明細書 発明の名称 : ムコール属由来のグルコースデヒドロゲナーゼ 技術分野 000 本発明はムコール由来のグルコースデヒドロゲナーゼ ( グルコース脱水素 酵素 ) その製造方法 及びその用途に関する 木出願は 年 7 月 0 日に出願された日木国特許出願第

(12) 特許協力条約に基づ て公開さ

_れ

た国際出願 (19)世界 知的所有 権機関 国際事務局 (10)国際公開番号 (43)国際公開日 2011 年 1月 13 日(13.01.2011)

_PCT

WO 2011/004654 A l

(51) 国際特 許 分類 (74) 理人: 台_{(HAGINOMikiharu); 〒5090109} C12N 9/02(2006.01) Cl 2Q 1/54(2006.01) 岐阜 各務 京市テ クノ _フラザ

₁

_丁目

₁

番地 C 2Q 1/32(2006.01) Gi血(JP). (21) 国際 出願 番 号 PCT/JP20 10/058603 (81) 定国(表示のな 限り_{、全ての種類の国 内保} 可 ) :AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,

(22) 国際 出願日 2010年5月2 1日(21.05.2010) _{BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, Cの,}

(25) 国際 出願の言語 日木語 CR, CU, CZ, DE, DK, DM, Dの, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS,

(26) 国際公開の言語 日木語 _{JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, L}

・K, L・R,

(30) 優先権データ LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW,

MX, MY, MZ, NA, NG, NI, Nの

特願2009-163208 2009 年7月10 日(10.07.2009) JP , NZ, OM, PE, PG, PH, PL, PT, Rの, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST,

(71) 出願人 ₍米国を除<全ての指定国につ1 て) :天 SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ,

野エンザ イム 株 式 会 (AMANO ENZYME INC.) VC, VN, ZA, ZM, ZW.

[JP/JP]; 〒4608630 愛 知県名古屋市 中 区錦一丁目

(84) 国(表示

2 番7 号 Aichi (JP). _可 のな 限り、全ての種類の哀域保

) :ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, (72) 発明者 および MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), --Lーラシア (75) 発明者/出願人 (米国につ1 てのみ) :杉浦 敏 行 (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ヨーロ ツパ (Sugiura Toshiyuki) JP/JP]; 〒5090109 岐阜県各務 (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR,

原市テ クノ_{フラザ ー丁目6 番 天野エンザ イ} GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT,

ム株 式 会 社 岐阜 研究 所内 Gifu (JP)_・廣 瀬 芳 NL, NO, PL, PT, RO, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BF,

J (HIROSE Yoshihiko) [JP/JP]; 〒5090109 岐阜県各 BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE,

務原市テ クノ _{フラザ ー丁目6 番 天野エンザ} SN, TD, TG).

イム株 式 会 社 岐阜研究 所内 Gifu(JP). _{添付公開書類}

国 帯 査報告 条約第2 1条 (3))

(54) Title:GLUCOSE DEHYDROGENASE DERIVED FROM MUCOR MICROORGANISM

(54) 発明の名 称 :ムコール属 由来のグルコースデヒドロゲナーゼ

(57) Abstract: Disclosed is an enzyme (glucose dehydrogenase) for use in the quantification of glucose, which has high practical appli・_{cability Sp i}・_fically ・_{sclosed i}・_{s glucose dehydrogenase deri}・_ved

甘om a mi・croorgani・sm belongi・ng to the genusM cor,w ・

・ ㏄ 山 ㎞ch

has the following properties: (1) activity: the enzyme can catalyze a reaction for oxidizing a hydroxy group in glucose in the pres ence of an el㏄吐on i㏄eptor to produce glucono-δ-lactone・, and (2) substrate sp㏄ificity:the enzyme has low reactivity withm al

tose, D-xylose and D-galactose.

