晶を作り出して新素材を開発する取り組みであり,

半導体やセラミックス-の応用を視野に入れた材料科学やェレクトロニクス分野,

人工骨･歯の再生医療分野でナノテクノロジーの中核として研究が進められている｡

他方は,結晶化を抑える目的での研究である｡カルシウム塩は一般に水に溶け難

く,沈殿や結晶化しやすい｡それゆえ必須栄養素でありながら日本人に不足してい

るカルシウムの腸管からの吸収性を高めるために,カゼインリン酸化ペプチド(CPP)

などが特定保健用食品として使われるなど,食品科学の分野ではミネラルの結晶化

阻害は重要な課題となっている｡また,カルシウム塩の結晶化阻害技術は,歯石の

予防や,液体乳製品のパイプラインの詰まりや各種産業の冷却水配管の缶石予防に

も重要なのものである｡さらに氷結晶生成阻害物質は,極寒域にある動植物にとっ

ては必須のものであり,阻害物質の遺伝子の組み換え導入や添加によって冷害対策

や食品の凍結障害防止などの応用に期待できる｡

ミネラルの結晶の形成は, in vivoでもin vitroでも同一の物理化学的原理に基

づいて行われ,結晶核の形成とその成長からなると考えられている｡この核の形成

機構には,ミネラルイオン濃度が高くイオン集団(クラスター)を作り易くなった均

一核生成と,濃度は低いけれども核の形成の場となる界面が存在する不均一核生成

がある｡本研究で設定した3要素の中で,マトリックスや結晶化阻害タンパク質は

それぞれ,ミネラルイオンと相互作用して不均一核生成の場やミネラルイオンが高

濃度化した空間を作り出して結晶化を制御すると期待できる｡

われわれは,これらの2要素となる,海洋生物のCタイプ･レクチンについて研

究を行い,大腸菌における発現系も確立した｡

本研究ではバイオミネラリゼ-ションを,結晶化が行われる場としてのマトリッ

クス分子,結晶となる無機分子,そして結晶化の制御に関わる有機分子の3要素に

分けて,これらの要素の相互関係を吟味することによりナノレベルでの結晶化制御

の技術開発を試みた｡強い炭酸カルシウム結晶化阻害活性をもつアカフジツボ･リ

ンパ液レクチン(BRA-2)のN末端から39位アスパラギン残基に結合したハイマン

ノース型糖鎖を,グリコペプチダーゼFで除去し, BRA-2のカルシウム塩結晶化阻

害活性,レクチン活性及びタンパク質分解酵素に対する安定性の変化を調べた｡酵

素反応液をコンカナバリンAを固定化したカラムにかけてBRA-2と除糖BRA-2を

分離した｡除糖により BRA-2のレクチン活性及び阻害活性活性は低下し,また分解

酵素に対する安定性が失われた｡これらの実験結果により,従来分かっていたBRA-2とカルシウムイオンの相互作用におけるpH変化の影響のほかに,糖鎖の脱着によ

ってもカルシウム塩結晶化の制御が可能であることが明らかになった｡

アカフジツボの殻底に穴を開け,ゴム片を挿入して殻の修復を追跡した｡数日で

ゴム片表面がクチクラ層で覆われ,その後石灰化が始まって約5週間で完全に穴が

塞がった｡このとき,最初に異物認識に関わる-モサイトにはBRAが結合しており,

リンパ液を緩衝液に換えるとレクチンによって-モサイトが凝集した｡さらに石灰

層の有機マトリックス成分にはBRAが検出された｡

また,マトリックスとしてコラーゲン･ゼラチンとキチン･キトサン,およびそ

れらの修飾体から作製したフイルムを用い,炭酸カルシウムとリン酸カルシウムの

結晶化を行った｡さらに,水産生物のリンパ液に広く含まれるカルシウム依存性レ

クチンタンパク質と,それらをテンプレートにして作製した変異体を有機分子とし

て用いて結晶化実験を行った｡これらの要素を系統的に変化させた時の結晶化速度

を調べ,生成した結晶の物理化学的な特性を分析することにより,結晶化制御の機

構を明らかにし,その制御技術の開発に資する情報を得た｡

このように,従来の研究で蓄積した知見を基に,水産生物のバイオミネラリゼ-ションを模倣して無機分子結晶化の制御や,氷結晶生成の制御に挑む本研究は, 21

世紀の重要課題とされるナノテクノロジーの発展に大きく寄与するものであると考

えている｡

研究発表

[1]学会誌等

氏. Muramoto, D.-H. Jim, Y. Niino, K. Fujiwara, S. Kabuto, T. Ogawa, M. Toda and H. Kamiya: Comparison of the amino acid sequences of acorn barnacle lectins showing different inhibitory activities toward the crystal growth of calcium

carbonate, Fisheries S°i., 67, 703-709 (2001).

H. Tateno, T. Ogawa, K. Muramoto, H. Kamiya, T. Hirai and 帆. Saneyoshi: A novel

rhamnose-binding lectin family from eggs of steelhead trout (Oncorhynchus

mykiss) With different structures and tissue distribution, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(6), 1328-1338 (2001).

