はじめに 近年，我が国において，海産魚を中心に養殖魚種の多様 化が急激に進展するとともに，高密度飼育，種苗の広範な 移動及び海外種苗の導入等が進んでいる．一方，魚類養殖 業の急速な発展は疾病の発生数の増加をもたらし，新たな 疾病も発生するようになった．特に，ウイルス病は，病気 の伝播と進行が早く大量死を起こしやすいことに加え，抗 生物質等の水産用医薬品による治療が困難なことから，養 殖業に甚大な被害を及ぼし続け，その防除対策の確立は急 務となっている．中でもマダイイリドウイルス病（本稿に おいては，マダイイリドウイルスがマダイ以外の魚種に感 染し，病気が発生した場合もマダイイリドウイルス病と記 している）は，1990 年の初発以来，海産養殖魚に甚大な被 害を及ぼしたことから社会問題となった．ここでは，マダ イイリドウイルス病の原因，迅速診断技術並びに防除のた めのワクチン開発等について紹介する． 病気の発生と疫学 本病は，1990 年の夏から秋にかけて四国の養殖場で最初 に発生し，マダイの大量死を引き起こした．本病は，病理 組織学的検査，ウイルス検査及び分離ウイルスを用いた感 染実験の結果から，イリドウイルス科に属するウイルスの 感染が原因であることが明らかにされ，原因ウイルスはマ ダイイリドウイルス（RSIV）と命名された．病気は夏の高 水温期を中心に発生し，水温が 20 ℃程度まで低下した 11 月になると自然に終息したが，翌年以降も毎年夏の高水温 期を中心に西日本各地の養殖場で流行を繰り返している． さらに，本病は稚魚のみならず成魚においても発生し，こ れまでに我が国で発生したウイルス病としては最大規模の 被害を与えている． 県水産試験場の協力によって分布，罹病魚種等の発生状 況を調査した結果，1991 年以降急速に発生漁場が拡大し， これまでに本病の発生が 18 府県において確認されている （表 1）16）22）．また，現在までにスズキ目の魚類を中心に 3 目 31 魚種で本病の発生が確認されている． 本ウイルスがどこから侵入し，感染発病に至ったかは未 だ明らかでない．海外からの輸入種苗の導入に伴い侵入し た可能性も大きいが結論を得るに至っていない．一方，感 染経路については，養殖場での発生及び室内実験の結果か ら本ウイルスの水平感染が強く疑われる．養殖場において
1.
マダイイリドウイルス病
中 島 員 洋
1）2），栗 田 潤
3） 1）独立行政法人水産総合研究センター研究調査部 2）現所属：富山県水産試験場 3）独立行政法人水産総合研究センター養殖研究所玉城分室 マダイイリドウイルス病は，1990 年に四国のマダイ養殖場で最初に報告された．1991 年以降も西日 本の養殖場でマダイのみならず多くの海産養殖魚に被害を及ぼしている．病魚は運動が不活発となり， 極度の貧血症状，鰓の点状出血及び脾臓の肥大を呈する．原因ウイルスはイリドウイルス科に属し， red sea bream iridovirus（RSIV）と命名されている．RSIV のゲノムは，直鎖状 2 本鎖 DNA である が，他のイリドウイルスと同様，円環的置換が許され，末端が重複していると考えられる．円環状と なる遺伝子地図の長さは 112,415bp である．RSIV 感染魚の迅速診断法として，単クローン抗体を用い た間接蛍光抗体法及び PCR 法が広く使用されている．また，本病の防除法として，ホルマリン不活化 ワクチンが開発され，実用化されるに至っている． 連絡先 〒 936-8536 富山県滑川市高塚 364 TEL ： 076-475-0036 FAX ： 076-475-8116 E-mail ： [email protected]特集３
水産関係のウイルスは次々と近隣の生簀で病気が発生すること，また，感染実 験においては病魚と健康魚を同じ水槽で飼育することによ り病気が伝播すること，さらに病魚の飼育排水を介し病気 が伝播することなどがあげられる．一方，現在までに種苗 生産場で本病の発生が無いことから，親魚から卵を介して 仔魚への垂直感染による伝播の可能性は低いと考えられる． マダイイリドウイルス病 （1）病状 病魚は体色が黒化して海面を力無く遊泳する．軽度の眼 球突出や出血，体表の出血性のスレが観察されることもあ る．剖検では鰓の褪色が特徴的で，著しい貧血を呈し，鰓 弁の点状出血や鰓弁先端部より出血が認められることもあ る．また囲心腔内の出血，内臓諸器官の褪色，脾臓の腫大 を特徴とする14）． （2）病変 病理組織学的には，細胞質が塩基性色素で均一に濃染あ るいは顆粒状に染まる大型の類円形を呈する細胞（肥大細 胞）の出現が特徴である．肥大細胞は，脾臓，心臓，腎臓， 肝臓，鰓に多数観察される．病理組織学的に最も顕著な変 化が認められるのは脾臓であり，広範な組織の空疎化が起 こり，その組織中に多数の肥大細胞が観察される14）． （3）病因 1）形態 電子顕微鏡による観察では，前述の肥大細胞の細胞質に 結晶状に配列したウイルス粒子が観察される．ウイルス粒 子は，平面的には 6 角形を呈する 20 面体であり，直径が 200 ∼ 240nm でエンベロープを持たず，中央部に直径 120nm の電子密度の高いコアを持つ等，イリドウイルスに 特徴的な形態を有する．ウイルス粒子形成前の感染細胞で は細胞肥大と核の変性が特徴的である14）． 2）理化学的性状 本ウイルスは IUdR 処理によって増殖が抑制され，エー テル，クロロホルムに感受性，熱（55 ℃，30 分）および酸 （pH 3）に不安定な性質を示す．15 ∼ 30 ℃で増殖可能で あるが，適温は 25 ℃前後であり，37 ℃での増殖は認めら れない28）．