Author(s)
庄, 得鳳
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(農学) 甲第592号
Issue Date
2013-03-13
Type
博士論文
Version
publisher
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/47975
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。緒 言 第一章 且朋〟喝伽rαの根腐病抵抗性の遺伝機構 第1節 凡望〟呵わ川の根腐病抵抗性遺伝 l.材料および方法 供試植物 供試菌株 根腐病抵抗性検定 褐変度の判定 再分離 2.結果および考察 第2節 鳳椚〟喝伽′αの根における抗菌性物質の探索 l.材料および方法 14 供試植物および供試菌株 根からのフェノール化合物の抽出 抽出物の菌糸伸長抑制検定 結合型フェノール抽出物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分離 2.結果および考察 第3飾 バラ根腐病抵抗性物質のバラ間差異 1.材料および方法 供試植物 根の採取とフェノール化合物の抽出 HPLCによる結合型フェノール化合物の分離 23
2.結果 結合型フェノール化合物0)HPLC分析 各ピーク面積における主成分分析 3.考察 結合型フェノール化合物のHPLC分析 各ピーク面積における主成分分析 第二章 バラ根腐病抵抗性を持つ且ワ〟喝助川のDNAマーカーの開発 1.材料および方法 供試材料 DNA抽出 RandomAmplinedPolymorphicDNA(RAPD)分析 SequenceCharacterizedAmpli丘edRegion(SCAR)分析 且椚〟JJ抑)rα特異的バンドの回収 ライゲーション(Ligation) 形質転換(rItansfbrmation) コロニーPCR PCR産物の精製 シーケンスPCR シーケンスの解析およびプライマーセットの設計 設計したプライマーの汎用性の確認 2.結果 RAPD分析 R.multiPora特異的遺伝子の解明とSequenceThggedSite(STS)化 SCAK16プライマーの汎用性の確認 3.考察 5$
第三章 且`PEXcongel,と且朋〟喝伽rαとの交雑後代の特性 第1飾`PEKcougel,とR.朋〟叩わrαとの交雑後代の獲得 l.材料および方法 供試材料 殺菌 培地 順化 倍数性検定 雑種判定 2.結果および考察 第2飾`PEKcougel,×4倍性`MatsⅦ血imaNo.3,の交雑後代の特性 l.材料および方法 供試植物 .供試菌株 根頭がんしゆ病抵抗性検定 発根特性および切り花品種との接ぎ木親和性の検定 2∴結果および考察 第四草 月.′柳∫α(ハマナス)とR.椚〟上村わ′αとの交雑後代の特性 第1節 且r昭〃∫αのバラ根腐病抵抗性検定 l.材料および方法 供試植物 方法 2.結果および考察 第2節 鳳川即朋と鳳刑〟喝伽′αとの交雑後代の特性 1.材料および方法 91 109 2.結果および考察 第3節 且r昭〃∫αとR.椚〟呵わrαとの交雑個体をR.′喝〃∫αに戻し交雑した後代の
特性 総合考察 要 旨 Abstract 謝 辞 引用文献 114 122 12` 130 133 135
緒 呂 バラの栽培の歴史は古く,紀元前においてもその記述が ある.そのころからバラは観賞植物と して人々の関心を引 き,選抜が繰り返されてきた.バラの育種が劇的に進んだ のは人工交雑が利用された18世紀以降で,観賞価値を高め るために花形,花色,芳香,樹勢などの形質を求めて交雑
や選堺.が行われ,現在では数万品種が登録されている(鈴
木,1996) 日本においても種苗法が整備されて育種家の 権利が保護されるようになったことから,国内での新品種 の作出も増加傾向にある. 育種において,鑑賞価値を高めるための育種と同様に病 害に対する抵抗性育種は非常に重要な要素である.抵抗性 品種の作出は,農薬散布回数の減少など栽培の省力化や環 境保全､型農業の推進につながる.バラ生産において重大な硬害をもたらす病害に,根頭がんしゆ病とバラ根腐病が挙
げられる.どちらも土壌伝染性病害であり,根部または地 際部から感染する病害である.そのため抵抗性台木を育成 し,台木を用いることで,穂木における抵抗性の有無に関 わらず防除が可能となる. バラ根頭がんしゆ病はRhizobiumradiobacter(Beijerinck and van Delden1902)Young etal.2001により引き起こされ
る多犯性の土壌病害であり,一度感染すると植物体全体が 汚染されるため,感染後の防除がほとんど不可能である.
この菌に感染 した植物は,根も しく は地際部にこぶ状の Gallを形成し,新芽の発生不良やブライ ンドシュートの発 生,貧弱な開花枝の発生がみられ,樹勢が低下する.この ため,バラ切り花生産に.おいては採花数が減少するなど被 害が大きい(周 ら,1999) 根頭がんしゆ病に対して 月0∫α`PEKcougel,が高い抵抗性 を示すこ とが明らかとなっており(周 ら,1999),この抵 抗性形質は後代に遺伝すること も明らかとなっている(周 ら,2000) `PEKcougel,の根頭がん しゆ病抵抗性は,凡 rαdブ0∂αCJer が植物体の傷害部位を感知するフェノール物質 の一種の アセト シリ ンゴンの生合成能力 が低 く,凡 rαdブ0∂αCJerが傷害部位に誘導されないこと(Tan ら,2004) や,傷害部位の細胞壁表面にレクチン様タンパク と推定さ れる繊維状物質が分泌されて,菌の付着を阻害する こ と (Tan ら,2005)などが関与している.
バラ根腐病は Pythium helicoides Drechslerにより 引き起 こされる水媒性の病害である.P.力eJブcoブde∫は宿主植物に感 染する と菌糸を伸ばして宿主植物の柔組織を壊死させる. そのため,感染した植物は根の褐変や腐敗を引き起こ し, 下葉から次第に黄化して枯死すると と もに,遊走子によっ て次々 と伝搬して多大な被害をもたらす(Kageyama ら, 2002) PγJカブ〝椚 属菌は土壌伝染性病害のひとつであ り,卵菌 類に属し,菌糸を伸ばして宿主植物に進入して柔組織を 壊死させる.また,PγJカメ〟椚 属菌は多犯性で,多く の作
物で根腐病や立ち枯れ病を引 き起こ している.これら の 耐久生存器官は卵胞子や遊走子の う で,柔組織の残液中 や土壌中に遊離して存在してお り,ある一定の温度条件 と湿度条件を満た した場合に発芽 して根に付着 し,増殖 して胞子の う や卵胞子を形成する(景山･宇井,1980). また,水分の多いと ころでは遊走子が形成され,水に媒 介して他の宿主植物へと感染する.感染後に組織は壊死 するため,その組織に対して別の菌によろ二次的感染が 起こ り 枯死に至る.P.力eJブcoメde∫の特徴と して比較的高 温性である こ とが挙げられ,これが夏季に集中 して発病 する大きな要因となっている(Kageyamaら,2002) R.multiflora'Matsushima No.3'(ノ イ バラ`松島3号') はバラ根腐病に対して高い抵抗性を示すことが明らかとな
っている(Liら,2007a) `Matsushima No.3,のバラ根腐病 抵抗性の発現は感染の初期段階ではなく,菌糸が表皮組織 や内部組織に侵入する段階で発現し,根組織内での菌糸伸 長が抑制されていることになる(Liら,2007b) 一植物は病原菌の侵入を受けると防御反応を発現し,バラ 科植物では傷害によって誘導された酵､素反応によってタン ニン類が加水分解され,抗菌活性物質が遊離される こ とが 知られている(橋床･田原,1997) また,キュウリのう どんこ病(Faweら,1998)やオリーブの疫病(DelRio ら, 2003)において,フェノール化合物が菌糸伸長を阻害する こ とが報告されている.バラ の根頭がん し ゆ病および根 腐病抵抗性の作用機構については未解明の部分がある
が,根内部におけるフェノール化合物が関与する と推定さ れ(柘植,2007),特に根腐病については二次代謝産物が 深 く 関与 している と 考えた. 交雑個体からの病害抵抗性個体の選抜に当たって,これ らの抵抗性に関わる物質の量的発現に基づいて行う こ とが 可能である.根腐病抵抗性に関わる物質は,酸分解を経て 得られる結合型フェノール画分に含まれるこ とが分かって おり,本研究ではこれらの物質について検討を行った. Liら(2007a)は,根腐病抵抗性検定方法と して挿し木後 の接種と病徴発現による評価を用いているが,この方法は 挿し木から評価終了まで1か月以上要し,病徴発現の評価 には研究者の主観が入りやすいことから,物質レベルでの 選抜基準の確立は抵抗性個体の選抜に大き く貢献するもの と考える. 同様に,交雑個体からの病害抵抗性個体の選抜に当たっ て,罷病性個体を評価判別す る こ と も 可能で あ る. 』タカα〝0椚γCe∫属菌においては,休眠状態にあった病原菌の各 種耐久生存器官が宿主の特異的物質に反応して賦活化する 事例があり,A.raphaniKendrickはカンランが分泌するイン ドールー3-アルデヒドに,A･euteichesDrechs･f.sp.PisiPfend. & Hag･はエンドウの根が分泌するプルネチンに,また,d. COChlioides Drechslerはテンサイの地際胚軸やホウ レンソ ウ 根部に分泌される 5一ハイドロキシー6,7-メチレンジオキシフ ラボンに感応して遊走子が誘引され感染する(横沢･国永, 1979;Yokosawa ら,1986,1988;堀尾ら,1991) これら