T. Ogawa, T. Shirai, T. Yamane, H. Kamiya, and K. Muramoto: Adaptive evolution of conger eel galectins. TI:ends in Glycoscience and Glycotechnology, 14, 177-187

T. Shirai, Y. Matsui, C. Mitsuyama, T. Yamane, H. Kamiya, T. Ogawa, and K. Muramoto: Crystal structure of a conger eel galectin (Congerin II) at 1.45 A resolution: Implication of the accelerated evolution of a new ligand-binding

site following gene duplication. ∫. Mol. Bio1., 321(5), 879-889 (2002).

N. Shiina, H. Tateno, T. Ogawa, K. Muramoto, M. Saneyoshi, and H. Kamiya:

Isolation and characterization of L-rhamose-binding lectins from chum salmon

(oncorhynchus keta) eggs. Fisheries S°i., 68, 1352-1366 (2002).

H. Tateno, Y. Shibata, Y. Nagahama, T. Hirai, M. Saneyoshi, T. Ogawa, K. Muramoto,

and H. Kamiya: Tissue-specific expression of rhamose-binding lectins in the

steelhead trout (Oncorhynchus mykiss). Biosci. Biotechnol. Biochem. , 66(6),

1427-1430 (2002).

H. Tateno, T. Ogawa, K. Muramoto, H. Kamiya, and M. Saneyoshi: Distribution and

molecular evolution of rhamose-binding lectins in Salmonidae: Isolation and

charcterization of two lectins from white-spoted charr (Salvelinus leucomaenis) eggs. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(6), 1356 1365 (2002).

H. Tateno, T. Yamaguchi, T. Ogawa, K. Muramoto, T. Watanabe, H. Kamiya, and M.

Saneyoshi : Immunohistochemical localization of rhamose-binding lectins in the

steelhead trout (Oncorhynchus mykiss). Develop. Comp. Immuno1. , 26(6),

543-550 (2002).

H. Kamiya, M. Jimbo, H. Yako, K. Muramoto, 0. Nakamura, R. Kado, and T. Watanabe: Participation of the C-type hemolymph lectin in mineralization of the acorn barnacle Megabalanus rosa. Marine Biology, 140, 1235-1240 (2002).

T. Ogawa, C. Ishii, Y. Suda, H. Kamiya, and K. Muramoto: High-level expression and characterization of fully active recombinant conger eel galectins in Eschericia coli. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(2), 476-480 (2002).

H. Tateno, T. Ogawa, K. Muramoto, H. Kamiya and M. Saneyoshi: Rhamnose-binding lectins from steelhead trout (Oncorhynchus mykiss) eggs recognize bacterial lipopolysaccharides and lipoteichoic acid, Biosci. Biotechnol. Biochem. , 66(3), 604-612 (2002).

M. Jimbo, F. Nakanishi, R. Sakai, K. Muramoto, and H. Kamiya: Expression of the

antitumor-antibacterial glycoprotein aplysianin A in E. Coli. Fisheries S°i. ,

H. Yako, M. Jimbo, R. Sakai, N. Takamatsu, T. Shiba, K. Muramoto, and H. Kamiya: Multifunctional of the acorn barnacle Megabalanus rosa hemolymph lectins.