これらの結果と，ウイルス粒子のサイズ，また 20 面体を呈し細胞質でのみ増殖することから，本ウイルス はイリドウイルス科に属する． 3）培養と増殖 原因ウイルスの分離は，病魚の脾臓磨砕ろ液を BF-2, FHM, RTG-2, CHSE-214, KRE-3 などの魚類由来の株化細 胞に接種し 20 ∼ 25 ℃で培養すると肥大球形化を特徴とす る CPE が発現して原因ウイルスが分離される14）．ウイル ス感染価は 103∼ 105TCID50/ml 程度といずれの細胞も感受 性が低く，継代とともに感染価は低下する傾向が認められ る．そこで，さらに詳しく検討した結果，イサキの鰭由来 の株化細胞である GF 細胞でウイルスの分離・培養ができ， 継代も可能であることが明らかになった． 4）血清学的性状 各種海産養殖魚種から分離した RSIV の抗原解析を行っ た結果，単クローン抗体の反応性に僅かに差が観察される ものの，同一あるいは非常に類似したウイルスと考えられ た．魚類におけるイリドウイルス病としては，リンホシス チス病42）やウイルス性赤血球壊死症2）などが多種類の海 産魚で知られているが，症状，病理所見，ウイルス粒子の 大きさ，性状などからいずれも本ウイルスと異なる．また， 得られた単クローン抗体の反応性を検討した結果，ウナギ 由来のイリドウイルス（Japanese eel iridovirus）36）とは全く 反応しなかった．また，海外で報告されているレッドフィ ン パ ー チ の 流 行 性 造 血 器 壊 死 症 ウ イ ル ス（ E p i z o o t i c haematopoietic necrosis virus）20），シートフィッシュイリド ウイルス（iridovirus isolated from sheatfish）1），グルーパーイ リドウイルス（iridovirus isolated from grouper）15）とは 表 1 マダイイリドウイルス感染魚種 スズキ目 スズキ亜目 アジ科 ヒラマサ，カンパチ，マアジ，ブリ，シマアジ，マルコバン，ブリヒラ イサキ科 イサキ，コショウダイ イシダイ科 イシダイ，イシガキダイ サバ科 マサバ，クロマグロ，サワラ スズキ科 スズキ タイ科 マダイ，チダイ，クロダイ，フエフキ，ハマフエフキ ハタ科 キジハタ，アオハタ，マハタ，クエ，チャイロマルハタ，ヤイトハタ メジナ科 メジナ スギ科 スギ カレイ目 カレイ亜目 カレイ科 ホシガレイ ヒラメ科 ヒラメ フグ目 フグ亜目 フグ科 トラフグ
1 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 90,000 100,000 110,000 112,415 10,001 20,001 30,001 40,001 50,001 60,001 70,001 80,001 90,001 100,001 110,001 10,000 8,000 6,000 4,000 2,000 0
bp inde x
639R 018R 029R 033R 037R 042R 016L 042R 049R 054R 063R 077R 092R 097R 135L 097R 106R 111R 122R 128R 140R 145R 151R 162R 161L 162R 171R 179L 197L 180R 186R 198R 224L 224L 226R 239R 237L 256R 261R 268L 268L L RP16 291L 317L 321R 324R 333L 385R 380R 353R 351R 333L 342L 349L 373L 385R 390R 394R 401R 413R 412L 420L 423L 424R 436R 450L 450L 458L 487L 488R 493R 502R 502R 506R 515L 522L 534L 543R 545R 550R 554R 562R 569R 569R 586L 591R 575R 589L 596L 600L 605L 606R 618R 617L 628L 632L 635L 635L 641L 639R 407R L CDV 005L mRN A cappi ng enzyme NTPase/hel icase DNA MTase PDGF/VEGF L CDV 006L, C IV 067R R PO-2 R PO-2 T K X PG/R AD2 R R-2 R PO-1R R -2 lami ni n EGF repeat
DPO
MCP
L CDV 082L L CDV 067L
R PO-H /23kDa
FV3 A TPase tran script ional activato r ankyrin repeat FV3 31kDa L CDV 194R, C IV 117L FV3 ICR489 TRAF2 L CDV 128L , C IV 184R L CDV 047L , C IV 393L L CDV 003L , C IV 436L putati ve prot ein kinase