のこ とから,バラの根においても遊走子を賦活化させるフ ェノール物質が存在するこ とが推定されたため,本研究に おいては罷病性個体の評価についても検討した. 本研究の 目 的 と して,根頭がん し ゆ病抵抗性を持つ `PEKcougel'と バ ラ 根 腐 病 に 対 し て 抵 抗 性 を 持 っ `Matsushima No.3'を交配し,両病害に対する複合抵抗性を 持つ台木の作出することと したが,交配後代の交雑性を検 定する必要がある.従来より行われている交雑性の検定方 法には形態学的,生理学的,発生学的な表現形質による方 法があるが,これらの形質は環境要因に左右されやすく, 交雑性の検定を行う上で研究者の主観が入りやすく,信頼 性の高い交雑判定を行う ことが困難であった. 近年の分子生物学の発展に伴って遺伝子を使った検定が 行われ始め,本研究でもこの手法の導入を試みた.本研究 における遺伝子を使った検定法と しては,`Matsushima No･3'は一季咲きであり,`PEKcougel,は四季咲きである形質 から,`pEKcougel'の遺伝子を検定する場合には四季咲き形
質に関する遺伝子(片∫Ⅳ遺伝子)を指標にして検定する方∫Ⅳ
プライマーを用いた(岩田,2004) このプライマーは `PEKcougel'が花粉親の場合には雑種判定が可能となるが, `Matsushima No.3'が花粉親の場合には検定が不可能であっ た･そこで本研究では,乱調〝JJブ′Jorαの根腐病抵抗性の遺伝 機構を調査するとともに,月.椚〟JJブ′Jorαを識別できるプライ マーの開発を試みた.第一章 凡 椚〟JJげJ〃川の根腐病抵抗性の遺伝機構 根腐■病抵抗性の月.椚〟J才げJorαとバラ根頭がんしゆ病抵抗 性の`PEKcougel,とを交配し,複合抵抗性台木の育成を行う に当たり,各々の抵抗性形質が後代に遺伝することが確認 できている必要がある.`PEKcougel,の持つ根頭がんしゆ病 抵抗性形質についてはZhouら(2001)が既に検討しており, `PEKcougel'と罷病性品種`Dukat,との正逆交雑後代に遺伝 することを確認している･しかし,凡 例〟J′≠′Jorαの根腐病 抵抗性形質については遺伝特性が明 らかになってお ら ず,根腐病抵抗性台木の育成のためは,この解明が不可 欠 で あ っ た. そこで本章では,凡研〝J〆げJorαの根腐病抵抗性の形質遺伝 特性を調査するために,凡椚〟JJげJorαと血縁関係にある品 種について根腐病抵抗性の形質調査を行った.また,根 腐病抵抗性に関わる と考えられる根内部のフェノ ール 化合物(柘植,2007)についても調査した.
第1節 点.椚〟〃力け"用の根腐病抵抗性遺伝 月.椚〟JJげJorαの根腐病抵抗性形質の遺伝特性を明 ら か にするために,月.朋〝JJブ′Jorαとの血縁関係にある品種を用 いて抵抗性の調査を行い,根腐病抵抗性の遺伝について 検討 した. 1.材料および方法 供試植物 供試植物として,月.椚〟J〆げJorαと血縁関係にある 23種類 のバラ(第1-1表)を岐阜県立花フェスタ記念公園より提供 を受け,応用生物科学部附属岐阜フィールド科学教育研究 センター農場のガラス温室で栽培して実験に供試した.こ れらのバラについては,血縁関係を指標化するために 月.
multiflora を100%と し て 血縁度(Relatedness with R. multiflora)を算出した･算出例とLして,R.'TapIS Volant, の交配系譜がSeedling(R･luciae xUnknown)×Seedling(R. multiflora x Ballerina)となっていることから,血縁度の算 出は 0+50/2 = 25%のように種子親と花粉親と分けて 月. 椚〝Jオブ′Jorαとの血縁度を計算した. これらのバラに加えて,過去の根腐病抵抗性が評価され ている`MatsushimaNo･3',R.'Nakashima91,('中島91,),
R･`Fashion Parade',R･Odorata,R.'Dr.Huey,および岐阜県 内から採取した月.椚〟JJブ′Jorαを加えた29種類を供試した. 供試菌株 P･如/∼coブde∫ の中で,比較的安定して病害感染能力を持 つ菌株B5(Kageyamaら,2002)を用いた. 根腐病抵抗性検定 Liら(2007a)の報告から,挿し木1か月後の`Nakashima 91'の根でバラ根腐病が発症し,`Matsushima No.3,が抵抗性 を示したことから,挿し木1か月後の根を供試材料とした. PH調整済みピートモス培養土(BM-2,Berger)とパーライ トを2‥1で混合した培養土を充填した200穴セルトレイに, 充分に伸長したシュートの中央部から採取した1節を挿し 木し,人工光閉鎖型苗生産装置(苗テラス,太洋興業)を 用いて温度25℃,湿度90%以上,4,0001Ⅹ,24時間照明下 で発根させた･挿し穂の基部には,0.5%インドール酪酸粉 剤(バイエルクロツプサイエンス)を処理した. 接種源は Waterhouse(1967)の Glassblade法を用いて 作成した･Corn MealAgar(CMA)平板培地上に供試菌 株を含んだゲルブロックを中心に置床し,その周辺にあ らかじめオートク レーブし･た芝の切片を同心円状に並 べ,25℃で 24 時間培養を行った.蒸留水と岐阜大学構 内の貯水池の水を 2‥1で混合したものをろ過し,オー トク レーブをかけた培養液に芝の切片を浮かべ,25℃で
さ らに 24 時間培養し,その後血球計算盤を用いて遊走 子数を計測し,6.0×103 個になるよ う に調整した遊走子 懸濁液を接種源と した. 接種方法は,第ト1図のような接種装置を作製して挿 し木後1か月間育苗し,充分に発根したものをセルト レ イごとバットに入れた.バットの排出口を閉じて遊走子 懸濁液を 5cmの水深まで満たし,1時間浸漬して菌を感 染させた･1時間の感染後,排出口を開いて遊走子懸濁 液を 3 Lの養液タンクに混合した.その後養液を1日 4 回,2分間バット内に 5cmの水深まで満たして潅液を行 った･接種およびその後の感染は 30℃で行い,1週間後 にセルト レイから植物体を堀上げ,根を水洗して根の褐 変度を調査した･また,対照区と して遊走子懸濁液を接 種しないで養液を潅液した無接種区を設け,同様に調査 を行っ た. 褐変度の判定 根の褐変程度は,根の褐変状態に基づいて判定した. 褐変状態は 7 段階の褐変指数で評価し,0‥ 根腐がまっ たく起きていない健常な白色根,0.5‥根の一部分が薄く 褐変している状態,1‥根の一部分が褐変している状態, 1･5‥ 根の 50%が褐変している状態,2‥ 根の 75%が褐変 している状態,2･5‥根が全体にわたり褐変しているが, 地上部が枯死していない状態,3‥ 根はすべて褐変し, 地上部も枯死している状態と し,褐変度は以下の式よ り
算出 した. 褐変度(%) ∑(指数×個体数) 供試個体数×指数の最大値 ×100% また,上記の式により算出した褐変度から,罷病性品 種`Nakashima 91,の褐変度を基準に相対褐変度を算出し た･算出方法は,`Nakashima 91,の褐変度を1と定め, `Nakashima 91'の褐変度で他のバラの褐変度を割る こ と に よ り 算出 した. 抵抗性は相対褐変度の値に基づいて,3 つの段階に分け た;<0･60‥ 抵抗性,0･60-0.99‥ 中程度抵抗性,1.00<‥ 梶病 性. 再分離 根腐病がP･如才血メde∫の伝染から起こされたかどうかチ ェックするために,P･如Jね0ブde∫の再分離を行なった.根は 水道水で用土を洗い落とし,根の表面の水をろ紙で取り除 いて,病害を備えた根の部分を5mmのセグメントへ切り取 り,Pythium選択培地AP2(CMA+5mg･L-1pimaricin+100 mg･LLlagrimycin+50mg･L-1pentachloronitrobenzene)(景 山･宇井,1980)上に置床し,30℃･暗所で24時間培養して, 病原菌の存在を確認した. 再分離率(%)=∑(Pγ才力≠〟研を分離された根のセグメント /総根のセグメント)/供試個体数×100%
2.t結果および考察 褐変した根からP･如才如才de∫が再分離されたことから, 接種の7日後に観察されたすべて中根の褐変がタ.如才ブcoブde∫ の感染によって引き起こされたことが確認できた.29種類 のバラの相対褐変度は 0.16∼1.52 までの範囲に分布した (表1-2) 岐阜県内から採取した野生種凡 椚〟J′≠′Jorαの相対褐変度 は0･47を示し,根腐病に対して抵抗性を示すことが明らかと なった･月･研〟J′ブ′Jorα からトゲなし台木として選抜された `MatsushimaNo･3,･R･multifloraの変種(variant)cathayensis および月･椚〟JJげJorαの品種(rorma)cα川eαはいずれも褐変 度が0･26･0･34,0･27と低く,根腐病抵抗性が確認できた. このことから,根腐病抵抗性は凡 椚〝JJげJorα固有の特性で あった･花色とバラ根頭がんしゅ病抵抗性の関係の報告が あった(Brownら,1923;周ら,1999)･乱用〟J〆げJorαとの 血縁度が100%であった3種類のバラは白色からピンク色ま での花色変異があったことから,これらの花色の形質と根 腐病抵抗性形質は連鎖していなかった. 凡 椚〟J′げJorαとの血縁度が50%以上の品種は5品種あり, これらの褐変度は0･86から0･44までに分布しており,抵抗
