はじめに
平成 24 年度の微生物サーベイは、資料問題 2 問、 Photo Survey10 問を出題しました。資料問題は、CLSI の方法に準じて薬剤感受性試験を実施すると正しい 判定になる MRSA 株を用い、感受性結果の回収をしま した。Photo Survey 問題は、問題数が例年の倍の 10 問となりましたので、一般細菌、嫌気性菌、真菌、 寄生虫と広範囲にわたって出題しました。中でも、 24 年度の夏期微生物研究班研修会にて、腸管感染症 を取り上げましたので、その中から感染症法 3 類・ 全数届出の菌種を含めた 3 問を出題しました。その 他の問題も鏡検と患者情報からポイントを絞って推 測できる菌種を中心に問題作成を行ないました。 実施項目 同定 感受性 菌種推定 試料問題 (資料 41) ◎ ◎ 試料問題 (資料 42) ◎ Photo Survey 問題 1~9 ◎ Photo Survey 問題 10 評価外 問題 ◎ :評価対象問題 参加施設数 試料問題 23 施設 Photo Survey 22 施設 試料の取り扱い 1.カルチャースワブにて送付いたしました。 2.試料到着後はできるだけ速やかに適切な培地に塗 り広げてください。 3.以下の患者データを参考に同定と設問に答えてく ださい。 *生菌ですので、感染には十分注意して下さい。 資料問題 試 料 41 女性が庭でケガをし、数日後に受傷部は化膿した。 感染部位に強い痛みを感じたことから受診した。 ①培養により、同定された微生物の菌種をコード より選択してください。 ②薬剤は ABPC、CEZ、VCM 3剤の薬剤感受性 試験を行い、S. I、R で判定・回答してください。 同定検査評価 評 価 菌 名 件 数 比 率 A MRSA 20 91% D St.aureus Clostoridium 1 1 9% ①感受性試験結果 ABPC MIC 測定装置 MIC 値 判 定 回答数 RAISUS 4 R 5 マイクロスキャン 8 R 4 バイテック2 4 R 1 IS60 2 8 R R 1 1 用手法 ≦8 4 ≧16 R R R 1 1 1 MIC:μg/ml ディスク拡散法 直 径 判 定 回答数 センシ ディスク 15 13 R R 2 1 KB ディスク 15 11 R R 1 1 SN ディスク 14 R 1 阻止円直径:mm CEZ MIC 測定装置 MIC 値 判 定 回答数 RAISUS ≦8 ≧8 R R 4 1 マイクロスキャン ≦8 >8 R R 2 1
微生物検査
浅野 裕子
≦2 R 1 バイテック2 ≦4 R 3 IS60 ≦4 =2 R R 1 1 用手法 ≦4 ≦1 R R 1 1 MIC:μg/ml ディスク拡散法 直 径 判 定 回答数 センシ ディスク 23 22 R R 1 1 KB ディスク 25 S 1 阻止円直径:mm VCM MIC 測定装置 MIC 値 判 定 回答数 RAISUS =1 ≦1 S S 2 3 マイクロスキャン ≦1 ≦2 =1 S S S 1 1 1 バイテック2 ≦0.5 S 3 IS60 ≦1 S 2 用手法 ≦4 =1 S S 1 1 MIC:μg/ml ディスク拡散法 直 径 判 定 回答数 センシ ディスク 17 18 S S 2 1 KB ディスク 12 S 1 阻止円直径:mm ②薬剤感受性検査 評 価 判 定 施設数 比 率 A ABPC R 23 100% A D CEZ R CEZ S 20 1 95% A VCM S 21 100% ブドウ球菌は、以下の方法で同定を進めます。 ① マンニット食塩培地発育 ②コアグラーゼ試験(ウサギプラズマ凝集) ③MRSA選択培地発育・卵黄反応確認 ④薬剤感受性試験(微量液体希釈法)における MPIPC と CFX の MIC 値 *MPIPC および CFX のどちらか一方でも「R」と 判定された場合は MRSA と報告する この資料問題の株は、培養時間が短い場合 MPIPC の MIC 値が低値となり、MSSA と判定される菌株です。 CLSI の基準に従って 24 時間で培養・判定した場合 は MPIPC の MIC 値は 4~8 µg/ml の「R」となり、 MRSA と判定されます。