ankyrin repeat R Nas e I I I ankyrin repeat TFV 051L TFV 045R, L CDV163L, CIV 295L TFV 022L L CDV 019R 463R 374R 101R 396R 156R L CDV 132L L CDV 163R, C IV 295L L CDV 025L , C IV 428L L CDV 136R L CDV 016L , C IV 176R+3 48L L CDV 191R, CIV369L L CDV 135R, C IV 037L L CDV 054R L CDV 195R, C IV 179R TFV 045R 010R 019L 026R ZF phosphoprotein R ING fing er C IV 022L TFV 009R L CDV 162L C IV 282R TFV 105R 099R TFV 021L 121L 127L 134L 138L TFV 105R L CDV 106LC IV 347L TFV 094R TFV 065L C IV 143R 238R TFIIS/R PO-M TFV 008R TFV 101R 300R TFV 063R 350L TFV 055R C IV 118L TFV 096R L CDV 147L ,CIV 274L TFV 040R C IV 355R 388R AA transporter TFV 020R TFV 086R L CDV 171R, CIV349L ankyrin repeat 292R TFV 016R, CIV 075L TFV 025R L CDV 122R,CI V 118L TFV 097R TFV 029R 483L PCN ATFV 090R 492L TFV 022R HIT -like 518L 524L
suppressor of cyto kine sign all ing
539R 535R ZF TFV 012L L CDV 108L , C IV 287R R NA binding-E WS L CDV 160L , C IV 337L TFV 085L L CDV 137R, C IV 142R L CDV 110L TFV 100L , CIV 307L TFV 047L L CDV 036R herpesvirus SOR F 2 ZF 360L 634L R GD SAP motif 318R (TFV 048L) DR DNA bi nding heme bi nd ing
putati ve prot ein kinase
CAAX bo x 234L
図１ マダイイリドウイルス Ehime １株 遺伝子地図 ※ アミ矢印は他属にも見いだされる相同な遺伝子
反応せず既報の魚類イリドウイルスとは異なる新しいウイ ルスと考えられる29）． マダイイリドウイルス遺伝子の解析 （1）ゲノム構造 イリドウイルス科に属するウイルスのゲノムは約 100 ∼ 300kbp 程度の直線状 2 本鎖 DNA である．しかし，円環的 置換が許され，両端には重複した配列が付加されているこ とから，遺伝子地図としては円環状を示すが，重複末端が 円環状のどの部分に来ているかは個々のウイルス粒子によ って異なる5）6）7）8）12）21）34）41）．通常重複配列を除いた部分を 全ゲノムとしている．末端になり得る位置は，ウイルス種 によって異なり，全く自由なものもあればゲノムの 25% 程 度に制限されるものもある5）8）27）．また末端に重複される割 合もウイルス種によって異なり，ゲノムの数％∼ 50 ％以上 と様々である5）8）．RSIV のゲノム構造も同様と考えられて おり，ゲノム解析により18）19），円環状部分は 112,415 bp， GC コンテンツは 53.4 ％であることが明らかとなった．し かし，末端の重複部分が何％あるのか，また末端となり得 る位置の許容範囲も分かっていない．ゲノムサイズと GC コンテンツを比較すると，RSIV は，節足動物を宿主とす るイリドウイルス属，クロルイリドウイルス属，脊椎動物 を宿主とするリンホシスティウイルス属，ラナウイルス属 の既知の 4 属の中では，ラナウイルス属に最も近い．また DNA methyltransferase（MT）遺伝子の存在や，メチル 化 DNA に寛容性のない大腸菌を用いてのゲノム断片のク ローニングが困難であることなどの間接的証拠から，他の 脊椎動物のイリドウイルスと同様5）10）11）40）43），RSIV のゲ ノム DNA も高度にメチル化されていることが示唆されて いる． （2）遺伝子組成とその特徴 円環状部分には，遺伝子と思われる読みとり枠が 116 個 存在し（図 1），幾つかを除いてその殆どはオーバーラップ しておらず，また，イントロン構造をとる遺伝子も今のと ころ確認されていない．これらは，クロルイリドウイルス 属を除く既知の 3 属のイリドウイルスにも見いだされる相 同な遺伝子（30 個）と，本ウイルスに特徴的な遺伝子（86 個）とに分けられた．前者の中には，構造タンパク質である 主要外被タンパク質（MCP）遺伝子の他，DNA polymerase， RNA polymerase の 2 つのサブユニット，XPG/RAD2 フ ァミリータンパク質や，前述した MT（脊椎動物のイリド ウイルスのみに共通）などの酵素類の遺伝子が含まれるが， これら遺伝子の系統解析から，RSIV は既知の属とは異な る 5 番目の属に属すことが明らかとなった（図 2）．ゲノム 中での共通遺伝子の位置関係は，他の属と比較してもお互 いに関連性は見出されず，属分化の過程においてゲノム内 で激しく遺伝子の再配置が起こってきた歴史を示唆している． 主要な複製酵素，転写酵素の遺伝子は真核生物を起源と するものであるが，それらは全属にわたり共通であること 0.1 substitutions / site リンホシスティウイルス属 ラナウイルス属 イリドウイルス属 アスコウイルス科 BIV FV3 TFV EHNV ESV SGIV R SIV ISKNV TRBIV LCDV-1 CIV IV16 WIV IV22 TIV SfAV1a HvAV3 SAV 100 100 54 100 99 99 100 100 90 70 100 74 100 95 55 マダイイリドウイルス および近縁ウイルス 図２ 主要外被タンパク質アミノ酸配列に基づくイリドウイルス科ウイルスの分子系統樹（NJ 法） ※クロルイリドウイルス属は含まれていない。アウトグループとしてイリドウイルス科に最も近縁なアスコウイルス科ウイル スの外被（膜間）タンパク質を加えた。