性と中程度抵抗性に分痙された.月.椚〝〃り甘"Ⅷとの血縁度が
明らかとなっている 21種類のバラの褐変度をみると,乱 用〟J′ブ′Jorαと同等の抵抗性を示すものから梶病性と判断で きるものまで連続的な分布が見られた.この結果から,Lindeら(2004)が述べているバラうどんこ病にみられるように, 根腐病抵抗性因子は単一の優性,あるいは劣性の遺伝子に 支配されるものではなく,複数の遺伝子に支配されている と推定された･これはDengら(2005)が報告したカラジウ ムのP･myriotylumDrechslerに対する根腐病抵抗性と一致し ている･また,月･椚〟/オブ′Jorαと 50%の血縁度のバラについて みると相対褐変度に大きな差が見られた.これらのバラに ついて相対褐変度と交配組み合わせとの関係をみた結果, 種子親,花粉親にかかわらず高い褐変度と低い褐変度を示 すものがみられ,このことから 月･椚〟J′ブ′Jorαの抵抗性因子 は細胞質遺伝様式ではなく,核遺伝形質であると判断でき た. 凡椚〟J′ブ′Jorαとの血縁度が50%以下のバラについて,相対 褐変度が`Veichanblan,の0･31から`Goldfinch,の1.52まで分 布した･血縁度と相対褐変度との関係を第1_2図に示した. 月･刑〟JJげJorαとの血縁度が低くなるほど,相対褐変度は高く なり･特に血縁度が 25%以下になると相対褐変度は急速に 増加する傾向が認められた･しかし,血縁度が同じ値のバ ラにおいても相対褐変度のバラツキは大きくなり,血縁度 が低くなるに従って相対褐変度が大きい個体が現れる傾向 がみられた･また,凡 例〟JJブ′Jorαが複数回交配されている
25%の`Dance de Feu,や 6.25%の`Veilchenblau,は R.
刑〟J′ブ′Jorαの相対褐変度と類似していたことから,交雑後代
の中から抵抗性が有する個体を選抜することも可能と考え
乱用〟JJげJorαと血縁がなく,ロックウール栽培で最も多く 用いられている台木月.odorαJαの相対褐変度は0.92であっ た･R･Odol･u[aのffl)k系譜はR･Chi"e"SisJacq･･1∼･giga77Iea Collett ex Cr6pinと推定されており,その交配親のいずれも が中国南西部の高地に自生しており,高温に対して抵抗性 が低いと推定される･従って,高温性の タ.カeアブc∂ブde∫の菌 糸伸長に最適な条件では生育が衰え,抵抗性が弱いと考え られる(大川,1999)･また,凡朋〟Jオブ′Jorαとの血縁度が不 明な`Fashion Parade,と`Dr.Huey,の相対褐変度は0.42およ び0･16であり,抵抗性を示した.`Dr.Huey,は一般的に台木 と して用いられているバラであるが,今回の検定結果では 凡 例〟Jオブ′Jorαと血縁関係にないものの強い抵抗性を示した. このことから根腐病抵抗性には 凡 椚〟J′ブ′Jorαとは別の抵抗 性メ ガニズムがある こ と が示唆された.一方`Fashi｡n parade'については,ミニチュアローズ品種であることから, その育成の過程で月･椚〟J′ブ′′orαが関与していると推定され, 凡椚〟J′げJorαの抵抗性形質が付与されていると考える. 本節で用いた検定方法は環境要因の影響を受けにくい方 法ではあるが,季節の影響を完全に除去することは難しい. 各バラの褐変度を実験反復ごとに詳細に検討した結果,実 験反復ごとで褐変度が大きく異なる事例が認められた.そ こで,罷病性バラ品種と判定されている`Nakashima 91,を 対照と して供試して相対褐変度を算出し,実験反復ごとの 誤差を小さくすることでこの間題を解決した.
第 2飾 凡例〟JJげJ〃川の根における抗菌性物質の探索 植物は病原菌の侵入を受けると防御反応が生じ,キュウ リのうどんこ病(Faweら,1998)やオリーブの疫病(DelRi｡ ら,2003)ではフェノール化合物が菌糸伸長を阻害するこ とが報告されている･凡椚〟J′ブ′Jorαのバラ根腐病抵抗性に関 係するフェノール化合物についての報告はないものの,月. 椚〟J′げJorα にはフェノール化合物のカテキン重合体(橋床･ 田原,1997)やケンフェロール誘導体のマルチフロリン A (丸山ら,2009)などのフラボノール配糖体の存在が明ら かとなっており,これらの物質がバラ根腐病抵抗性に関与 している可能性が考えられる. そこで本節では,ノイバラの根に含まれるバラ根腐病菌 の菌糸伸長抑制物質の存在を検証するために,抵抗性の `Matsushima No･3'と 罷病性の ミ ニチュ ア ロ ーズ品種 `Nakashima91'の根からフェノール化合物を抽出し,抽出物 の菌糸伸長抑制効果を検討した. 1.材料および方法 供試植物および供試菌株
供試植物として,バラ根腐病抵抗性を示す`Mats｡Shima
No･3,と碍病性を示す`Nakashima91,を用いた.バラ根腐病菌株は,P.如ノブcoブde∫B-5を用いた. 根からのフェノール化合物の抽出 挿し木は前節と同じ方法で･行った.発根した苗を流水で 洗浄した後,根を切断して表面の水を取り除き,生体重を 計量して約10倍量の 80%エタノール中で磨砕した. フェノール化合物の抽出は,Faweら(1998)の方法を参 考にした･磨砕エタノール懸濁液を暗所,4℃で2日間静置 してエタノール可溶性成分を抽出した.磨砕エタノール懸 濁液を濾過し,エタノール層をロータリーエバボレータで 減圧濃縮した後,pH 2.0 に調整し,石油エーテルを加えて 振と う した.石油エーテル層の不飽和脂肪酸を取り除いた 後,水屑に等量の酢酸エチルを加えて振と う し,酢酸エチ ル画分と水溶性画分に分けた. 酢酸エチル画分はロータリーエバボレータで減圧乾固し, 根5g(r･W･)･mL■1となるように99%エタノールで溶解した ものを遊離型フェノール抽出物とした.水屑画分は 4 Nの 塩酸を等量加えた後,100℃で1時間熱処理して加水分解し, 冷却後に酢酸エチルを等量加えて振とう し,酢酸エチル画 分を得た･酢酸エチル画分はロータリーエバボレータで減 圧乾固し,根5g(f.w.)･mL,1となるように99%エタノール に溶解して結合型フェノール抽出物とした(図1_3) 抽出物の菌糸伸長抑制検定 P･カピノブcoブde∫B-5を CMA培地で増殖させ,シャーレ上の
タγ才力ブ〟椚選択培地 AP2(景山･宇井,1980)を分注したシャ ーレの中心に置床した. シャーレの
4隅に･遊離型フェノール抽出物,暗合型フ
ェノール抽出物あるいは後述の HPLC 甲ピーク分取画分を マイクロピペットで 5 甚ずっ滴下し,30℃･暗所で培養し て12時間ごとに写真撮影した(図ト4) 撮影画像の菌糸 伸長領域を画像処理ソフトウェア(AdobePhotoshop5.5)で 範囲指定し,葉面積測定ソフトウェア(LIA for win32,名 古屋大学)を用いて菌糸拡散面積を算出した.シャーレの4 隅に99%エタノールを5甚ずっ滴下したものを対照区とし た･フェノール化合物の抽出は3反復行い,菌糸伸長抑制 検定もそれぞれ 3反復行った. 結合型フェノール抽出物の高速液体クロマトグラフィー (ⅡPLC)による分離 結合型フェノール抽出物をHPLC(LC-8020ModelII,東 ソー)で分離した･カラムは分離カ ラム COSMOSIL 5C18-MS-II型(4･6×250mm)(ナカライテスク)を用いた. 溶離液は2%酢酸-アセトニトリルを用い,溶離液のアセト ニトリル濃度を 0%から 40分後に 40%とするアセトニトリ ル濃度勾配を用いた.検出は300nmで行った. `Matsushima No･3,と`Nakashima 91,のクロマトグラムか ら･両バラ間で差異のみられたピーク(A)に着目し, `Matsushima No･3,および`Nakashima91,のピーク(A)の物型フェノール抽出物を根30g(r.w.)･mL 1となるように99% エタノールに溶解し,分取カラムCOSMOSIL5C18_MS_II型 (20×150mm)を用いてピーク(A)を分取した.溶離液は 上述の分離カラムでの条件と同じとし,アセトニトリル濃 度を 0%から 40分後に 40%とするアセトニトリル濃度勾配 を用いた･根からの抽出および分取は 3 回反復した.分取 した試料を蒸発乾固し,99%エタノールで根 30g(f.w.)･ mL 1となるように溶解して菌糸抑制効果の検定試料とした. 99%エタノールをシャーレの4隅に5ドLずっ滴下し,対照 区とした･菌糸伸長抑制検定は,分取試料ごとに 3 回行 っ た. 2.結果および考察 `Matsushima No･3'の根から抽出した結合型フェノール抽 出物と遊離型フェノール抽出物について,菌糸伸長抑制効 果を検定し,第1-5図に示した･接種72時間後の対照区の 菌糸拡散面積は4,787mm2で,シャーレ全面に菌糸伸長がみ られたのに対して,遊離型フェノール抽出物の菌糸拡散面 積は2,661mm2と有意に小さかった.また,結合型フェノー ル抽出物を滴下した培地では,菌糸の伸長がほとんど認め られず,菌糸拡散面積は､36mm2で,対照区および遊離型フ ェノール抽出物に比べて有意に小さかった.