Fisheries S°i., 68(Suppl. ⅠⅠ), 1127-1130 (2002).

村本光二,舘野浩章,小川智久,神谷久男:海洋動物レクチンの構造と機能の多様

悼,化学と生物, 41(6), 379-388 (2003).

T. Ogawa, S. Yonemaru, T. Naganuma, ∫. Hirabayashi, K. Kasai, and K. Muramoto:

Strong induction of apoptosis of T cell lines by conger eel galectins.

Proceedings of the ISBC 2003. Ed. By Scientific committee of ISBC 2003. Maruzen co. Ltd. (Tokyo). p. 134-137 (2003).

T. Ogawa, T. Shirai, C. Shionyu-Mitsuyama, T. Yamane, H. Kamiya, andK. Muramoto:

The speciation of conger eel galectins by rapid adaptive evolution.

Glycoconjugate ∫. , 19, 451-458 (2004).

T. Yamane, Y. Niwa, Y. Miyabe, C. Shonyu-Mitsuyama, K. Kondo, A. Suzuki,

T. Ogawa, K. Muramoto, H. Nakamura, M. Sato, Ⅰ. Yoshizaki, A. Yamanaka,

and M. Ataka: Refinement of crystallization conditions for the crystal growth

crystals. ∫. Jpn. Soc. Microgravity App1., 21, 52-62 (2004).

K. Yoshimi, M. ShoJ'i, T. Ogawa, A. Yamauchi, T. Naganuma, K. Muramoto,

and S. Hanada: Microstmcture and orientation distribution of aragonite

crystals in nacreous layer of pearl shells. Materials Transactions, in press.

[2]口頭発表

H. Tateno, T. Ogawa, K. Muramoto, H. Kamiya, and M. Saneyoshi: Structure and

function of a novel rhamose-binding lectin family from fish eggs. 19th INTERLEC,

25-30 March, 2001, Fortaleza, Brazil.

K. Muramoto, H. Tateno, T. Ogawa, and H. Kamiya: Structure and function of marine animal lectins. 15t Symposium of the Protein Society. Philadelphia (USA),

2001. 7. 28-8. 1.

H. Tateno, K. Muramoto, and H. Kamiya: Structures and functions of marine animal

lectins. International Commemorative Symposium 70th Anniversary of the Japanese

Society of Fisheries Science, Yokohama, 2001. 10.卜10. 5.

椎名信之,舘野浩章,小川智久,村本光二,実吉峯郎,神谷久男:魚類ラムノース

2002.4.4.

T. Ogawa, T. Naganuma, ∫. Hirabayashi, K. Kasai, H. Kamiya, and K. Muramoto: Carbohydrate binding specificity of conger eel galectins. 20th INTERLEC, 20-25 May, 2002, Copenhagen (Denmark).

T. Ogawa, T. Shirai, C. Mitsuyama-Shioi, T. Yamane, H. Dohi, Y. Nishida, K. Kobayashi, H. Kamiya, andK. Muramoto: Adaptive evolutionof conger eel galectins

to emergence of a new structure class and unique carbohydrate binding activity. 20th INTERLEC, 20-25 May, 2002, Copenhagen (Denmark).

A. Konno, T. Ogawa, and K. Muramoto: Comprehensive mutation analysis of carbohydrate-binding specificity of conger eel galectins.第76回日本生化学

会大会(横浜) 2003. 10. 15-18.

T. Ogawa, T. Sannohe, K. Muramoto, and S. Hattori: Novel C-type lectins from

skin mucus of moray eels with distinct specificities for fucose or sialic acid

moieties.第76回日本生化学会大会(横浜) 2003. 10. 15-18.

Y. Ohno, T. Naganuma, T. Ogawa, and K. Muramoto: Effect of lectins on the transport of food ingredients in Cac0-2 cell cultures. The 3rd International Conference on Food Factors: Physiologic Functins and Disease Risk Reduction,

1-4 December, 2003, Tokyo.