図 3 クラス I リボヌクレオチドリダクターゼ小サブユニット遺伝子(RR-2)アミノ酸配列に基づく分子系統樹（NJ 法） ※アウトグループとしてGeobacillus thermoleovorans, Sulfolobus solfataricus及び 結核菌の RR-2 様遺伝子を加えた。
Homo sapience Brachydanio rerio Xenopus laevis V AC V E CT V V AR V M YX V SFV SWPV L SDV T ANV Urechis caupo Spisula solidissima Homo sapience p53R2 SlM NPV L dM NPV Drosophila me lanogaster Aedes albopictus Saccharomyces cerevisiae 4 Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomy ces pomb e E mericella nidulans Neurospora crassa Lentinula edodes
E ncephalitozoo n cuniculi Leishmania me xicana amazonen sis Trypanosoma brucei Dictyostelium discoideum
Cryptosporidium parvum Plasmo dium falciparum
PBC V1 Arabidopsis thaliana Glycine ma x Nicotiana tabacum Oryza sativa C aenorhabditis elegans HZV 1 R SIV ISK NV McMNPV SeM NPV WSSV ASFV E sV 1 HHV4 SaHV2 GaHV1 GaHV2 HHV1 HHV3 Streptomyces coelicolor T FV SGIV L CDV-1 C IV C aulobacter crescentus Bradyrhizobium japonicum E hrlichia rumi nanti um Ricketts ia prowazekii Ricketts ia conorii Pseudom onas aeruginosa Pseudom onas putida Ralstonia solanacearum C hlamy dia trachoma tis Halobacterium sp. Tropheryma whipplei Bacteroides flagilis Treponem a pallidum C lostridium perfringens Aquifex aeolicus F usobacterium nucleatum nucleatum
Synechocystis sp. Helicobacter pylori
C amp ylobacter jejuni Bacillus halodurans Oceanoba cillus iheyensis Listeria mo nocytogene sis
Xanthomo nas camp estris camp estris Xylella fastidiosa E scherichia coli B Salmonella typhimurium Yersinia pestis B Haemophilus influenzae Pasteurella mu ltocida Neisseria me ningitidis Vibrio cholerae
Shewanella onei dens is Buchnera aphidicoda
T 4
Bacillus subtilis F
SPbc2
Staphylococcus epidermi dis Deinococcus radiodurans Lactococcus lactis lactis Streptococcus agalactiae F2
Lactobacillus plantarum Mycoplasma pneu mo niae
Streptococcus agalactiae F1 Bifidobacterium longum Mycobacterium tuberculosis G
C orynebacerium ammo niagenes Mycobacterium tuberculosis F Wigglesworthia brevipalpis Agrobacterium tume faciens
Brucella suis Yersinia pestis F Salmonella typhimurium F
E scherichia coli F Shigella flexneri