(57) 要 約 実用性の高 グルコース定量用酵素 グルコースデヒドロゲナーゼ を提供する ことを課 題 とする 。 以下の特 性、即ち₍₁₎作用 電子受容体存 在下 で グルコースの水酸 基を酸 化 して グルコ ノーδ- ラ

ク トンを生 成する反応を触 媒する こと、(2)基質特異性 マ ル トース、D-キシロース、及びD-ガラク トー スに対する反応性 が 低 こと、を備 え る、ムコー ル 属 由来のグルコースデヒ ドロゲ ナーゼが提供され る。

明

細

書

発

明

の

名称

:

ム

コ

ー

ル属 由

来

の

グル

コ

ー

ス

デ

ヒ

ド

ロ

ゲ

ナ

ー

ゼ

技

術

分

野

０００ 本発明はムコール 由来の_グルコースデヒ ドロゲナーゼ ( グルコース脱水素 酵 素 ) 、その製造方法、及びその用途に関

す

る。木出願は、

2

_００9

年

7

月 「

０

日に出願された日木国特許出願第

2

_００9

「

6

3

_０

8

号に基づく_優 先権を主 張

す

るも_のであり_{、当該特許出願の全内容は参照によ}り_援用さ

_れ

る

背

景技

術

０００ _{糖 尿 病 患者の 自己血糖測定は極}

_め

_{て重要であ}り_{、血糖 値を特異 的に正確に} 測定できることが必要である。その用途に用いられる酵 素として グルコース オキシ ダ

一

ゼ (日 _{1 4) 依 存型グルコースデヒ ドロゲナーゼ (} ・ ・ ・ ・ ) p 依 存型グルコースデヒ ドロゲナーゼ (日 1 2) (例え ば特許 文献 「

～

3

を参照) 、

_「

依 存型グルコースデヒ ドロゲナーゼ ( ・ ０) (例えば特許 文献 、 、非特許 文献 「

～

を参照) 等 が挙 げられ るが、過去の報告にある よう_{に各酵 素にはそ}

_れ

_ぞ

_れ

_いく_{つかの欠 点が認}

_め

_ら

れ

る。 ０００3 _比較的良いとされている

_「

依 存型グルコースデヒ ドロゲナーゼでも基質特 異性に問題があり_{、測定値の正確性を損}

_ね

_{る場 合のあることが知られている} 。具体的には、糖 尿 病 患者の消化 管の吸収 性試験 で一般的に用いられるキシ ロースに対 して反 応

す

ることから、キシロース吸収試験中の糖 尿 病 患者 では 、血中にキシロース吸収試験 で吸収されたキシロースが 混在 し、血糖 値が実 際の値 より_高く_示さ

_れ

_てしまう_。 ０００ 一方、過去に報 告のあるアスペルギルス属の

_「

依 存型グルコースデヒ ドロ ゲナーゼはキシロースに対

す

る特異性 が悪 く_{、グルコース比でキシロースに} 対 して

～

程 度反 応

す

ることが知られている。また、アスペルギルス属は 一般に生育が遅く_{、酵 素を取得}

_す

_{るのに時間がかかる とい}う_問題も_ある。

〒支市_行

文

献 ０００ _{特許 文}献 : 特開2

_０００

_０

8 8 号公ま き_{許 文献 : 特開2}

_００

_{「一 「9}

_{7 8 8 8}

_号公ま き_{許 文献}3 _{: 特開2}

_００

「 号公ま き_{許 文献 : 国 公開第2}

_００

_０

₈

₉

₈

_{号パ ンフレツ ト} き_{許 文献 : 国 公開第2}

_００

₇

_「3

_{9 ０}

_{「3 号パ ンフレツ ト} ０００ ヨト_{特許 文献 : ud s On h g u c o s d hyd r og na s O s p r g s Or y} a

l

nduc o n O s Sy n h s s by p

b n oq

n o n an d hy droq n o n ・ ak an d a o och o p h y s c a 3 2 ( ) ヨト_{特許 文献 : ud s} On h g c o s d hyd r og na s O s p r g Us Or y a

l

pur c a o n an d phys c a an d Gh c a pr op r s _・ ak och o p h y s c a 3 2

₃

_{( )} ヨト_{特許 文献3 : ud s} On h g c o s d hyd r og na s O s p r g Us Or y a

l

n r a en y a c pr op r s _・ ak och o p h y s c a 3

3

( ) ヨト_{特許 文献 : ud s} On h g c o s d hyd r og na s O s p r g Us Or y a

l

d

r

s d u as an ac v S ・ ak an d a o och o p h y s c a 3

33

( )

