機構に関する研究
主任研究者 国立がんセンター研究所
高 橋 真 美
研究成果の要旨
高脂肪食は、ハムスターの高脂血症を増悪させ、BOP 誘発膵管発がんを促進した。II 型糖尿病モ デルの KK-Ayマウスは、顕著な高脂血症を呈しており、C57BL/6J マウスに比べて AOM 誘発 ACF の発
生数が有意に多く、大腸発がん高感受性であることが示唆された。大腸発がん感受性の異なる 2 つ のラットの系統で、溶媒もしくは PhIP 投与時の大腸腺管での miRNA の発現に系統差が見られた。レ プチン受容体遺伝子に異常のある Zucker 雌ラットのヘテロ接合体（+/fa）では、野生型（+/+）ラ ットに比し、DMBA 誘発乳腺腫瘍が早期に発生し、腺がんの発生頻度及び数も +/fa で増加傾向を示 した。また、遺伝子型に関わらず、コーン油添加飼料は血清レプチン値を上昇させ、腫瘍体積を増 加させる傾向を示した。高脂肪食を摂取させた A/J マウスは高コレステロール血症を呈し、NNK 誘発 肺腫瘍の発生個数及び腫瘍径は増加する傾向を示した。高脂肪食メチル基供与体を多く含むメチル 化促進飼料を授乳期の母親に与え、仔マウスの体重変化への影響を検討したところ、高脂肪食によ る体重増加がメチル化促進飼料により抑制された。 研究者名および所属施設 研究者名 所属施設および職名 高橋 真美 国立がんセンター研究所 室長 廣瀬 善信 岐阜大学医学部附属病院 准教授 今井 俊夫 国立医薬品食品衛生研究所 室長 久野 壽也 香川大学医学部 准教授 落合 雅子 国立がんセンター研究所 主任研究官 亀井 康富 東京医科歯科大学 准教授 分担研究課題 膵臓・大腸発がんにおける肥満・高脂血症・糖尿病の 関与 大腸・肝発がんにおける肥満及び糖尿病の関与 肥満ラットを用いた乳腺発がんに関わる内的因子の探 索 肺発がんにおける肥満・高脂血症・糖尿病の関与 PhIP 誘発発がんモデルを用いた肥満・高脂血症の発が んヘの関与と発がん機構に関する研究 肥満・糖尿病モデルマウスにおける発がん関連因子の 発現調節機構の研究 研究報告 １ 研究目的
本研究では、肥満・高脂血症・糖尿病モデル動物を 用い、これらの病態が発がんに及ぼす影響を調べ、そ のメカニズムを明らかにすることを目的とする。これ らの病態と発がんとの関連性が明らかになれば、がん 予防法を確立する上で有用な基礎的研究資料を提供で きる。本年度は、特に高脂血症や高脂肪食が発がんに 及ぼす影響について検討を行なった。 ２ 研究方法および成果 シリアンゴールデンハムスターは、通常食摂取時にお いて既に高脂血症状態であり、この高脂血症が膵管発が ん促進に寄与している可能性が考えられる。そこで、さ らに高脂肪食を負荷した場合の血清脂質レベルおよび 膵管発がんに対する影響を検討した。6 週齢の雌性シリ アンゴールデンハムスターに基礎食として CE-2 diet （ 粗 脂 肪 4.7 ％ 、 日 本 ク レ ア 製 ） を 摂 取 さ せ 、 N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine(BOP)を 10 mg/kg 体重 の用量で一日おきに 4 回皮下投与した。その後、8 週齢 から 23 週齢まで、高脂肪食群には Quick Fat diet（粗 脂肪 14.3％、日本クレア製）を投与し、血清脂質レベル 及び膵臓病変に対する高脂肪食の影響を、基礎食群との 比較により検討した。その結果、高脂肪食群では体重が 有意に増加し、内臓脂肪量も増加傾向が見られた。また、 血清のトリグリセリド(TG)値と総コレステロール値が 顕著に上昇した（TG 563 mg/dL、総コレステロール 304 mg/dL）。膵管発がんへの影響について検討したところ、 前がん病変の異型過形成の発生率が高脂肪食で 3 倍にな り、個数も 8 倍と顕著に増加した。また、膵管がんの発 生個数も 2 倍以上に増加した。発生した膵管がんのサイ ズを見ると、特に 0.1mm 以下の微小ながんの発生数が増 加していることがわかった。以上の結果より、高脂肪食 は、ハムスターの高脂血症を増悪させ、BOP 誘発膵管発 がんを促進することが示唆された。