Geobacillus ther mo leovorans Mycobacterim tuberculosis X Sulfolobubus solfataricus 99 99 99 99 99 99 99 94 99 85 83 99 99 99 98 74 74 91 36 61 99 99 83 78 99 99 99 95 99 99 99 99 99 62 99 95 99 99 99 99 99 99 99 99 99 53 91 95 99 95 99 99 98 56 99 99 99 99 99 97 99 99 71 99 99 30 99 99 99 67 95 38 99 99 99 92 99 99 99 41 99 81 85 99 53 45 83 95 98 38 99 99 9 91 81 74 31 99 79 99 0.2 substitutions / site ヘルペスウイルス科
他のイリドウイルス科
ポックスウイルス科 バキュロウイルス科 バキュロウイルス科マダイイリドウイルス及び近縁ウイルス
α
α proteobacteria
真核生物
真正細菌
（一部古細菌を含む）
RSIV-0918（マダイ．日本．１９９４） RSIV-9371 （マダイ．日本．１９９４） RSIV-6 （ブリ．愛媛．日本１９９６） 3GG1 （チャイロマルハタ．香港．２００４） GIG45（タマカイ．香港．２００２） 10GG （チャイロマルハタ．香港．２００４） TGA14 （アカマダラハタ．シンガポール．２００２） 7GG （チャイロマルハタ．香港．２００４） RSIV-3 （クロマグロ．高知．日本１９９６） GSDIV2 （ヤイトハタ．タイ．１９９３） GIG42 （タマカイ．香港．２００２） RSIV-7 （マダイ．石川．日本１９９６） RBIV-KOR-TY4 （イシダイ．韓国） 6SB （キチヌ．香港．２００４） RSIV-8 （マダイ．神奈川．日本２００１） RSIV-2 （カンパチ．愛媛．日本．１９９６） RSIV-5 （スズキ．愛媛．日本．１９９６） SBIV （スズキ．南シナ海．１９９３） GSDIV （ヤイトハタ．タイ．１９９３） RSIV-4 （シマアジ．愛媛．日本１９９６） RSIV-9 （カンパチ．宮崎．日本１９９８） SBIV2 （スズキ．南シナ海．１９９３） 8Pe（スズキ．香港．２００４） RSIV-1 （イシダイ．愛媛．日本１９９６） RBIV-KOR-TY （イシダイ．韓国） RSIV Ehime1 （マダイ．愛媛．日本．１９９２） 2HSB （スズキ科の雑種．香港．２００４） TGA12 （アカマダラハタ．シンガポール．２０００） DGA10/8 （ドワーフグーラミー．シンガポール．２０００） ISKNV （ケツギョ．中国．＜１９９８） DG8/10 （ドワーフグーラミー．シンガポール．２００１） Lapulapu（チャイロマルハタ．パナイ島．フィリピン．２０００） 1GG （チャイロマルハタ．香港．２００４） ISKNV2 （ケツギョ？．中国．２００４） MA5/5 （ボラ．シンガポール．２０００） MA1/6 （ボラ．シンガポール．２０００） Seabass（アカメ類．ランカウイ島．マレーシア．２０００） 9GG （チャイロマルハタ．香港．２００４） DGA4/6K （ドワーフグーラミー．シンガポール．２０００） DGA13/6 （ドワーフグーラミー．シンガポール．２０００） Reddrum（ニベ科の一種．ランカウイ島．マレーシア．２０００） DG12/8 （ドワーフグーラミー．シンガポール．２０００） ALIV2 （アフリカンランプアイ．スマトラ島．インドネシア．１９９８−２０００） ALIV （アフリカンランプアイ．スマトラ島．インドネシア．１９９８−２０００） DGIV （ドワーフグーラミー．マレーシア．１９９８−２０００） DGIV2 （ドワーフグーラミー．マレーシア．１９９８−２０００） RBIV-KOR-CS （イシダイ．韓国） TRBIV （ダルマガレイ科の一種．山東省．中国．２００２） FLIV-ＪJ （ヒラメ．韓国） OFIV （ヒラメ．韓国） SGIV
RSIVgroup
ISKNVgroup
TRBIVgroup
87 76 98 99 98 96 42 47 99 92 99 89 88 75 96 92 90 80 58 81 0.05substitutions /siteGenotype 2
Genotype 1
図 4 主要外被タンパク質遺伝子塩基配列に基づくマダイイリドウイルス様ウイルスの分子系統樹（NJ 法） ※アウトグループとしてラナウイルス属であるシンガポールハタイリドウイルス（SGIV）の主要外被タンパク質遺伝子を加えた。から，それらの起源は属分化の前，イリドウイルス科の誕 生の頃に遡ると考えられる．このような古い時代に真核生 物から獲得したと思われる遺伝子は他の大型 DNA ウイル スにも普通にみられるが，RSIV をはじめイリドウイルス 科のこれらの遺伝子は，他とは比較にならないほどの真核 生物との際だった相同性をとどめており，進化速度がきわ めて遅いことが示唆された．このことは，他の科のウイル スが持っていない，DNA 修復機能を持つと予想される XPG/RAD2 ファミリーの遺伝子をイリドウイルスが早期に 宿主から獲得していた事と関連があるかもしれない． 一方，他属には共通であるが，RSIV には当てはまらな い特徴として DNA 合成に関わる ribonucleotide reductase （RR）の大小 2 つのサブユニット遺伝子（RR-1, RR-2）が 挙げられる．