今回は、1 施設で MSSA と判定 されていました。該当施設は培養時間に注意が必要 です。 さらに、mecA の低レベル発現や PBP の変異など MRSA の判定を見落とさないために CLSI では、 M100-S20 にて MPIPC および CFX 試験に関するコメン トが明確になりました。:CFX および MPIPC の両剤を S.aureus もしくは、S.lugdunensis に対して試験し、 いずれかの結果が耐性の場合、その菌は MPIPC 耐性 として報告する。と記載されています。上記に CLSI の判定基準を記載しましたので参考にしてください。 また、MIC 値の結果報告に際して、濃度以上の表記 は、「>」を使います。「≧」は使いません。記載ミ スには、注意が必要です。 試 料 41 45 人が参加した昼食会で出されたケータリング 食により食中毒が発生した。食事をした 30%のヒト が、食後 3 時間で吐き気をもよおし、嘔吐した。保 健所は、チキンライスから、この菌を分離し、原因 菌であると発表した。培養を行ない、食材の菌検索 し、原因と思われる菌種をコードより選択してくだ さい。 同定検査評価 評 価 菌 名 件 数 比 率 A Bacillus cereus 23 100% ポイント:「チキンライス」と「食後 3 時間で吐き 気」から Bacillus cereus が疑われます。菌は太い GPR で連鎖を成します。分枝はなく偏性好気性~通 MRSA の CLSI の判定基準 MPIPC : R ≧4 S ≦2 CFX : R ≧8 S ≦4 MPIPC : ≦10mm CFX : ≦21mm ・CLSI の MRSA 測定基準 接種菌量 McF No.0.5 を 10 倍希釈 培養温度 35℃ MPIPC の培養時間 24 時間 試料41 の MRSA 株 ABPC の期待値 2 ~ 8 µg/ml VCM の期待値 0.5 ~ 2 µg/ml MPIPC の期待値 4 ~ 8 µg/ml CFX の期待値 8 ~16 µg/ml
性嫌気性です。カタラーゼ陽性、Metronidazole 耐 性で有芽胞の Closutoridium と区別がつきます。 Photo Survey 症例 1~9 の患者背景、検査データを、Photo を添 えて出題します。推定される菌名を菌名マスターか ら選んでください。 Photo Survey 設問 1 患者背景:70 代男性。3 か月前から、右耳のべたつ きを感じ、自分の声が聴きにくくなったことから耳 鼻科を受診された。右鼓膜に黄色膿瘍の付着があり、 発赤と軽度浮腫があった。 【細菌検査】提出された耳漏の培養から真菌が発育 した。サブロー寒天培地に巨大集落を形成させたと ころ、 写真 1-1 のごとく発育した。 写真 1-1 巨大集落 サブロー寒天培地 35℃48 時間 写真1-2 1. 同定検査評価 ポイント:サブロー寒天培地 35℃、2 日目、黒 色の巨大集落が発育しました。 Aspergillus 属は、下記の図1に示すように、顕微 鏡による各微細構造の形状、大きさが種の同定のた めの指標になっています。問題は、以下の鑑別点か らAspergillus niger と推察されます。 図1.病原性を示すAspergillus の模式図 病原真菌学(南山堂)より引用 Aspergillus nigerの形態的特徴は、頂嚢が大型で球形 あるいは、亜球形 45~75μm と大きいことから顕微鏡・× 100 で観察可能である。フィアライドとメツラは 2 段で頂 嚢全体を覆っている。分生子は球形刺状突起を有し、直径 3.5~4.5μm。本菌種は、ブドウ、コーヒー豆などに危害 引き起こすことが問題になっている Aspergillus flavus は、頂嚢はフラスコ型で直径 25 ~45μm、コロニーは、最初黄色、のちに黄緑から青緑コ ロニーです。頂嚢の 1/2 から1/3 にメツラ、フィアライ ドを形成する。1) ムコールの巨大集落 サブロー寒天培地 30℃、5 日間養 7日間培養 接合菌Mucor は寒天培地上、速やかに綿菓子用コ ロニーを作るので、これだけでも他の糸状菌と鑑別 できる。その他に形態学的特徴は、幅の広い(6~15 評価 菌 名 件数 比 率 A B Aspergillus niger Aspergillus sp. 18 2 91% C Aspergillus flavus 1 5% D Mucor sp 1 5%