菌糸伸長がほとんどみられなかったことから,`Matsushima No･3'の根にはバラ根腐病菌の菌糸伸長を強く抑制するフェ ノール化合物が配糖体の型で含まれていることが明らかと なった･フェノール化合物は植物体内では低毒性の配糖体 として存在しており,植物体が病原菌の感染や傷害を受け ることによってグリコシダーゼやハイドラーゼなどが活性 化し,アグリコンが遊離して抗菌力が発揮される(白石, 1998) Faweら(1998)は,本研究と同様の方法でキュウ
リの菓からフェノール化合物を抽由し,塩酸で加水分解し
たフラボノール･アグリコン(結合型フェノール抽出物)がうどんこ病に東して強い抗菌活性を示したと報告している.
従って･本節の`Matsushima No･3,の根においても,バラ根 腐病菌に対する菌糸伸長抑制物質が配糖体として含まれて おり,植物体への病原菌の感染によってアグリコンが遊離 して抗菌力を発揮するものと考える. 遊離型フェノール抽出物の菌糸拡散面積は,対照区に比 べて有意に小さかったものの,結合型フェノール抽出物に 比べると菌糸伸長抑制効果は高いとはいえなかった.本節 における遊離型フェノール抽出物は,挿し木発根した健全 な根を磨砕したエタノール可溶性成分中に含まれるアグリ コンである･従って,健全な`Matsushima No.3,の根にもバ ラ根腐病菌に対する菌糸伸長抑制物質が含まれている可能 性が示唆されたが,その量は少ないと考える.採取した根 は速やかに磨砕してエタノール抽出を行ったが,根の切除時の傷によって遊離型フェノールが産生された可能性や抽 出操作の過程で結合型フェノール化合物が加水分解された 人工産物である可能性も考えられた.いずれにせよ,遊離 型フェノールは結合型フェノールに比べて菌糸伸長抑制効 果は高く なく,重要性は低いと考えられた. `Matsushima No･3'と`Nakashima 91,の根から抽出した結 合型フェノール抽出物の菌糸伸長抑制効果を比較すると (図1-6),24時間後までは`MatsushimaNo.3,,`Nakashima 91'および対照区ともに菌糸伸長がほとんど認められなかっ た･しかし,対照区の菌糸拡散面積は 36時間後には1,545 mm2となり,その後急速に増大して60時間後にはシャーレ 全面に広がった･これに対し,`Matsushima No.3,の結合型 フェノール抽出物の原液では有意に菌糸 伸長が抑制されて おり,72 時間後の菌糸拡散面積は130 mm2に留まった.3 および10倍に希釈した`MatsushimaNo.3,の結合型フェノー ル抽出物の菌糸拡散面積は希釈倍率に応じて増加し,72時 間後の菌糸拡散面積は3倍希釈区で3,543 mm2,10倍希釈 区では対照区と同様にシャーレ全面に菌糸が広がっていた. これに対し,`Nakashima91,の結合型フェノール抽出物原液 では,48時間後までは対照区の1/2程度の菌糸拡散面積を 示し,`Matsushima
No.3,には及ばないもののわずかに菌糸
の伸長抑制効果が認められた.`Nakashima91,の結合型フェ ノール抽出物を3および10倍希釈すると,菌糸伸長抑制効 果が小さくなり,10倍希釈したものは対照区と有意差が認 められなかった･`Matsushima No･3,の結合型フェノール抽抽出物原液の菌糸拡散面積の推移は同じであった. Temgo･Boyomo(2002)は,CocoyamのP･myriotylumに 対する抵抗性に,菌糸伸長抑制効果を持つフェノール化合 物が関●係していることを示唆している.本節において,バ ラ根腐病抵抗性を示す`Matsushima No.3,の結合型フェノー ル抽出物が極めて高い菌糸伸長抑制効果を示したことから, Cocoyam と同様にバラ根腐病に対する抵抗性にフェノール 化合物が関与していると考えられた. 本節において,バラ根腐病に対 して羅病性である `Nakashima91'の結合型フェノール抽出物において,対照区 に比べて菌糸伸長が抑制されており,その抑制効果は `MatsushimaNo･3'の10倍希釈液と同等であった.第1節は, バラ育成過程における 凡 椚〟JJげJorαせの交雑系譜から 月. 朋〟J′ブ′Jorαとの血縁度を求め,血縁度が低くなるに従ってP. 如才ブcoブde∫ の発病指数が高まることを明らかにしている. `Nakashima 91'とR･multifloraとの血縁度は不明であるが, 本品種はミニチュアローズに分類され,その育成過程にお いて凡椚〟J′げJorαが交雑されていると推定される.従って, `Nakashima91'は完全な罷病性ではなく,極めて低い抵抗性 を示すと考えられた.Dengら(2005)は,カラジウムのP. 椚γrブoJγJ〟朋 に対する根腐病抵抗性は,抵抗性物質の量的な 差異によるものであると報告しており,本節における `Matsushima No･3'と`Nakashima 91,の結合型フェノール抽 出物における菌糸伸長抑制効果の差異からみて,これらの
れる菌糸伸長抑制物質の量的差異が関係していると考えら れた. `Matsushima No･3'の結合型フェノール抽出物が強い菌糸 抑制効果を示したことから,抵抗性に関係する菌糸伸長抑 制物質を詳 し く 調べるために,`Matsushima No.3,と `Nakashima91'の結合型フェノール抽出物をHPLCで解析し た(図1-7) 5∼6分,8∼9分,10分前後に溶出する物質 が確認され,それらは`Nakashima 91,に比べて`Matsushima No･3'の方が多かった･特に10 分前後に溶出する物質は, `Nakashima 91,のピークが明瞭ではなかったのに対して, `Matsushima No･3'は明らかなピークを示し,その高さは `Nakashima91'の約3倍を示した(以後ピーク(A)とする). `Matsushima No･3'と`Nakashima 91,の間で明らかな差が みられたピーク(A)の菌糸伸長抑制効果を検定するために, 両バラのピーク(A)に相当する物質を分取し,菌糸伸長抑 制効果を検討した(図1-8) 対照区(99%エタノール)で は･84時間後に菌糸がシャーレ全体に伸長して菌糸拡散面 積が5,674mm2に達したのに対し,`MatsushimaNo.3,のピー ク(A)分取原液では84時間後に3,723mm2に留まり,有 意な抑制効果が認められた･`MatsushimaNo.3,のピーク(A) ･の分取原液を3および10倍に希釈したものの菌糸拡散面積 は,それぞれ4,860および4,737mm2となり,対照区の菌糸 拡散面積と有意差がみられなくなった･これに対し, `NakashimaJ91,のピーク(A)の分取原液の菌糸拡散面積は
および10倍希釈液も対照区と有意差が認められなかった. このことから,`MatsushimaNo.3,のピーク(A)に含まれ る物質はタ･如才ブcoブde∫の菌糸伸長を抑制する効果を持っこ とが確認され,これがノイバラのバラ根腐病抵抗性に関係 していると考えた･しかし,その効果は第1_6 図に示した `Matsushima No･3'の結合型フェノール抽出物の菌糸伸長抑 制効果に比べて小さく,さらにピーク(A)以外にも両バラ 間で量的差異のある･ピークが多数存在していることから, `MatsushimaNo･3'の菌糸伸長抑制効果はピーク(A)を含む 複数のフェノール化合物によるものであることが示唆され た. 今後ピーク(A)の物質を単離し,MassSpectrometer(MS) 解析などを行ってバラ根腐病抵抗性物質を明らかにすると ともに,バラ根腐病抵抗性物質の生合成機構を解明する必 要がある.