RSIV も RR-2 は持っているが，RR-1 が見あ たらず，しかもこの RR-2 は他属の RR-2 との相同性が極め て低い．系統解析から RSIV の RR-2 は，真核生物（おそ らくは過去の宿主）を起源にもつ新しいものと入れ替わっ ていることが明らかになった（図 3）．失った結合相手であ る RR-1 は，おそらく宿主のものを使っているのであろう． これに対して，他 3 属の RR-2 および RR-1 は細胞内寄生細 菌であるリケッチアに近い細菌を起源とする古いものであ ることが明らかになり，イリドウイルス自体の起源とリケ ッチアが深く関わっていることを示唆する興味深い結果と なった．他の大型 DNA ウイルスにおいても，細菌起源が 示唆される遺伝子の存在は多く知られている．しかし，ウ イルス遺伝子の進化速度が早く変異が大きいことから，系 統解析によって起源となる細菌種までたどり着くことは殆 どできないのが現状である．よってこれは極めて珍しい例 といえよう．RR という保存性の高い遺伝子であったこと に加え，おそらくイリドウイルスの遺伝子進化速度が遅く， 古い遺伝子が原形をとどめていたことが幸いしたと考えら れる．このように RSIV の遺伝子解析により，イリドウイ ルス科全体に関する思わぬ新しい知見が副次的に得られて きている． その他 RSIV を特徴づける幾つかの興味深い遺伝子も見 つかっている．サイトカインサプレッサー遺伝子やアンキ リンリピートを持つ 3 つの遺伝子の存在は，宿主免疫系遺 伝子発現のシャットダウン機能などを示唆するものである． またラミニン EGF リピートを持つ遺伝子，他属にも共通 な遺伝子ではあるが，細胞接着アミノ酸配列 RGD を持つ 遺伝子などは，細胞レセプターとの結合機能をもつ可能性 も予想される．今後のこれらの遺伝子の機能解析が期待さ れる． （3）アジアにおけるマダイイリドウイルス様ウイルスの系 統解析 近年，東南アジアや，中国，韓国から，ドワーフグーラ ミーなどの熱帯魚，ケツギョなどの淡水魚，ハタ類，ヒラ メなど異体類等の海産魚に由来する RSIV に抗原的，遺伝的 に類似する幾つかのウイルスが報告され3）9）13）23）35）37）38），そ の分類学的位置が論議されている．私達は，国内の RSIV および入手したこれらウイルスについて，分類のキーとな る MCP 遺伝子等を PCR 法により増幅して塩基配列を決定 し，Genbank 上に公開されている配列と共に，塩基配列及 びアミノ酸配列レベルで広範囲な系統解析を行った（図 4）． その結果，これらの類似ウイルスは RSIV，伝染性脾臓腎 臓壊死症ウイルス（ISKNV）13），ターボット赤体色イリド ウイルス（TRBIV）35）をそれぞれ代表とする 3 つの分類群 を形成し，現在のところこれらのウイルスを 3 種に分ける のが妥当と考えられた．RSIV の属する分類群は，細かく 見るとさらに，Type strain である Ehime-1 株が属する Genotype 1 と，国内で優位を占める Genotype 2 の 2 つに 分かれ，Sudthongkong ら38）により，ハタ眠り病イリドウ イルス4）であるとして報告されたタイのウイルス（GSDIV） と，韓国のイシダイイリドウイルス9）は RSIV の Genotype 2 とほぼ同一であった．ISKNV 型は淡水魚・汽水魚を多く 含み，TRBIV 型は殆どが異体類からで，東南アジアからは 見つかっていない． 分類学的位置については，これら 3 つの分類群全てを同 一種と考える研究者もいる一方で，同一の分類群内であっ ても生物学的特徴が著しく異なるものを含むこともまた事 実であり，コンセンサスを得られる分類区分についてはさ らなる研究が必要と考える． マダイイリドウイルス病の診断法の開発 マダイイリドウイルス病の早期発見を目的に，当初，マ ダイ病魚脾臓スタンプ標本のギムザ染色観察による肥大細 胞の確認が簡便な診断法として開発され普及したが，罹病 魚種の拡大に伴って魚種によってはマダイほど顕著な病変 を示さないものも出現し，現場からはより正確な診断法の 開発が要望された．そこで，ウイルス感染により誘導され る抗原を認識する単クローン抗体を作製し30），これを用い た間接蛍光抗体法による簡易診断法を確立した．まず，作 製した抗体の内，ウイルス感染により誘導される抗原であ る 230/180kDa の抗原を認識する単クローン抗体を利用し た蛍光抗体法を用いて，RSIV を実験感染させたマダイ稚 魚からウイルス抗原の検出の可否を検討した．その結果， 全ての実験感染死亡魚の脾臓スタンプにおいても，ウイル ス抗原が検出された．また，一部の生残魚においてもウイ ルス抗原の検出されるものが認められ，単クローン抗体を 用いた蛍光抗体法は本病の確定診断に利用できることが明 らかになった31）． そこで，この方法を用い，県水産試験場の協力のもとに， 西日本の養殖場で発生した RSIV 感染の疑われた病魚 738 検体について感染の有無を調べた．これらの検体の中には， マダイ，チダイ，イシダイ，イシガキダイ，スズキ，ブリ，