Aspergillus flavus Aspergillus flavus
Aspergillus niger
ラクトフェノール・コットンブルー染色 ×100
μ)無隔菌糸をつくる・有性胞子として接合胞子を 無性胞子として胞子嚢胞子を作る. 文 献 1)矢口貴志:Aspergillus属:文化財の虫菌害:59 号、2009 2)山口英世:病原真菌と真菌症 南山堂 Photo Survey 設問 2 患者背景:60 代男性。1か月前から、抗癌剤治療に より入院中。 CZOP 投与中であったが、悪寒と吐き 気、38.3℃の発熱があった。 検査値は、WBC 9160 、Hb 8.6g/d 、Pt 45.8 万、CRP 4.92mg/dl。 血液培養は、48 時間後に陽性となった。グラム染色 と後日の培養コロニーは以下のごとくであった。 写真2-1 血液培養 35℃、48 時間培養陽性、 グラム染色×1000 写真2-2 クロモアガーカンジダ培地、48 時間培養 2.同定検査評価 ポイント:CHROMagar Candida 培地は、カンジダ 属の主要菌種を色別に分けられる培地です。 培地中のクロムペプトンをカンジダが分解し発色 する。CHROMagarTMは Dr A. Rambach が登録商標を持 っているもので、クロモアガーの BD 製も関東化学製 も同じ色調変化を示し 37℃で 48 時間培養し、色調 で判定します。C,glabrata は、発芽管を形成しない ので、血液培養の中では、伸びたものは見られない ことなども鑑別ポイントです。 ① Candida albicans
Green with paler edges(エメラルドグリーン) ② Candida glablata Dark pink(濃い八重桜
のような色) Photo Survey 設問 3 患者背景:60 歳代女性。咳と 38.7℃発熱があり、紹 介受診された。 検査値は、WBC 9920 /μl、Hb 7.6g/d 、Pt 29.5 万 /μl、CRP 9.64mg/dl。 右下肺野中心に肺炎像があり、喀痰のグラム染色が 至急で依頼された。喀痰グラム染色は写真のごとく であった。 写真3-1 喀痰のグラム染色×100 写真3-2 喀痰のグラム染色×1000 3.同定検査評価 評価 菌 名 件数 比 率 A Candida glablata 19 86% B Candida sp 2 9% C Candida albicans 1 5%
ポイント:鏡検時に白血球は、淡紅色に染色されて いるか?細菌の観察は、染色性、形態、配列、貪食像、 量を判定。炎症細胞浸潤と菌体の貧食像があれば、起 炎性は高いと考えられます。喀痰は、100 倍で鏡検、 Geckler の分類はグレード5、次に 1000 倍で観察し、 グラム陽性双球菌、莢膜が抜けて染色されており、 肺炎球菌が推察できます。 Photo Survey 設問 4 患者背景:60 代男性。海外出張から帰国後、発熱と 腹痛を発症。血液培養と便培養を実施したところ便 から写真 4-1.4-2 の菌が発育した。生化学的鑑別性 状は、写真 4-3 のごとくであった。 推定される菌名をコード表より選択してください。 写真4-1 DHL 寒天培地 35℃、24 時間培養 写真4-2 SS 寒天培地 35℃、24 時間培養 写真4-3 生化学的性状検査 4.同定検査評価 ポイント:海外出張から帰国後、発熱と腹痛 ・SS寒天培地上、中心部が極わずかに黒色 ・TSI 凝固水部分が僅かに黒色 ・以下の生化学的性状により推察されます。 この設問に対して Vi 抗原を確認してから判定、回答 することを考えると“Salmonella sp”も正解とし ました。 【TSI】 斜面:乳糖および白糖非分解のため赤色 高層:ブドウ糖分解により黄色を示す。