発

明が解決

しよ

う

とする

課

題

０００ そこで本発明は、実用性の高いグルコース定量用酵 素 (_グルコースデヒ ド ロゲナーゼ) _を提 供

す

ることを課 題 と

す

る。

課 題

を解決

す

る

た

め

の

手

段

０００8 _{本発明者らは上記課 題に鑑}

_み

_{て鋭意検討 した。まず、供給の面からグルコ} ースデヒ ドロゲナーゼを生産

す

る生育の早い菌株を見出

す

ことが重要である

と考え、ムコール属 ( uc o

_{r )}

_に注目して グルコースデヒ ドロゲナーゼ生産菌 を探 索 した。ムコール属の場 合、培養液中に黒色 色素を多量に産生

す

ること が多く、さ ら_に培地成分により_{粘 性 成分 を含む場 合}も_あり_{、多数の菌株につ} いて目的の酵 素活性を確認

す

るた

め

には様

_々

な技 術が 要求され困難を極

め

た 。 しかし、鋭意検討の結 果、ムコール属に属

す

る多数の菌株 が基質特異性の 高いグルコースデヒ ドロゲナーゼを産生

す

ることを確認 した。中でもムコー ルプライ 二 ( c o

r

p

ra

) 、ムコール

ヤ

バニカス ( uc o

r

a va n cus) ムコールダイ モル フオスポラス ( uc o

r

o

rphospor

s ) 及びムコールサル ，_ンネ ロイデス ( uc o

r

c

rc

n o s ) が産生

す

る_グルコースデヒ ドロゲナ ーゼは基質特異性 が極

め

て高いも_のであ_った。このよう_{に、本発明者らの検} 討の結 果、グルコースデヒ ドロゲナーゼの生産菌 と してムコール属微 生物 が 非常に適 していることが判明

す

る と とも_に、実用性に優

れ

たグルコースデヒ ドロゲナーゼが 見出された。以下に示

す

本発明はこれらの成果に基づく_。尚 、ムコール属 由来のグルコースデヒ ドロゲナーゼに関

す

る報告は過 去に無_い 「 以下の特性を備 え る、ムコール属 由来のグルコースデヒ ドロゲナー ゼ : ( )作用 : 電子受容体存在 下 で グルコースの水酸 基を酸 化 して グルコノ一 む_{一ラク トンを生成}

_す

_{る反 応を触媒}

_す

_{る ;} ( )基質特異性 : マル トース、 キシロース、及び ガラク トースに対

す

る反 応性 が低い。

2

グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときの キシロースに対

す

る反 応性 が8 以下 である、 「 に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ。

3

グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときのマル トースに対

す

る反 応性、 グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときの ガラク トース に対

す

る反 応性 がとも_に 以下 である、 「 又 は

2

に記載のグルコー スデヒ ドロゲナーゼ。 マル ト_ース及び ガラク トースに対

す

る実質的な反 応性 がな_い、

3

に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ。 ムコールプラ イニ、ムコールヤバ ニカス、ムコールダイ モル フオ スポラス又 はムコールサルシ ネロイデスに由来

す

る酵 素 である、 「

～

の いず

れ

_か一項に記載の_グルコースデヒ ドロゲナーゼ。

6

ムコールプ ライ ニがムコールプ ライ二 株 ( 株 ) で あ り、ムコー_ルヤバニカスがムコー_ルヤバニカス 株であり、ムコー_ル ダイ モル フオスポラスがムコールダイ モル フオスポラス 3 株であり_、 ムコールサルシ ネロイデスがムコールサルシ ネロイデス 株である、 に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ。

7

ムコールプ ライ二に由来

す

る酵 素 であり_{、以下の特性を更に備 え る} 、 「

～

の いず

れ

_か一項に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ : (3) 分子量 : 約 6 万 a (ゲルろ過による ( ) 至適p : 付 近 ; ( )至適温度 : 5０。C付 近。

8

ムコールヤバニカスに由来

す

る酵 素 であり_{、以下の特性を更に備 え} る、 「

～

の いず

れ

_か一項に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ : (3) 分子量 : 約 万 a (ゲルろ過による) ; ( ) 至適p : 付 近 ; ( )至適温度 : 4０。C付 近。