II 型糖尿病モデルの KK-Ayマウスは、過食により肥満を呈し、糖尿病および 高脂血症を高率に発症する。そこで、 KK-Ayマウス、及 び、対照として C57BL/6J マウスを用い、アゾキシメタ ン(AOM)誘発マウス大腸アベラントクリプトフォーサイ (ACF)の形成を指標として、糖尿病や高脂血症の大腸発 がんへの影響を検討した。大腸発がん物質のアゾキシメ タンをマウスに投与し、8 週間後の ACF を解析したとこ ろ、C57BL/6J マウスに比べ、KK-Ayマウスでは約 4 倍多 く ACF の発生が認められ、大腸発がん高感受性であるこ とが示唆された。体重は、13 週齢時には KK-Ayが倍以上 重く、肥満を呈しており、脂肪細胞が肥大化して、炎症 細胞の数が有意に増加していた。さらに、KK-Ayマウス は、顕著な高脂血症を呈しており、13 週齢時の血清脂質 値は、C57BL/6J に比べ、TG 値が約 9 倍、総コレステロ ール値が約 3 倍高値であった。また、インスリン、レプ チンの値が顕著に高く、他にも Pai-1 や IL-6 の値が高 くなっており、これらが大腸発がんに促進的に作用する 可能性が考えられた。（高橋） レプチン関連の遺伝子異常によって過食となり肥満 を呈する db マウスあるいは ob マウスでは、食餌制限 下での大腸発がん短期試験にて azoxymethane（AOM） で誘発される大腸粘膜内微少病変数が有意に増加する ことが示されている。昨年度は、db マウスを用いて AOM/dextran sodium sulfate （AOM/DSS）誘発大腸発 がん長期試験を行ない、誘発される腫瘍のサイズが有 意に増加することを示した。今回は、ob マウスを用い た AOM/DSS 誘発大腸発がん長期試験を行い、その大腸 発がん感受性について検討した。また、db マウスにお いても、前回より弱い今回の発がん条件にて再度検討 した。５週齢雄 ob/ob マウス（17 匹）と lean mice（38 匹）に、AOM を 10mg/kg の濃度で腹腔内投与し、その 1 週後から 1 週間の間 1.5%DSS を飲水投与した。実験は 飽食の状態で行い、23 週齢にて病理解析を行った。５ 週齢雄 db マウス（ホモ 26 匹，対照群 25 匹）について も、同様のプロトコールにて再実験を行った。実験終 了時には ob 及び db ホモマウスは著明な肥満を呈して おり、高脂血症、高血糖の状態であった。大腸におい ては、ob ホモマウス及び対照群の腫瘍発生率と発生数 はそれぞれ 47％ vs 45％、1.1±1.5 vs 0.7±1.3 であ り、群間に有意差はなかった。腫瘍サイズも、ob ホモ マウス群と対照群に有意差はなかった。また、同様の プロトコールにおける db ホモマウス群と対照群にお ける大腸腫瘍発生率・発生数は、それぞれ 8％ vs 12％、 0.1±0.3 vs 0.2±0.8 であり、群間に有意差はなかっ た。腫瘍サイズにも有意差はなかった。これらの結果 から、ob マウスでの AOM/DSS 誘発大腸発がん感受性が 対照群マウスに比べて亢進しているとは言えなかった。 しかし今回の ob マウスと db マウスの実験結果を比較 すると、腫瘍誘発率・腫瘍発生数ともに ob マウスの方 が db マウスよりも有意に多く、この二種類のマウスに は発がん感受性の有意な系統差が存在することが示唆 された。（廣瀬） PhIP 誘発ラット大腸発がんモデルにおいて、KAD、 NAR 及び F344 と ACI ラットの 3 種の動物モデルを用い て発がん感受性と高脂血症の関連を解析し、その機構
の解明を目指した。KAD (Kyoto Apc delta)ラットは、 短期間欠投与法で開始後 32 週では、homozygote、 heterozygote が野性型よりも PhIP による大腸発がん 誘発性が高い傾向が認められたが、血清 TG 値は遺伝子 型による違いが認められなかった。KAD rat の高脂血 症は若年齢の時期のみ観察され、KAD ラットの大腸発 がん誘発性が高い傾向とは関連していない可能性が示 唆された。NAR(Nagase analbuminemic rat)は親系統の SD ラットと比較して高コレステロール血症である。