硫化水素 は産生されるが、高層上部または凝固水部分が僅 かに黒色となるのみである。境界線に硫化水素、 ガス非産生 【シモンズ・クエン酸】 培地の色調が変化しない。 (緑色)クエン酸塩を炭素源として利用しない 【LIM】リジン:陽性、(紫色)リジン脱炭酸反応 運動性:培地の混濁が認められる。運動性が弱い 場合や、認められない場合もある。 インドール:陰性。Kovacs 試薬を添加しても色の 変化はない。 確認検査 チフス菌:Vi血清、O 血清を用いてスライド凝 集反応を行なう。Vi血清にのみ凝集するかあるい はVi血清に凝集し、しかもO因子血清(O9)にも 凝集するときは、被検菌はVi抗原を持つ菌である と判定する。Vi抗原は易熱性抗原であるから、 121℃、20~30 分加熱後、加熱死菌がVi血清に凝 集しなくなることを確認する。加熱死菌はO9には凝 集する。稀にVi抗原を持たない株があることに注 意する。 届け出 腸チフス患者と診断した場合には、法第12条第1項 の規定による届出を直ちに行わなければなりません。 評価 菌 名 件数 比 率 A Streptococcus pneumoniae 22 100% 評価 菌 名 件数 比 率 A Salmonella Typhi 20 91% (A) Salmonella sp. 1 5% D Proteus sp. 1 5%
Photo Survey 設問 5 患者背景:50 代女性。下痢を発症。便培養をしたと ころ写真5-1、5-2 のごとくコロニーが発育した。生 化学的鑑別性状検査は、写真5-3 のごとくであった。 推定される菌名をコード表より選択してください。 写真5-1 DHL 寒天培地 35℃ 24 時間培養 写真5-2 SS 寒天培地 35℃、24 時間培養写真6-1 写真5-3 生化学的鑑別性状検査 35℃、24 時間培養 5.同定検査評価 ポイント:以下の生化学的性状により推察されます。 【TSI】: 斜面:乳糖および白糖非分解のため赤色 高層:ブドウ糖非分解により赤色を示す。硫化水 素は 産生される素、ガス非産生 【シモンズ・クエン酸】 培地の色調が変化しない。 (緑色)クエン酸塩を炭素源として利用しない 【LIM】リジン:陽性、(紫色)リジン脱炭酸反応 運動性:培地の混濁が認められる。運動性があり 試薬添加後、インドール陽性。運動性は陽性 SS 寒天培地上では、乳糖非分解で中心部が黒色で Salmonella のコロニーと似ています。本菌は海水、 淡水いずれにも生息しているので、ヘビ、両生類な どの消化管や魚類から分離されています。ヒトへは 下痢を主症状とする腸管感染症が 8 割を占めるとさ れており、検体は便、胆汁、創傷などから分離され る。まれに壊死性菌膜炎の報告3)、4)もあります。 Photo Survey 設問 6 患者背景:40 代男性。東南アジア出張から帰国の 1週間後、38℃以上 の高熱が続いた。比較的徐脈 で、脾腫、便秘の症状を呈していた。 血液検査と便検査を実施したところ便から写真6-1、 6-2 の菌が発育した。生化学的鑑別性状試験は、写 真6-3 のごとくであった。 写真6-1 DHL 寒天培地 35℃ 24 時間培養 写真6-1 SS 寒天培地 35℃、24 時間培養 写真6-3 生化学的鑑別性状検査 35℃、24 時間培養 評価 菌 名 件数 比 率 18 86% A Edwardsiella tarda Edwardsiella sp. 4 18%
6.同定検査評価 ポイント:東南アジア出張から帰国 ・SS寒天培地上、透明 ・血清型別は、O群血清O2 ・以下の生化学的性状により推察されます6)。 【TSI】 斜面:乳糖および白糖非分解のため赤色 高層:黒変なし。ガス産生。 【LIM】リジン: 陰性、黄色。運動性:培地 の混濁が認められる。 インドール:陰性。Kovacs 試薬を添加しても 色の変化はない。 【シモンズ・クエン酸】培地の色調が変化しない。 (緑色) ヒトにチフス症を起こす菌は、チフス菌(S. Typhi)とパラチフスA菌(S. ParatyphiA)があり、 3類感染症に分類される。