第 3飾 バラ根腐病抵抗性物質のバラ間差異 凡例〟J′げJorαに含まれる物質はP.カピノブco≠de∫の菌糸伸長を 抑制する効果を持つことが明らかになっている.しかし, 抵抗性と罷病性バラ間で量的差異のある物質が多数存在し ていることから,凡研〝J′げJorαの菌糸伸長抑制効果は複数の フェノール化合物によるものであること考えた. そこで本節では,月.研〟J′≠′Jorαの罷病性および抵抗性に関 わる根由来のフェノール化合物を抽出し,梶病性と抵抗性
との関係を検討するため,甲pLCを用いて結合型フェノール
画分に含まれる物質ピークの詳細な分析を行った. 1.材料および方法 供試植物 バラ根腐病抵抗性バラ`Matsushima No.3,と罷病性バラ `Nakashima91'および本章第1節の結果からR.multifloraと の血縁関係 と根腐病抵抗性が明 らかと なっている 月. 沼〟JJブ′JorαVar･Cα才力αγe〃∫ブ∫と凡 朋〝J〆げ/orαと血縁関係にあ る`Veilchenblau,,`TheGarland,,`Rush,,`CecileBrunner,,`Margo Koster,,`Apple Blossom,,`Miss Edith Cavell,, `Nathalie Nypels,,`Kew Rambler,,`Rambling Rector,, `Cameo,,`Ghislaine deFeligonde,,`ClaireJacquier,,`Blush
Rambler,,`Leonie Lamesch,,`CoralClustar,,`Russelliana,, `Goldfinch',およびバラ野生種R.odorata,血縁関係が不明 の`Dr.Huey',`Fashion Parade,加えて 24種類のバラを供試 した. 根の採取とフェノール化合物の抽出 本章第 2節と同じよ う に行った. ⅡPLCによる結合型フェノール化合物の分離 結合型フェノール抽出物をH-PLC(LC-8020ModelII,東 ソ ー)を用 いて分離を行っ た.カ ラ ム は分離カ ラ ム COSMOSIL5C18-MS-II型(4.6×250mm)(ナカライテスク) を用いた･分析はアイソクラティ ツク条件で前半部と後半 部で溶離液の条件を変えて行った.前半部は1%酢酸水-5% アセトニトリル(ACN5%)を用い 20 分の分析,後半部は 1%酢酸水-12%アセトニトリル(ACN12%)を用い 50分の 分析を行った･カラムオーブン35℃,送液流量1mL･min 1, インジェクションボリュームは10卜Lとし,検出は300nm で行った･結合型フェノール化合物の抽出は各バラ 3 反復 行い,それぞれについてHPLC分析を前半部 3回･後半部 3 回行い,その平均値を利用した. 得られたクロマトグラムの波形処理は手動で行い,分離 できないピークはグループピークと した.各溶出時間にお けるピーク面積および高さについて,褐変度および血縁度 との関係をみるため,Excel統計を用いて主成分分析を行っ
た. 2.結果 結合型フェノール化合物のⅡPLC分析 逆相モードで分離を行う場合,物質の極性によって溶出 時間が異なり,極性が低い物質ほど溶出時間が長くなる. また,溶出に用いる溶媒アセトニトリル(ACN)の濃度が 高くなるほど溶出時間は短くなる.そこで,極性が高く溶 出時間が短い,すなわちクロマトグラム前半で検出される 物質の分析はACN5%条件で行い,極性が低く溶出時間が長 い,すなわちクロマトグラム後半で検出される物質の分析 は ACN12%条件で行った. ACN12%条件の溶出時間 7.88 分以前に確認されるピーク は ACN5%条件で検出される範囲であると推察されたため, ACN12%条件では 7.88 分以後のピークを検証対象と した. ACN5%条件での溶出において,溶出時間6.85分に検出され たピーク(以後ACN5%-6.85 と表記する)は2つ以上のピー クが重なっており,分離できなかったためグループピーク として扱った･同様のグループピークには,ACN5%_6.85以 外 に,ACN5%-15･30,ACN12%-8.52,ACN12%-10.06,
ACN12%vll･33, ACN12%-15･02, ACN12%-16.57,
ACN12%-18･29,ACN12%-20. 14,ACN12%-28.57があった.
1-9),後半の ACN12%条件では 23 ピーク(図1-10)の合
計49ピークであった･しかし,ACN5%-3.96,ACN5%-5.14,
ACN5%-6･25,ACN5%-9･87,ACN5%-10･28,ACN5%-12.63, ACN5%-13･36,ACN5%-14･21,ACN5%-16.12,ACN5%-18.79,
ACN5%-19･50･ ACN12%-23･11, ACN12%-23.77, ACN12%-24･38, ACN12%-25･12, ACN12%-37.09, ACN12%-41･32,ACN12%-44.45,ACN12%-46.51は検出され たバラが少なく,また分離も不明瞭で小さかったため,主 成分分析での考察には供試しなかった.また分離された主 要ピークはすべてのバラで確認されたため,バラの抵抗性 が物質の質的な差によるものではないことが明らかとなっ た. 49 ピークそれぞれについてバラ別にピーク面積を比較し た･褐変度に関する一定した傾向はみられなかったものの, 罷病性バラにおいて面積が大きい傾向にあるピークが存在 した･ACN5%-3･38,ACN5%-4･63,ACN5%-5.53,ACN5%-7.43, ACN5%-8･17,ACN5%-11･09,ACN12%-7･88,ACN12%-10.06,
ACN12%-11･33, ACN12%-16･57, ACN12%-22.28, ACN12%-26･53,ACN12%-29.79,ACN12%-34.92では強い抵 抗性を示す`Dr･Huey,,`MatsushimaNo･3,,R･multifloravar. Cα′カαγe〃∫ブ∫でピーク面積が小さ く,強い梶病性を示す`Coral
Cluster',`Russelliana',`?oldfinch,でピーク面積が大きい
傾向がみられた.しかし,その他の中間バラでバラツキが 大きかったため,単一でバラの抵抗性を判別できるピーク とはいえなかった･従って,単一物質でバラの根腐病に対する抵抗性が決定されているのではなく,複数の物質が量 的に梶病性に関係していることが示唆された.ピークの高 さにおいても検証を行ったが,ほとんどのピークで面積と 同様の傾向を示し,傾向が異なるピークはグループピーク として扱ったピークであった･また 凡 椚〟JJブ′Jorαとの血縁 度に関する各ピークの面積との関係においても一定の傾向 は認め られなかった. 各ピーク面積における主成分分析 全23項のうち固有値1以上の情報量を持っ主成分は第1 主成分から第16主成分までであり,第16主成分までの累 積寄与率は 97.00%であった(表1-3) また,固有値のス クリープロットから第1∼4主成分が有効な主成分であるこ と が示唆された. 第1主成分の寄与率が24.12%であったことから,第1主 成分は全23項の情報量の24.12%を説明しており,第2主成 分は16･50%,第3主成分は11.56%,第4主成分は7.34%を 説明していた.特に第1主成分の寄与率が高かったことか ら第1主成分と第2主成分,第1主成分と第3主成分,第1 主成分と第 4主成分,第2主成分と第 3主成分に対するバ ラごとの得点を平面状にプロットし,検証を行った.第1 主成分と第2主成分の累積寄与率は40.62%で,第1主成分 と第 3 主成分では 35.77%,第1主成分と第 4主成分では 31･46%,第2主成分と第3主成分では28.15%であった. 供試したバラの主成分得点第1-11分布図に示すように,
第1主成分と第 4 主成分において,抵抗性バラ と罷病性バ ラが混在する分布を示し,両者を区別する こ と はできなか っ た. 第1主成分と第 2主成分の主成分得点分布(図1-12)に おいて第 2 主成分得点の正の象限に羅病性バラが分布し, 負の象限には抵抗性バラが分布する傾向がみられた.抵抗 性バラ10種類のバラのうち第2主成分得点が負の値を示し たものは 6種類のバラがあり,罷病性の 7種類のバラのう ち第 2主成分得点が正の値を示したものは 4種類のバラが
あった.`Blush Rambler,,`Laonie Lamesch,お よび`C｡ral