ヒラマサ，カンパチ，シマアジ，トラフグ及びキジハタ等 の魚種が含まれる．本診断法によりこれらの全ての魚類か ら RSIV と共通の反応性を示すウイルス抗原が検出された． これらの結果により，単クローン抗体を用いた蛍光抗体法 による診断は，マダイのみならず各種海産養殖魚で発生し ている本病の迅速診断に有効であることが明らかとなった． なお，感染魚はマダイでは稚魚から親魚におよび，ブリ， カンパチ等においても稚魚ばかりでなく，大型魚の感染も 認められた．本蛍光抗体法では肥大細胞のみならず，感染 初期と思われる小型の細胞の識別も可能である．また，前 述のごとく RSIV 遺伝子の解析を広範に進めており，これら を基に，PCR プライマーを作製した．これらのプライマーを 用い，実験感染および自然感染マダイの脾臓組織や分離ウ イルスの培養上清の試料について検討した結果，PCR 法に より目的断片が増幅された17）．また，本法により実験感染 および自然感染マダイの脾臓組織や分離ウイルスの培養上 清の試料から目的断片が増幅され診断法としての有効性が 確認された．現在では，ギムザ染色法，間接蛍光抗体法及 び PCR 法のいずれも養殖現場における迅速診断法として広 く利用されている． マダイイリドウイルス病に対するワクチンの開発 本病はウイルス病であり，薬剤等による化学療法は期待 しにくいことから，ワクチンの開発が強く求められた．ワ クチンは，RSIV 感染 GF 細胞の培養液を低速遠心して得た 上清に，ホルマリンを 0.1% 添加して不活化し作製した．室 内試験においては，ワクチンの投与方法はマダイ 1 尾あた り 0.1ml 腹腔内，または筋肉内に接種して 10 日後，ウイル ス液を腹腔内接種して攻撃し，その防御能を検討した．そ の結果，ワクチンを腹腔内及び筋肉内接種した群は，いず れも対照群に比べ極めて低い死亡率を示し，室内試験にお けるワクチンの有効性が確認された32）．さらに，自然環境 下での有効性を確認するための野外試験を実施した．ワク チン投与群及び対照群（無処理群）にはそれぞれ 1,000 尾 のマダイ稚魚を用いた．マダイ稚魚の腹腔内にワクチン液 を 0.1ml 接種し，接種後から 12 週間海面生簀で飼育し観察 を行った．また，対照群を隣接した生簀で同様に飼育した． 対照群では投与 4 週間後から摂餌行動が鈍くなる魚が観察 されるとともに，死亡魚が観察され始め，6 ∼ 7 週間目に ピークに達した．ワクチン投与群では対照群の死亡魚のピ ークよりやや遅れ，投与後 8 週間後に小さなピークを示し たが，累積死亡率は，対照群で 68.5%，ワクチン投与群で は 19.2% であり，RPS（有効率）は 72% であった．なお， 累積死亡率では，ワクチン投与群と未投与群間で統計学的 に有意な差（P<0.01）が認められた．平均魚体重について もワクチン投与群が対照群に比べ有意に増加していた．ま た，ワクチン投与により免疫魚においてはウイルス抗原及 びゲノム DNA の増幅が抑制されることが明らかになった33）． これらの結果を踏まえて，1999 年にはマダイ稚魚を対象 とした「イリドウイルス感染症不活化ワクチン」が市販さ れた．本ワクチンは，魚類のウイルス病を対象として実用 化された世界で最初のワクチンであり，現在ではブリ，カ ンパチ等のブリ属魚類やシマアジにおいてもその使用対象 が拡大されている． おわりに 近年，我が国の沿岸海域では，天然資源の回復・増大を 目的とした増殖事業と，より高い生産性を追求した養殖事 業が推し進められている．このような状況下で，「水産養 殖」は一段と重要視されるようになり，漁業の中で養殖漁 業は生産量では約 20 ％，生産金額では約 35 ％を占め，そ の地位を不動のものにしている．マダイについては，海面 網生簀による本格的な養殖が行なわれるようになったのは 昭和 40 年頃といわれており，その歴史は比較的新しい．マ ダイ養殖は，その後進展し，昭和 60 年代に入ってからは， 種苗の安定供給と質の向上，高度経済成長に伴うグルメ嗜 好の増大，配合飼料の進歩，ブリ養殖の低迷などにより急 速に進展した．また，マダイは，一般に他の海産養殖魚に 比べ病気に強く養殖しやすいとされていた．しかしながら， 昭和 60 年前後からマダイ養殖の隆盛に伴い，病気が頻発す るようになり，現在までにマダイイリドウイルス病やリン ホシスチス病といったウイルス病，ビブリオ病，滑走細菌 症やエドワジエラ症といった細菌病，筋肉クドア症などの 原虫病，ビバギナ症などの単生虫症，及び生殖腺線虫症な どの寄生虫症が知られている24）． 一方，我が国では，近年，海産養殖魚のウイルス病の発 生が増加し，その対策が急務となっている．このような状 況下で 1990 年の夏から秋にかけて，四国で，マダイ当歳魚 を中心にマダイイリドウイルス病が最初に発生した．本病 は，上述のごとく我が国で突然出現し急速に拡大したが， その発生源・感染源については明らかになっていない．推 定される淵源として以下のことが挙げられる．一つは，外 国由来，すなわち外国産種苗の導入とともに我が国に侵入 した可能性が考えられ，もう一方では，国内由来の可能性 が挙げられる．後者の場合，原因ウイルスは元々養殖場周 辺に潜んでおり何らかの原因で魚に感染し，病気を起こし たものと考えられる．具体的には感受性の低い魚が本来の 宿主で，現在でも依然として感染源となっている可能性が 挙げられる．いずれにしても，本病は初発から 10 年以上経 過しており，最早この病気について淵源をたどることは難 しいとも考えるが，短期間のうちに多数の魚種に拡がった ことからすれば外国産種苗の導入に伴い病原体が侵入した 可能性は高いように思われる．このような状況下において は，輸入種苗とともに海外から病気が持ち込まれる危険性 を低くするとともに，逃亡や産卵などによる生態等への影 響も含め，外国種苗の安易な導入を止めることが肝要であ