チフス菌は食物、水など とともに体内にとり込まれ、回腸下部に付着し、そ こで感染、増殖するとともにリンパ管を介してリン パ節に侵入し、ついで胸管を経て血流中に入り、脾 臓、肝臓、骨髄、腎臓など身体各部に伝播する。 ―腸チフスの経過と菌の検出― 潜伏期:5~14 日。平均7~8 日。この期間は菌が腸 リンパ節で盛んに増殖しているが、そこか ら糞便中に排出される。菌数は少ない。 初期(第1週):リンパ節からリンパ管、血流を介 して菌が各臓器に伝播されはじめる。体温 が徐々に上昇し4~5 日で40℃台に達する。 この期間は菌が血中に濃厚に存在する。(血 液培養)極期(第2週):発熱が続く。尿、 便中にはあまり菌は認められない。バラ疹 も著明となる。 緩解期(第3週):脾臓、肝臓、腎臓などの病巣の 菌が尿中に排出されるため尿の培養を行なう。 肝臓に侵入した菌はそこで増殖し、胆汁と ともに腸管内に排出されるので、第2週の 終わり頃より菌は糞便からも検出されるよ うになる。(血液、尿、便培養)徐々に回 復期に入る。尿中の菌が減少し、菌の排出 は糞便への経路が主体となる。(便培養) 病期によって検査対象となる検体が違ってきます。 文 献 3)原賢寿ら.E.tarda 敗血症による腓腹部に限局した 筋膜炎・・臨床神経学 2009:51.9 5)西山秀樹ら.壊死性筋膜炎を伴ったE.tarda感染症 の 1 例.日本臨床微生物学会誌 2007:17.130 6)国立感染症研究所 病原体検査マニュアル Photo Survey 設問 7 患者背景:80 代男性。海釣りが趣味でよく出かけて いた。釣り針が手に 引っ掛かり負傷したが、そのま ま放置していたところ、腫脹と疼痛の症状が現れ、 受診となった。細菌検査に出された膿瘍に抗酸菌が 認められた。推定される微生物名をコードより選択 してください。 写真7-1 膿瘍のチールネルゼン染色×1000 写真7-2 ポイント ・海釣り中での受傷部分の膿瘍 ・小川培地では、27℃で発育、 35℃で初代発育しない ・光照射後に黄色 7.同定検査評価 M, kansasi も 、M, marinam と同じく光発色性の 菌ではあるが、M, marinam のコロニーはスムース型 M, kansasi ラフ型が多く、対象疾患は、呼吸器系感 染が多く、中でも肺上葉に好発し空洞を伴うことが 多い。 hoto Survey 設問 8 患者背景:山のサマーキャンプに参加した小学生が 帰宅後、1 週間近く 胃腸の異常が続いた。症状とし 菌 名 件数 比 率 A Salmonella Paratyhi A 22 100% 菌 名 件数 比 率 A Mycobacterium marinam 20 91% C Mycobacterium kansasi 2 9% 3%小川培地 27℃ 10 日間培養 光照射前 光照射後
ては、痛みを伴う膨満感と柔便であった。 便を直接、鏡検すると多数の虫体が見られた。推 定される微生物名を コードより選択してください。 (写真提供:岐阜市民病院、一柳先生) 8.同定検査評価 ポイント ・感染経路 : 汚染された湖や河川水中の嚢子を 摂取したことから、感染した と考えられる。 ・血液液の混じらない水溶便 ・栄養型は左右対称の洋ナシ型で、常時 2 核で、 4 対の鞭毛がある。 文 献 7)国立感染症研究所 感染症情報センター 感染症の話 Photo Survey 設問 9 患者背景:30 代男性。1 週間ぐらい前から咽頭痛が あり、次第に痛みが 増して食事ができなくなったこ とから、耳鼻咽喉科を受診し、扁桃周囲膿瘍と診断 された症例。口蓋弓が発赤、腫脹、一部黄変して自 壊しそうな状態であったことから、穿刺、多量の膿 汁が吸引された。グラム染色は、写真 9-1 のごとく 針状の GNR が認められた。推定される微生物の菌名 をコードより選択してください。 写真9-1 写真9-2.3 ブルセラ HK-RS 寒天培地 HK 半流動生培地 35℃ 3 日間培養 9.同定検査評価 ポイント ・ 塗抹検査で針状の GNR ・ HK 半流動生培地で嫌気性菌を疑う ・ブルセラ HK-RS 寒天培地。直径1mm ぐらい の白いパンくず状コロニーが発育した。 ・ 紫外線照射をすると黄色の蛍光色を発した。 (インドール 陽性) Photo Survey 設問 10 評価対象外問題 患者背景: 70 代男性。腎盂腎炎の診 断にて入院。 前医にて LVFX が投与され、当院、救急外来にて CTRX が使用され、入院となった。CTRX 投与前の血液と尿 菌 名 件数 比 率 21 95% A Giardia lamblia Giardia sp. 1 5% 菌 名 件数 比 率 18 82% A Fusobacterium nucleatum Fusobacterium sp. 3 14% D Flavobacterium sp. 1 5% 写真8-1 グラム染色にて針状 GNR×1000
の細菌検査からは、翌日、大腸菌が分離された。 写真10-1 表10-2.薬剤感受性試験結果(MIC:μg/ml) 【 設問 10】以上のデータを見て正しい項目を選択 してください。 a.感染対策として手洗いの遵守、処置時のガウン 使用など接触予防策を行った。 b.耐性遺伝子は、染色体上に存在しているため、 グラム陰性桿菌の間で伝搬する可能性がある。 染色体 プラスミド ESBL の遺伝子は、多くはその由来がプラスミド媒 介性のペニシリナーゼであったため、接合伝達によ って腸内細菌科の同一あるいは異なる菌種間で遺伝 子が伝達していくと考えられる。 c.「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に 関する法律」によって、症例の診断が確定した場 合、保険所に届ける必要がある。 必要ある 必要ない d. 救急外来での CTRX 投与により、翌日には解熱 したため、今後も CTRX1 日 1 回の投与を継続した。 CLSI の M100-S22 の基準 MIC のブレイ クポイントを採用:CTRX1g/日投与なら 継続してよい e. CFPM の MIC 値は 2μg/ml であった。判定は「R」 とした。 CLSI の M100-S22 の基準であれば R に しなくて良い CFPM は、1g×4 日または、2g×3/日 CFPM は 1g を 12 時間の標準量ではなく 2g 8 時間毎 の高用量なら効くとの報告もある8)。 文 献
8)Antimicrob Agents Chemother. 2003;47:3442–7
今回の 2010 年 CLSI ドキュメントでのブレイクポ イントの変更は、抗菌薬について用法容量の制約も あり、米国と日本でその基準が異なることや、ESBL のスクリーニングテストを実施しなかった場合、報 告時に ESBL の記載がなくなる。院内感染対策面で の問題もあり、今回の変更をすべて導入することは 難しい。基準の変更は重要な問題であり、検査部門 および臨床と話し合い、どこまで導入していくかを 決めていかなければいけないので、この問題は、評 価対処外とした。 ま と め 今年度の Photo Survey は、 正解率 92%以上、資料問 題 91%以上で良好な結果 でした。 今年度の夏期の微生物 班研修会は、腸管感染症を 取り上げました。よって腸 管感染症問題 3 問は、95% から 100%と高い正解率で した。来年度も研修会の内 容を網羅して、真菌、嫌気 性菌、寄生虫など、さらに 広い範囲から問題を出題 したいと考えています。 より、多くのご施設のご 参加をお願い致します。 ABPC >32 CPZ/SBT ≦1 CEZ >32 FMOX ≦1 CTM >32 MEPM ≦1 CTX >32 IPM ≦1 CAZ 2 LVFX >16 CFPM 2 AZT 4 正解率 設問 41 同定・感受性試験 91 % 設問 42 同定 100 % Photo 設問 正解率 設問 1 91 % 設問 2 95% 設問 3 100 % 設問 4 95 % 設問 5 100 % 設問 6 100 % 設問 7 91% 設問 8 95 % 設問 9 95 % CPDX(10μg/ml)、 CAZ(30μg/ml)、 CTX(30μg/ml) の 単 剤 と clavulanic acid (CVA)を添加した ディスク拡散法に よる確認試験