Cluster'は罷病性バラであったが第2主成分得点が負の値を 示した.しかし,いずれも第 2 主成分得点は-2.0 以上であ った･また,抵抗性バラで第 2 主成分得点が正の値を示し たバラは 4 種類のバラがみられた.褐変度が中程度抵抗性 バラの分布は散在し,第 2 主成分得点による区別はできな かった･また強い抵抗性を示す`Dr.Huey,,`Matsushima No･3'･R･mtI/1if/ol･(1Var.Ca/ha.l-e7tSi.l･の 3 挿類のバラは第l 主成分得点が正の値で第 2 主成分得点が負の値の象限に分 布 した. 第1主成分と第 3主成分の主成分得点分布(図･1_13)を みると,第 3 主成分得点の正の象限に抵抗性バラが多く分 布し,篠病性バラと中程度抵抗性バラは第 3 主成分得点の 負の象限に多く分布する傾向がみられた.このことは,第2 主成分と第 3 主成分の主成分得点分布(図 ト14)において も同様にみられた.しかし強い抵抗性を示す`Matsushima
No･3'と 乱川〝Jオブ′JorαVar.CαJゐαγe〃∫ブ∫で第3主成分得点が負 の値を示し,強い羅病性を示す`ClaierJacquier,で正の値を 示すな ど例外もみられた. 主成分とピーク面積値の相関を表す主成分負荷量に着目 し,検討した.全供試バラのピーク面積の平均値からピー ク面積100mV･秒未満のピーク,ピーク面積100mV･秒以上 500mV･秒未満のピーク,ピーク面積500mV･秒以上のピー クに分類し,主成分負荷量との関係をみた. 第1主成分負荷量においてはACN5%-10.64,ACN5%-17.18,
ACN12%-8･52, ACN12%-11･33, ACN12%-14.13
, ACN12%-16･57,ACN12%-18.29,ACN12%-20.14で正の相関 がみられ,特に ACN5%-10.64,ACN5%-17.18,ACN12%_8.52 では 0･7以上と高い相関係数を示した.また ACN5%-6.85, ACN5%-8･17･ACN5%-8･75,ACN5%-11･09,ACN5%-15.30, ACN5%-18･05,ACN12%-7･88,ACN12%-10･06,ACN12%-13.43, ACN12%-26.53,ACN12%-28.57,ACN12%-34.92においては 負の相関があ り,特に ACN5%-11.09,ACN5%-15.30, ACN5%-18･05,ACN12%-7･88,ACN12%-28.57,ACN12%-34.92 で-0.7以下と高い負の相･関係数を示した. 第 2 主成分負荷量では ACN5%-3.38,ACN5%-4.63, ACN5%-7･43,ACN5%-8･17,ACN5%-8･75,ACN5%-11.09,
ACN12%-8･52･ ACN12%-10･06, ACN12%-11.33
,
ACN12%-15･02, ACN12%-16･57, ACN12%-18.29, ACN12%-20･14, ACN12%-22.28, ACN12%-26.53 ACN12%-29･79,ACN12%-34.92 で相関係数が高く,特に
ACN5%-7･43,ACN12%-15･02,ACN12%-20.14では相関係数 が 0･7以上と､大きかった.ACN5%-11.61においては負の相 関がみられた(表1-4).第1主成分と第2主成分の主成分 負荷量を示す散布図から,検出されたピークの多くは第 2 主成分と正の相関があり,特に面積の大きいピークでその 相関が強かった(図1-15) また第1主成分と第3主成分 の主成分負荷量では面積の大きいピークは第 4象限に分布 し,第 3 主成分と負の相関がみられた.しかし,各ピーク の分布に一定の傾向は認められなかった(図1-16) 第 2 主成分と第 3 主成分の主成分負荷量では面積の大きいピー クは第 4象限に分布し,多くのピークの第 2主成分と正の 相関があった(図 ト17) 次に血縁度について主成分得点分布との関係を検討した. 供試したバラを月.研〟Jオブ′Jorαとの血縁度から 50%以上のバ ラ,10%以上50%未満のバラ,10%未満のバラに分類し,第 1主成分得点と第2主成分得点,第1主成分得点と第3主成 分得点･第1主成分得点と第4主成分得点との関係を検討 した･いずれの主成分においても 月･刑〝JJげJorαとの血縁度 の大小と各種成分得点との間に一定の傾向は認められなか った･従って,血縁度と各主成分との間には相関がみられ なかった.
3.考察 結合型フェノール化合物のⅡPLC分析 結合型フェノール画分の HpLCクロマトグラムから分離 されたピーク数がバラ間で差が見られなかったことから, 抽出された物質はバラに普遍的な物質であることが判明し た. Liら(2007b)の報告から乱研〟Jオブ′Jorαが有する抵抗性は 病原菌の侵入段階で発現することから,病原菌の攻撃によ って新たに誘導される動的抵抗性であるとされている.本 節では,菌侵入によ り植物体の酵素系が活性化し 月. 椚〟JJブ′Jorα特異的に生成されるフェノール化合物の存在に 着目してきた･一般的に植物に広く存在するフラボン,ク ロログン酸,タンニンなどのフェノール化合物は抗菌活性 を持っため抵抗性に関与する物質と考えられている.フェ ノール化合物は菌の感染によって増加するが,これはペン トースリン酸経路が菌の攻撃によって活性化し,この経路 の産物であるフェノール化合物が蓄積するためと考えられ ている･フェノール化合物はそれ自身あるいはその酸化物 がフォスフォリラーゼ,トランスアミナーゼ,ペクチナー ゼなどの活性を阻害するため,病原菌の生育や,宿主細胞 間隙への蔓延を阻害するとされている(柘植,2007) 病気は宿主植物(素因)･病原体(主因)･環境条件(誘 引)の条件がそろったときのみ発生する.Li(2006)の結 果から 凡 甜〟J′ブ′Jorαにおいて発病が認められない根からも
P.カピノブcoブde∫の菌糸侵入が認められている.ア.力ピノブcoブde∫に よるバラ根腐病は幼若苗で発病するこ とが多く,成熟した 苗は発病しにくい傾向がある.P.カeJブcoブde∫の菌糸伸長が活 発になる温度は 35℃前後であり,これはバラの生育にとっ て不適な環境といえる･Liら(2007b)は月.椚〟J′げJorαの根 では罷病性バラの`Nakashima 91,に比べて菌糸伸長が緩や かであったと報告しているが,この要因と して菌の侵入に よる 月･沼〟JJげJorα に特異的な抵抗性物質の生成の他に,月. 椚〝J′ブ′Jorαの高温条件下における根の環境耐性能力が考え られた･バラの生育適温は 20∼22℃であり,この温度域に おいてバラの根の生育が良好となる.従って,この温度域 では病原菌の菌糸の伸長より先んじて根の損傷を修復する 能力･生長能力が優るため菌糸が拡大できず,結果として感 染が成立しないと推察できる.しかし,夏場の高温期にな ると根の生育が衰え,温度によるスト レスの影響でこれら の耐性が衰退することが考えられる.根の環境耐性が衰え る一方で P.カeJブcoブde∫の菌糸伸長には最適な条件となるた め被害が大きくなったと考える.月.椚〟JJブ′Jorαは日本在来の 野生種であり亜熱帯地域にも分布することから高温に対す る抵抗性が強いと推察される.これに対してロ ック ウール 栽培で台木と して最も多く用いられている台木は罷病性 月. 0加rαJαで,その交配親のいずれもが中国南西部の高地に自 生し高温に対する抵抗性が弱いとが考えられる(大川, 1999) 温度以外に栄養条件も発病の要因となり うる.イネいも
ち病は一般にイネに窒素肥料を多く施用しすぎると病原菌 の栄養源と してのアミ ノ酸が植物体内に増加するため激し く発病する.また窒素多用によって植物体が徒長して軟弱 化すること抵抗性低下と関連があると言われている(柘植, 2007)･P)･･1hitI川属菌においても P.(7P/=川idermaIt(771(Edson) Fitzp.による病害ではエンドウやト ウモロコシでは硝酸態 窒素によって発病が増加し,キュウリではアンモニア態窒 素によって発病が増加する.緩効性固形肥料の追加施与に よってバラ根腐病の被害が助長されることが明らかになっ ており,その要因について塩類集積による植物体の抵抗力 の低下の可能性が示唆された(渡辺ら,2009) これよ り 凡 研〟JJブ′Jorαの塩類集積に対する抵抗性の可能性が推察さ れた. また,今回各バラで 3 反復抽出を行ったが,バラ内でピ ーク面積の差が大きく現れるバラが存在した.挿し木後の 条件は各反復とも同じであるが,挿し穂の採取時期は反復 によって異なるバラも存在する.またバラによって発根し にく いバラや,挿し木から根を採取するまでの日数にバラ ツキが存在した.これらのバラツキが抽出される物質の量 的変化にどのような影響を及ばすかに一定の傾向は認めら れなかった･今後 乱 用〟Jオブ/Jorα特異的根腐病抵抗性につい て環境耐性要因の観点から 凡 椚〟J〆げJorαの高温条件下およ び多肥条件下での板の形態的･化学的調査が必要であると 示唆された.