投 与開始後 12 週において NAR は SD に比較して ACF 誘発 性は高感受性の傾向が認められたが、32 週においては、 肉眼的観察では大腸腫瘍の誘発性に系統間で差は認め られなかった。現在、微小な腫瘍性病変等の誘発性を 検討中である。F344 は ACI 系統よりも、血清 TG 値が 高く、内臓脂肪の蓄積も顕著である。F344 と ACI 系統 の大腸腺管を用いて microRNA (miRNA)の網羅的発現解 析を行なった。350 種類の miRNA のうち、約 190 種類 が大腸腺管において発現していた。F344 と ACI 間で発 現量が 10 倍以上違う miRNA もあれば、F344 で発現上 昇しており、脂肪細胞の分化との関連が報告されてい る miRNA もあった。溶媒もしくは PhIP 投与群のどちら かで、F344 が ACI に比較して 2 倍以上発現が変化して おり、かつ有意差が認められた miRNA は、F344 で発現 増加が 4 個、発現抑制が 6 個であった。両系統間で発 現変化が認められた miRNA が、大腸発がん及び高脂血 症や内臓脂肪の蓄積に及ぼす影響や大腸発がんに関与 する分子機構を、今後解析する予定である。（落合） 肥満により乳がんのリスクが増加することが指摘さ れているが、その詳細は明らかではない。本研究では、 乳腺発がんに関わる可能性のある肥満関連内的因子と してレプチンに着目し、昨年度は、突然変異レプチン 受容体遺伝子fa を持つ Zucker ラットのヘテロ接合体 （+/fa）では、6 週齢において、野生型（+/+）に比し 血清中および脂肪組織中レプチン濃度が高いことを示 した。また、7 週齢の+/+及び+/fa を基礎飼料あるいは コーン油添加飼料で 12 週齢まで飼育した際の血清生 化学検査値（血糖、TG、総コレステロール、HDL-及び LDL-コレステロール、インシュリン、レプチン）を比 較したところ、コーン油群では遺伝子型に関わらず TG 値の低下傾向及びレプチン値の上昇が見られ、その他 の項目には明らかな影響はみられなかった。そこで、 +/+ 及 び +/fa の Zucker ラ ッ ト を 用 い て 7,12-dimethylbenz(a)-anthracene（DMBA）誘発乳腺発 がんに対する高脂肪食（10％コーン油添加飼料）の影 響を解析した。32 週間の実験期間中の体重は、基礎飼 料群に比しコーン油群では増加したが、遺伝子型によ る明らかな差は認められなかった。触診による観察で は、+/+ に比し+/fa では早期に乳腺腫瘍が発生し、そ の頻度及び数は増加あるいは増加傾向を示した。病理 組織学的解析でも、乳腺腫瘍の発生頻度及び数は+/+ に比して+/fa で増加傾向を示した。一方、+/+及び+/fa の何れにおいても基礎飼料群に比しコーン油群では腫 瘍体積が増加傾向を示した。また、発がん実験の剖検 時における血清レプチン値には遺伝子型による差がみ られず、基礎飼料群に比しコーン油群では高値を示し た。これらの結果から、レプチンは乳腺発がんに対す る感受性を高め、発生した乳腺腫瘍に対してはその発 育を促進する可能性のあることが示された。今後、DMBA 誘発ラット乳腺発がんに対する外因性レプチンの影響 等について更なる検討が必要である。（今井） マウスに糖尿病を起こす薬剤であるストレプトゾシ ン(STZ)に肺腫瘍誘発能があることから、糖尿病を来す STZ の量、観察期間と肺腫瘍の関係、および STZ のア グリコンであるメチルニトロソウレア(MNU)を用いて STZ の肺特異性を検討した。STZ(50 mg/kg)を 4 回投与 すると糖尿病状態となり、8 週間で全頭に肺腫瘍を認 めた。STZ(50 mg/kg)1 回投与では糖尿病は発症しない が、16 週で全頭に肺腫瘍が観察された。等モル量の STZ、 MNU 投与の比較では投与後 16 週でいずれにも高率に肺 腫瘍を生じたが、1 匹あたりの肺腫瘍数は STZ 群が有 意に多かった。以上より、STZ は MNU と比較して肺上 皮細胞に特異的に取り込まれる可能性が示唆された。 