松原裕樹,中原直子,小川智久,村本光二,神保充,神谷久男:アカフジツボレク

チン糖鎖修飾部位の構造と機能,平成16年度日本水産学会大会(鹿児島) 2004. 4. 1-5.

寺田尚友,小川智久,村本光二,神谷久男:魚類卵由来ラムノース結合特異性レク

チンのSS結合･糖鎖修飾部位の同定,平成16年度日本水産学会大会(鹿児島)

今野歩,伊藤由麿,小川智久,塩生(光山)くらら,白井剛,村本光二:進化工学に

よる魚類ガレクチンの耐熱化とその構造要素の解析,日本農芸化学会2004年度大会

坂本泰隆,三戸貴公,小川智久,村本光二,服部正策:ウツボ体表粘液由来C-タイ

プレクチンの構造と機能及び大量発現系の確立,日本農芸化学会2004年度大会(広

[3]シンポジウムの開催

Symposium

Current topics on marine invertebrates -Biominerali2ation, etc.･

(バイオミネラリゼーションを中心にした海洋無脊椎動物における最近の話題)

日時:10月8日(火) 13:00-17:00

場所:東北大学農学部第2講義室

プログラム:

13:00-13: 10 開会挨拶

Chair: Koji Muramoto (Graduate School of Life Sciences, Tohoku Umiversity)

13 : 10-13 : 40 Mineralization of the cuticle of the blue crab, Callinectes sapidus :

Background, morphologiCalaspects,and permeability changes

Robert D･ Roer (Department of Biological Sciences, University of North Carolina

Wilmington) ---I---I---"____ 1∼56

(Reprints)

13 : 40-14 : 10 Mineralization of the cuticle of the blue crab, CaZlinecEes sapidus :

Bi∝hemistryand molecular genetics

TY10maS II･ Sharer (Department of Biological Sciences, University of NorthCarolina Wilmington) 一一一一一一一一一一一一一-一一一一一一一一一一一一一-一一一一-一一一一一-一一-一一一一---一一-____ト56

(Reprints)

14 : 10-14 : 40 Structureand function of matrix proteins inthe calcified tissues of

Americancrayfish, Procambarus clarkii

Hiromichi Nagasawa (Graduate School of Agriculturaland Life Sciences, University of

Tokyo) 一一-一一一-一一----一一---一一一一一-一一一一--一一-一一一一一-一一一一日…_____ 57_99

(Reprints)

14 : 40-14 : 55 Molluscanhardtissueand itsroleinlife

Kenji Okoshi (Department of Biotechnology, Ishinomaki Senshu University)

14:55-15:10 休憩

Chah: Tomohisa Ogawa (Graduate School of Life Sciences, Tohoku Umiversity)

15 : 10-15 : 25 Dramatic change offree D-amino acids during embryonic and larval development of marine invertebrates

MinoruSato (Graduate School of AgriculturalScience, Tohoku University) --I I 35

(Abstract)

15 : 25-15 : 40 Molecular biology ofDrosophila chemosensory reception

Kunio Isono (Graduate School of lnfbrmation Sciences, Tohoku University)

---I--I---MH-- 136- 147 (Reprints)

15 : 40∼15 : 55 Participation ofhemolymph lectins in mineralization ofbarnacle

Eisao Kamiya (School of Fisheries Sciences, Kitasato University) --- 1 48- 160 (Reprints)

15 : 55-16 : 10 Characterizationand cloning of soft coral lectin

MitsuruJimbo (School of Fisheries Sciences, Kitasato University) I---- 161-170 (Reprint)

16 : 10-16 : 25 Hemolymph lectins ofshellfish

Takako Naganuma (Graduate School of Life Sciences, Tohoku University) -- 17 1 (Abstract)

16:25-16:55 総合討論

16:55-17:00 閉会挨拶

17:00-19:00 懇親会

世話人:神谷久男(北里大学水産学部),村本光二(東北大学大学院生命科学研究科)

Tel&Fax 022-7 1 7-8807 ; muramoto @biochem･tohoku･ ac JP

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