各ピーク面積における主成分分析 結合型フェノール画分の詳細なピーク分離を行った結果, 単回帰では一定の傾向が認められなかったが,主成分分析 を行った結果,第1主成分得点と第 2主成分得点の散布図 より,第 2 主成分得点の正の象限に篠病性バラが分布し, 負の象限に抵抗性バラが分布する傾向がみられた(図1-12). このことから,第 2 主成分の正負によって抵抗性バラと篠 病性バラの判別が可能であると考えられた.また,強い抵 抗性を示す`Dr･Huey,,`MatsushimaNo･､3,,R･multifloravar･ CαJカαγe〃∫ブ∫の 3種類のバラは,第1主成分得点が正の値で 第 2 主成分得点が負の値の象限に分布した.このことから 第 4 象限に分布するバラは強い抵抗性を持ったバラである 可能性が高いと考えられ,より高い選抜をかけることがで きると推察された･また,第1主成分得点と第 3主成分得 点および第 2主成分得点と第 3主成分得点の散布図より, 第 3 主成分得点の正の象限に抵抗性バラが分布し,負の象 限に中間バラと罷病性バラが分布した(図1-13,14).従っ て,第 3 主成分得点による抵抗性の選抜も可能であると考 えられた･しかし,強い抵抗性バラである`MatsushimaNo.3,, 月･椚〝J′ブ′JorαVar･CαJ力αγe那ブ∫が当てはまらなかったため, 信頼性は低いと考えられた. 一方,主成分分析における第1主成分と第 2主成分の主 成分負荷量を示す散布図から,検出されたピークの多くは 第 2 主成分と正の相関があり,特に面積の大きいピークで その相関が強かった(図1-15) 主成分得点の結果とこれ
より,褐変度は第 2主成分と正の相関があり,第 2主成分 と正の相関が強いピークは第 2 主成分の主要構成要素と考 えられた･このことから,第 2 主成分と正の相関が強い物 質は褐変度に影響する物質であると推察され,バラに関わ らず普遍的に存在する主要フェノール化合物であることが 示唆された. 根頭がんしゆ病の感染においてアセトシリ ンゴンなどの フェノール物質は障害部位への菌の走行性を誘導し,さら
には発病に関する遺伝子領域を活性化させることが知られ
ている(陶山･羽柴,2007) 本節での主成分分析結果にお いて,褐変度と強い相関がある第 2 主成分がバラの梶病性 に特徴的なフェノール化合物群セあることが示唆された. これらはP･如才ブcoブde∫の遊走子や菌糸伸長を誘導する物質 やその代謝系に関係している可能性が考えられるが,これ らを特定することはできなかった.複数の物質からなる主 成分で罷病性との関係が説明できたことから,単一物質が 菌糸伸長促進や二次感染における遊走子の誘導を行うので はなく,根頭がんしゆ病におけるアセトシリンゴンのよう に,活性部位を有する化合物群が複雑に遊走子誘導や菌糸 伸長促進に関わっている可能性が考えられた(Tanら,2004). また,組織褐変は植物の細胞が損傷を受けた場合に細胞 中の酵素ポリフェノールオキシダーゼ(ppo)がフェノール 物質を酸化･してキノン体とし,これが非酵素的に酸化重合 して褐色の巨大分子を形成するものであり,植物の生理障 害に伴って褐変物質が生合成される(濱渦,2007) 本節において,褐変度とフェノール化合物との間に正の相関が 認められたことから,P.力eノブco≠de∫の感染によって生じた褐 変によってフェノール◆化合物が生成され,これがさらなる 遊走子の誘導や菌糸伸長を促している可能性が考えられた. 今後抵抗性バラ と羅病性バラの P.カピノブcoブde∫感染根と健全ノ 根の結合型フェノール化合物を抽出し,生物検定を行い, 検証していきたい.
=_∴T&blel烹慧≡vero減ⅧeSdectedinreldedne$で也箪悪霊
Cultivarnameorspecies R.m嘲om(%) ParentageZ 凡〝血吻伽昭 凡椚〟J材70rα`MatsushmaNo.3, 凡〝血吻伽皿Var･Cα助町e〃血 且椚〟J吋70rα工cdmeβ 月.`Rusb' R.'AppleBlossom' R･`RamblingRector' 見`Seag山1' R.`TheGarland' 凡`MargoEoster' 凡`BlusbR社汀1bler' R.`Leonie LⅡneSCb' R.`CecileBrunner' 凡`ClaireJac甲eir' R.'DanCe deFeu' 凡`Russelliana' R.'TapisVolant' R.`Gold丘ncb' R･'GhislainedeFeligonde' 且`Cameo' R.`CoralClustar' R.`MissEdithCavell, R.`EewRmbler' R.`Veilchenblau' R･`NathalieNypels' 100.00 兄〝皿卿〃′〃 100.00 凡〝山崎‰川 100.00 R〝糾明/h川 100.00 且〝Ⅲ卿〃和 54･10 UmamedSeedling@al1erinaxBritamia(CoralCluster(SeedlingofMadameNorbertLev即aSSeur (MadameNorbertLeNaVaSSeur(CrimsonRambler(hybridof凡mJLbyZoTaXUnkn0wn)×Gloiredes Polymtha(SeedlingofMlgnOnette(M如onette(Seedling岬.polyantha(RmJLLQZoraxUnknown)× Uhknown)×ChinaRose)×Uhkn0wn)×(SeedlingofMignonette(Mignonette(Seedling田.polyantha 凪mJLbyZoTaXUnknown)×Uhkn0wn)×ChinaRose)×Unknown)))×Unkn0Ⅵn))×Seedlingof MadameNorbertLevavasseur(MadameNorbertLevavasseur(CrimsonRami,1er(b沖ridof凡tnzLLLyZora XUhkn0wn)×GloiredesPolyantha(SeedlingofMignonette(Mignonette(Seedling田.polyantha(LL mJLby70raXUnkn0wn)×Unknown)×ChlnaRose)×Uhkn0wn)×(SeedlingofMlgnOnette(MigrlOnette (Seedling田,POlyantha(凡nLgZoTaXUnkn0wn)×Unkn0wn)×ChinaRose)×Unkn0wn)))× Unkn0wn)))×Bblouissant(Seedling笹muLLyZo,aXUhknow可×CramoisiSup6rieur)))×R 50･00 見川gOぶdX兄椚〟卿〃rα 50.00 見〃肌卿〃′α×見川0∫C力αね 50･00 LL〝Ⅲ喝伽TaXG6niralJacqueminot 50.00 凡かw矧励×R〃仙崎鮎川 43･75 DanielLaconibe(凡fnZLhyZoTaXMargarita)×WeisserHerumStreicher(DanielLacombe(RtnuhyZoTaX Margarita)×Piquerette(Seedling田･POb,antha笹m･･卿oraxUnkn0wn)×Uhkn0wn)×Unkn0wn) 37･50 CrimsonRambler(Seedling(Rm･LhmoraxUnkn0wn))×TheGarland田.bnLnOniixRmJLLLy70ra) 31･25 Aglaia(RmuLLyZoTaXR合vedrOr)×KleinerAl&ed(Ama-MariadeMontravel(Polyanthaalbaplena SarmentOSa(RmJLLyZoraxUhkn0wn)×MadamedeTartas)×ShirleyHibberd) 25･00 Polyanthaalbaplena(凡mJLLLy70TIaXUhkn0wn)×MadamedeTartas 25･00 R･卯か細加(R〝仙郷〃rα×U血0Ⅵ叫×Tea 25･00 Paul'sScaJletClimberxSeedlingof凡mJL卿ora 25.00 hybrldofRmJLbyZol･aXUnknown 25･00 Seedling田tluciaexUnknown)×Seedling(凡mzLhyZoTaXBallerina) 18･75 Hiline(Se■edling(SeedlingxAglaia(且mulWoraxRevedIOr))×CrirnsonRambler笹JnuhyZorax Uhkn0wn))×Uhknown 9･38 Gold丘nch(H占1血e(Seedling(SeedlingxAglaia(凡m･L坤ZoTaXReved.Or))×CrimsonRambler(R mJLhyZol･aXUnkn0wn))×Unkn0wn)×Unkn0wn 7･81 SeedlingofMadameNotbertLevavasseur(MadameNotbertLevavasseur(CrimsonRambler(吋bridof且 7.8l 7.8l mJLLmoTaXUnknown)×GloiredesPolyantha(SeedlingofMignonette(MlgnOnette(Seedling田. POlyantha(RmJLLmoTaXUhknow可×Uhkn0wn)×ChinaRose)×Uhkn0叫)×SeedlingofMignonette (Mignonette(Seedling岬･POlyantha(凡m･L岬oTaXUnkn0wn)×Uhkn0wn)×ChinaRose)× Uhkn0wn)))×Uhkn0wn)×SeedlingofMadameNofbertLevavasseurr(MadameNorbertLevavasseur (CrimsonRambler(如bridofR･m･LLWoTaXU血ow可×GloiredesPolyantha(SeedlingofMignonette (Mignonette(Seedling四･POlymtha(R仙hyZo,aXUnkn0wn)×Uhkn0ⅥⅦ)×ChinaRose)×Unkn0Ⅵ屯) ×SeedlingofMignonette(Mignonette(Seedling田･pOlyantha(凡〝皿LiPoTaXUnkn0wn)×Uhknown)× Cb血aRose)×U血own)))×U血0VⅥn) SeedlingofMadameNotbertLevavwseur(MadameNorbertLevavasseur(CrimsonRanibler(hybridofR mJL卿0,aXUhknovm)×GloiredesPolyantha(SeedlingofMignonette(M如onette(Seedling田. POlyantha(RmJLLLy70raXUnkn0wn)×Unknovm)×ChinaRose)×Unknow可×SeedlingofMignonette (Mignonette(Seedling(凡polymtha(RmzLLLyZoTaXUnkn0wn)×Unknown)×ClmaRose)× Unknown)))×UnknovⅧ)xSeedlingofMadameNod)ertLevavasseurr(MadameNotbertLevavasseur (CrimsonRambler(hybridofRm･LLLyZoTaXUnkn0叫)×GloiredesPolyantha(SeedlingofMignonette (Mignonette(Seedling田･pOlymtha(Rm･LhyZoTaXUnkn0wn)×Unkn0wn)×ChinaRose)×Uhknovm) ×SeedlingofMignonette(Mignonette(Seedling田･pOlyantha(Rm･LLmoraxUhkn0wn) ×Unkn0叫)× ChinaRose)×Unkn0wn)))×Unkn0wn) SeedlingofMadameNorbertLevavasseur(MadameNorbertLevavasseur(CrimsonRambler(吋bridofR mJLLLyZoTaXUnkn0叫)×GloiredesPolyantha(SeedlingofMignonette(Mignonette(Seedling岬. polyantha(RmJLLyZo川×Uhkn0wn)×Unkn0wn)×ChinaRose)×U血ow可×SeedlingofMignonette (Mignonette(Seedling田･POlymtha(Rm･Lhy70,aXUhkn0wn)×Unkn0wn)×ChinaRose)× Unkn0wn)))×Uhknovm)×SeedlingofMadameNorbertLevavasseurr(MadameNod)ertLevavasseu, (CrimsonRambler(hybridofLtmuLLyZoTaXUhknow可×GloiredesPolyantha(SeedlingofMignonette (Mignonette(Seedling田･POlyantha(RmJLhyZoraxU血10wn)×Uhkn0wn)×ChinaRose)×Unknovm) ×SeedlingofMignonette(M如onette(Seedling田･pOlyantha(R〝仙喝鮎川xUhkn0wn)×Unknow可× ChinaRose)×Uhkn0wn)))×Unkn0wn) 6･25 R･SOulieanaxmawatha(CrimsonRambler(hybridofRfrLuLLyZoraxUhknown)×PaulrsCamine Pil血) 6･25 Seedling(CrimsonRambler(吋bridofR〝仙郷oraxUnkn0Ⅵn)×Unkn0Ⅷ)×ErinnerunganBrod 3･91 0rlianSRose(SeedlingofMadameNotbertLevavasseur(MadameNorbertLevavasseur(Crimson Rambler(叫)ridofLLm･LL4fZo,aXUhkn0wn)×GloiredesPolyantha(SeedlingofMignonette 叫ignonette(Seedling岬･pOb,antha(RmJLhy70TaXUnkn0wn)×Unknown)×ChinaRose)×Unknovm) ×SeedlingofMLgnOnette(M如onette(Seedling田･POlyantha鱒muLWoTaXUnkn0wn)×Unkn0wn)× ChlnaRose)×Uhkn0叫)))×Unkn0wn)×SeedlingofMadameNorbertLevavasseurr(MadameNorbe,t Levavasseur(CrimsonRambler(hybridofRmJLLQZo,aXUnkn0wn)×GloiredesPobantha(Seedlingof Mignonette(Mignonette(Seedling田･POlyantha(RmzLhyZoraxUnknom)×Unkn0wn)×ChinaRose) ×Unkn0wn)×SeedlingofMignonette(Mignonette(Seedling畔･pOlyantha(RmJLhyZoTaXUhknow可× Unknown)× Cb血aRose)× U血own)))× Uhkn0wn))×Unkn0wnrootrotdisease･Rootedcuttingsinplugtrqyweresoakedwiththezoospore
SuSPenSionforlh,andthenzoospore-COntainednutrient
solutionwas
Rosesname Relatednesswith Relative R･multiPo7u rootrot (%)Z severity Resistance 尺･人血//坤〝Ⅵ 尺′仙//坤〃Ⅵ `MatsushimaNo.3, 凡′〃〟/J坤〝Ⅵ Var･Cα娩の′e〃∫i∫* 凡珊血物鮎川 ￡cα〝1eα* 且`Rush,* R･'AppleBlossom,* R･'RamblingRector,* 且`Seagull'* R.'TheGarland,* R･'MargoKoster'* R.'BlushRambler,* R.'LeomieLamesch,* R.'CecileBrunner,* R･'ClaireJacqueir,* R.'DancedeFeu,* ZDegreeofrelatednesswithR. 100.00 0.47abcdy resistant lOO.00 0.26a resIStant
100.00 0.34abcd resIStant lOO.00 0.27ab resistant 54.10 0.53abcde resistant 50.00 0.52abcde resIStant 50･00 0･86def
慧y
50･00 0･72cdef慧y
50.00 0.44abcd resistant 43.75 0.57abcde resistant 37･50 l･41gh susceptible 3l･25 1･01執 susceptible 25.00 0.49abcde resIStant 25･00 1･45h susceptible 25.00 0.38abcd resIStant Rosesname Relatednesswith RelativeR･multiPora rootrot Resistance
(%) severity 月.`Russelliana,* 月･`T叩isVola鵬'* 且`Gold丘nch,* R.'Ghislaine deFeligonde'* 凡`Cameo'* R.'CoralClustar,* R.'MissEdithCavell,* R.'KewRambler,* R.'Veilchenblau,* R･'NathalieNypels'* R.'Nakashima91, 且`FashionParade, R･'Dr･Huey, 月.0ゐれプね 18.75 6.25 6.25 3.91 1･08砂 susceptible O.46abcd resistant 1･52h susceptible o.71bcdef mOderately resIS也皿t 0.94e短 moderately resIS触 1･19執 susceptible o.75cdef mOderately resIS触 0･85def
慧慧y
O.31abc resISは鵬 0･90ef慧y
l･00短 susceptible O.41abcd resistant O.16a resIS也血 0.92e短 multiPofmalculatedfromthedataofbreedinginHelpMeFind(加p‥〟ww･helpmennd.com/rose/; yValueswithdi飴rentlettersaresigmificantatp=0･05byFisher,sLSDtest(n≧3). *RosesfromFlowerFestivalCbrrmemorativeParkofGifuPrefbcture. moderately resIStant 2011/July/01).00 4 〇. 〇
20
40
60
80
RelatednesswithR･multiPora(%)
Fig･l-2･Correlationbetweenrelativerootrotseverityandrelatedne亭SWithR･mukiPora.
*SignincantCOrrelationwasindicatedatP<0.05.
100
Residue Extractin80%ethanol(40c,2days) Etbanolpbase
｢
Ⅵねterphase Ethylacetate丘･actio｢fvaporateinvacuo
r ▼▼ base n(Freephenolicsubstances) aCetatephase Ⅵねter｢Evaporateinvacuo
Ethylacetate&actionaReracidolysis(Boundphenolicsubstances) Evaporateinvacuo ExtractwithpetroleumetheratpH2.0 Elutewithethylacetate Acidolysiswith4NHCl(1000c,1h) ElutewithethylacetateFig･1-3･IsolationprotocolforphenolicsubstanCeS丘omroot.
0
00
●ヽ‥ 0 00
4 00
03.ノ
0 0 2.1 0 0 0 10
ControlFreephenolic
Substances
Boundphenolic
Substances
Fig･1-5･Tblerante飽ctsofphenolicsubstances丘om'MatsushimaNo･3,ongermtubeelongatjon. ZGermtubeelongationareawasmeasIUed72baAerinoculation.Free皿dboundphenolicsubstancesweredetectedinrootextractsof5g(fw･)root･mL-1,reSpeCtively.
y5pLof99%ethylalcohoIwasaddedat4cornersinapetridish(SeeFig.1-4).
XVhlueswithd騰rentsuperscrlptSareSlgmincantatP=0･05byFisher,sLSDtest.Vtrdcalbarsrepresentmean±SE(n=3).
(へll≡ニl≡≡〇ニー碧〇一…壬三2つこ
,00
54,000
000
-ノ つJ 00 0 -ノ 200
-0ノ
l0
×=Control‥99%ethylalcohoIZ4='MatsushimaNo･3,(0riginalliquid)y
□=`Nakashima91,(0riginalliquid)
●:`MatsushimaNo･3,(3timesdilution)
○=`Nakashima91,(3timesdilution)
▲‥`MatsushimaNo･3,(10timesdilution)
△:`Nakashima91,(10timesdilution)
12 24 36 48 60 72Postinoculationperiod(hours)
Fig･1-6･Tblerant曲ctsofboundphenolicsubstanCeS丘om'MatsushimaNo.3,and
`Nakashima91,ongermtubeelongation.
Z5pLof99%ethylalcohoIwasaddedat4cornerSinapetridish(seeFig.l-4).
yBoundphenolicsubstanCeS(Originalliquid)weredetectedinrootextractsof5g(fw.)root･mL-1.
X%1ueswithdi飴rentsuperscriptsaresigni丘cantatp=0･05byFisher,sLSDtest(n=3).
0 0 60 18 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16