次に、遺伝的な肥満及び糖尿病状態の化学肺発がんへ の影響を検討するため、肥満、II 型糖尿病を示すレプ チンレセプター欠如(db/db)およびレプチン分泌不全 (ob/ob)マウス(雌性、6 週齢)に肺発がん物質である NNK を投与し、そのワイルドマウスとの腫瘍発生を比 較検討した。これらのマウスは NNK に対してほとんど 感受性を示さず、いずれも肺に腫瘍を認めなかった。 以上の結果から、系統、投与量、観察期間のさらなる 検討が必要と考えられた。最後に、肺腫瘍に対する食 餌性の高脂血症の影響を明らかにするため、7 週齢雌 性 A/J マウスに 2 mg/body の NNK を投与し、誘発され る肺腫瘍に対する高脂肪食の修飾効果を検討した。実 験終了時、高脂肪食群には高コレステロール血症を認 めた。1 匹あたりの腫瘍数、腫瘍径は 16、32 週のいず れの段階でも高脂肪食によって増加する傾向を認めた が、統計学的な差は認められなかった。食餌性高脂血
3. Kitahashi, T., Takahashi, M., Yamada, Y., Oghiso, Y., Yokohira, M., Imaida, K., Tsutsumi, M., Takasuka, N., Sugimura, T., Wakabayashi, K. Occurrence of mutations in the epidermal growth factor receptor gene in X-ray-induced rat lung tumors. Cancer Sci., 99: 241-245, 2008. 症が肺腫瘍に対して促進的に働く事が明らかになった が、A/J マウスが肥満抵抗性の系統であることから、 系統の変更や実験期間を検討すべきと考えられた。（久 野） 肥満マウスの肥大化脂肪細胞においてインプリンテ ィング遺伝子Mestの発現が著しく増大している。しかし、 肥満や生活習慣病のエピジェネティクス制御の分子機 構については全く知見がない。DNAメチル化が肥満プロ グラムに関与するかを調べるため、メチル化促進飼料を 与え、肥満に対してどのように影響するかを検討した。 メチル基供与体を多く含むメチル化促進飼料を授乳期 の母親に与え、離乳後は仔マウスに普通食または高脂肪 食を摂取させて体重変化への影響を調べた。普通食を与 えた仔マウスでは親に与えたメチル化促進飼料の影響 は見られなかった。一方、高脂肪食を与えた仔マウスで は、親にメチル化促進飼料を与えていた場合に、高脂肪 食による体重増加の程度が抑制された。
4. Takasuka, N., Takahashi, M., Hori, Y., Kitahashi, T., Iigo, M., Imai, T., Yoshimi, N., Sugimura, T., Wakabayashi, K. Promotion of mouse two-stage skin carcinogenesis by diacylglycerol-rich edible oil. Cancer Lett., 275: 150-157, 2009. 5. Mori. H., Hirose, Y., et al. Precancerous conditions of the colon; multistage carcinogenesis in animal models. Int. J. Cancer Prev., 2: 363-373, 2008.
6. Shimizu, M., Hirose, Y., et al. EGCG suppresses azoxymethane-induced colonic premalignant lesions in male C57ML/KsJ-db/db mice. Cancer Prev. Res., 1: 298-304, 2009.
以上より、肥満には遺伝子のメチル化による制御が関与 している可能性が示唆された。（亀井）
7. Hirata, A., Imai, T., et al. Carcinogenic risk of heterocyclic amines in combination － assessment with a liver initiation model. Food Chem. Toxicol., 46: 2003-2009, 2008.