ると考える． 感染症対策として，Muroga25）により，7 つの手段が示 されている．また，これらは，魚類の細菌感染症の予防・ 治療対策並びに種苗生産における感染症の防除対策として も示されている24）26）．7 つの手段には，感染源，感染経路 対策として 1）感受性宿主と病原菌の接触を避ける（防疫）， 2）特定の病気が発生しにくい環境を維持する（環境制御）， 宿主対策として，3）特定の病気に対する抵抗性の高い品種 を作出・育成する（耐病性育種），4）特定の病原菌に対す る予防免疫を施す（予防免疫），5）免疫賦活剤あるいは栄 養剤を投与することにより非特異的生体防御能を活性化す る（生体防御能の活性化），6）適正な飼育管理を行うこと により宿主の生体防御能を維持するとともに，病原体の増 加を防ぐ（適正飼育管理），及び治療対策として，7）その 病原体に対する有効な薬剤を用いて治療する（化学療法） が挙げられる． これらの内，本病に対する対策としては，適正飼育管理 を基本とし生体防御能の活性化をはかるとともに，不活化 ワクチンによる予防免疫に依ることが重要と考える．また 長期的には，耐病性育種による耐病性系統の作出による対 策が重要となろう． さらに，ウイルス病の防除のためには，法律の整備等を 含む養殖システムにおける基本的な改善も必要となる．我 が国においては，前述のごとく，魚介類の導入に際し特定 疾病について健康証明書を必要とする検疫システムを平成 8 年に導入し，平成 11 年には，持続的養殖生産確保法が施 行され，その中に，特定疾病の蔓延を防止する項目も含ま れている39）．このような対策を講じることにより，ウイル ス病のみならず，魚病の発生の減少が期待されている． 謝 辞 本研究を行うにあたり，様々なご協力をいただきました 水産総合研究センター，イリドウイルス感染症研究会及び 財団法人阪大微生物病研究会の関係各位に厚くお礼申し上 げます。 文 献
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Red sea bream iridoviral disease
Kazuhiro Nakajima
1)2), Jun Kurita
3)1) Research Promotion and Development Division, Fisheries Research Agency, Queen's Tower B 15F, 2-3-3 Minatomirai, Nishi-ku, Yokohama 220-6115, Japan
2) Present address :
Toyama Prefecutural Fisheries Research Institute, 364 Takatuka, Namerikawa, Toyama 936-8536, Japan E-mail: [email protected]
3) Inland Station, National Research Insitute of Aquaculture, Fisheries Research Agency, 224-1 Hiruta, Tamaki, Mie 519-0423, Japan
The first outbreak of red sea bream iridoviral disease caused by red sea bream iridovirus (RSIV) was recorded in cultured red sea bream Pagrus majorin Shikoku Island, Japan in 1990. Since 1991, the disease has caused mass mortalities of cultured marine fishes not only red sea bream but also many other species. The affected fish were lethargic and exhibited severe anemia, petechiae of the gills, and enlargement of the spleen. The causative agent was a large, icosahedral, cytoplasmic DNA virus classified as a member of the family Iridoviridae and was designated as red sea bream iridovirus (RSIV). The genome of RSIV is liner dsDNA and considered to be circularly permitted and terminally redundant like other iridoviruses. The length of physical map of RSIV genome is 112,415bp. An indirect immunofluorescence test with a monoclonal antibody and PCR are commonly used for the rapid diagnosis of RSIV infected fish in the field. For the control of this disease, a formalin-killed vaccine against red sea bream iridoviral disease was developed and now commercially available.