３ 倫理面への配慮
動物は必要最小限数を用い、各所属施設の動物実験 倫理委員会の承認を得て、実験動物取扱い（倫理）規
定を遵守し、飼育・実験を行なった。 8. Cho, Y.M., Imai, T., et al. A new medium-term rat colorectal bioassay applying neoplastic lesions as end points for detection of carcinogenesis modifier－ Effects with weak or controversial modifiers. Toxicol. Pathol. 36: 459-464, 2008. 研究成果の刊行発表
外国語論文
1. Takahashi, M., Kitahashi, T., Ishigamori, R.,Mutoh, M., Komiya, M., Sato, H., Kamanaka, Y., Naka, M., Maruyama, T., Sugimura, T., Wakabayashi, K. Increased expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine-induced
hamster pancreatic carcinogenesis and prevention of cancer development by ONO-1714, an iNOS inhibitor. Carcinogenesis, 29: 1608-1613, 2008.
9. Imai, T., et al. Modifying effects of prepubertal exposure to potassium perchlorate and tetrabromobisphenol A on susceptibility to N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine- and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced
carcinogenesis in rats. Toxicol. Lett., 185: 160-167, 2009.
10.Kuno, T., et al. Lack of modifying potential of 8-methoxypsoralen in the promotion or progression stages of lung carcinogenesis in A/J female mice. Oncol. Rep., 20: 767-772, 2008. 2. Mutoh, M., Niho, N., Komiya, M., Takahashi, M.,
Ohtsubo, R., Nakatogawa, K., Ueda, K., Sugimura, T., Wakabayashi, K. Plasminogen activator inhibitor-1 (Pai-1) blockers suppress intestinal polyp formation in Min mice. Carcinogenesis, 29: 824-829, 2008.
11.Yokohira, M., Kuno, T., et al. Establishment of a bioassay model for lung cancer chemoprevention initiated with 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon e (NNK) in female A/J mice. Exp. Toxicol. Pathol.,
60: 469-473, 2008.
12. Yokohira, M., Kuno, T., et al. Potential inhibitory effects of D-allose, a rare sugar, on liver preneoplastic lesion development in F344 rat medium-term bioassay. J. Biosci. Bioeng., 105: 545-553, 2008.
13. Yokohira, M., Kuno, T., et al. A 90-day toxicity study of L-asparagine, a food additive, in F344 rats. Food Chem. Toxicol., 46: 2568-2572, 2008. 14. Yokohira, M., Kuno, T., et al. Lung toxicity of 16 fine particles on intratracheal instillation in a bioassay model using F344 male rats. Toxicol Pathol., 36: 620-631, 2008. 15. Tomita, H., Kuno, T., et al. N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced gastric carcinogenesis in rats. Oncol. Rep., 19: 11-15, 2008.
16.Matsuda, Y., Kuno, T., et al. One-year chronic toxicity study of Aloe arborescens Miller var. natalensis Berger in Wistar Hannover rats. A pilot study. Food Chem. Toxicol., 46: 733-739, 2008.
17. Kamei, Y., et al. Regulation of SREBP1c gene expression in the skeletal muscle: role of RXR/LXR and FOXO1. Endocrinol., 149: 2293-2305, 2008.
18. Miura, S., Kamei, Y., et al. Isoform-Specific Increases in Murine Skeletal Muscle Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma Coactivator-1alpha (PGC-1alpha) mRNA in Response to beta2-Adrenergic Receptor Activation and Exercise. Endocrinol., 149: 4527-4533, 2008.
19. Toyoda, T., Kamei, Y., et al. Effect of peroxisome proliferator-activated receptor alpha ligands in the interaction between adipocytes and macrophages in obese adipose tissue. Obesity, 16: 1199-1207, 2008.
20. Yamada, H., Kamei, Y., et al. In vivo and In vitro Inhibition of Monocyte Adhesion to Endothelial Cells and Endothelial Adhesion Molecules by Eicosapentaenoic Acid. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 28: 2173-2179, 2008.
21. Ito, A., Kamei, Y., et al.Role of C-C chemokine receptor 2 in bone marrow cells in the recruitment of macrophages into obese adipose tissue. J. Biol. Chem., 283: 35715-35723,2008. 22. Miura, S., Kamei, Y., et al. 2-AMPK activity is not essential for an increase in fatty acid
oxidation during low-intensity exercise. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 296: E47-E55,2009.