9

以下のステ

_ッ

プ( )及び ( ) を含ん でな る、グルコースデヒ ドロゲナ ーゼの製造法 : ( )ヴルコースデヒ ドロゲナーゼ生産能を有

す

るムコール属微 生物 を培養

す

るステ

_ッ

プ ; 養後の培養液 及び 又 は菌体 より_、グルコースデヒ ドロゲナーゼを回 収

す

るステ

_ッ

プ。 「

_０

「

～

8

の いず

れ

か一項に記載のグルコースデヒ ドロゲナ ーゼを用_いて試料中のグルコースを測定

す

ることを特 徴 と

す

る、グルコース 測定法。

「 「 「

～

₈

_{の いず}

_れ

力 _{一項に記 載のグルコ}

_一

_スデヒ ドロゲナ

一

ゼを含むことを特 徴 と

す

る_グルコ

_一

ス測定用試薬。 「

2

「 「 _に記 載のグルコ

_一

ス測定用試薬を含_む、グルコ

_一

ス測定 用キ

_ッ

ト_。 ０００ 図 ムコールプ ライ二由来酵 素の至適 を示

す

グラフ。 図 ムコールプ ライ二由来酵 素の至適温度を示

す

グラフ。 図3 ムコールヤバニカス由来酵 素の至適 を示

す

グラフ。 図 ムコールヤバニカス由来酵 素の至適温度を示

す

グラフ。

発

明 を

実

施

する

た

め

の

形 態

００ ０ (用 木明細書において用語 「_単離さ

れ

た」は 「_{精 製} さ

れ

た」 と交換可能に使用 される。本発明の酵 素 ( グルコースデヒ ドロゲナーゼ) に関して使用

す

る場 合の 「_{単離された}」 _{とは、本発明の酵 素 が 天 然材料に由来}

_す

_{る場 合、当該天} 然材料の中で当該酵 素以 外の成分 を実質的に含ま ない (_特に交雑タ_ンパク質 を実質的に含ま ない) 状 態をいう_{。具体的には例えば、本発明の単離}さ

れ

た 酵 素 では、交雑タ_{ンパク質の}含有量は重量 換算で全体の約 ０ _{未 満、}好ま し く_{は約 ０ 未 満、更に好ま し}く_{は約 未 満、よ}り_{一層 好 ま し}く_{は約 未 満} である。尚、そ

れ

と異な る意味を表

す

ことが明ら_かでない限り_{、木明細書に} おいて単に 「グルコースデヒ ドロゲナーゼ」 _{と記載 した場 合は 「単離された} 状 態のグルコースデヒ ドロゲナーゼ」_を意味

_す

_る。 ００ (グルコースデヒ ドロゲナーゼ及びその生産菌) 本発明の第 「の局面はグルコースデヒ ドロゲナーゼ及びその生産菌を提 供

す

る。本発明のグルコースデヒ ドロゲナーゼ (以下、 「木酵 素」 とも_いう) は以下の特性を備 え る。まず、木酵 素は次の反 応、即ち、電子受容体存在 下 で グルコースの水酸 基を酸 化 して グルコノ一む_{一ラク トンを生成}

_す

_{る反 応を} 触媒

す

る。一方、木酵 素は基質特異性に優

れ

、 グルコースに対 して選択的 に作用

す

る。詳 しく_{は、木酵 素は キシロースに対}

_す

_{る反 応性 が極}

_め

_て低 く

、マル ト_{ースや ガラク} ト_{ースなどに対}

_す

_{る反 応性}も極

め

て低い。具体的に は グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときの キシロースに対

す

る反 応性 が8 以下 である。好ま しく_{は当該反 応性 が 以下 である。尚、後述の実} 施例に示

す

通 り_、ムコールプ ライ二又 はムコール_ヤバニカス由来の酵 素 では 当該反 応性 が を示 した。また、ムコールダイ モル フオスポラス又 はムコー ルサルシ ネロイデス由来の酵 素 では当該反 応性 が を示 した。 ００ 方、 グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときのマル トースに対

す

る反 応性、 グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときの ガラク トース に対

す

る反 応性 がとも_に 以下 である。好ま しく_{は当該反 応性 が実質０であ} る ( ちマル ト_{ース及びガラク} ト_ースに対

_す

_{る実質的な反 応性 がない}) 。 ００ 以上のよう_な優

_れ

_{た基質特異性を有}

_す

_{る木酵 素は、試料中のグルコース量} を正確に測定

す

るた

め

の酵 素として好ま しい。即ち、木酵 素によ

れ

ば試料中 に キシロース_やマル トース或_いは ガラク トースなどの交雑物 が存在 して いた場 合であ_っても目的のグルコース量をよ り_{正確に測定}

_す

_{ることが可能 で} ある。従って木酵 素は、試料中にこのような 交雑物の存在 が予想又 は懸 念さ

れ

る用途 (典 型的には血液中のグルコース量の測定) に適 したも_のである と いえ、しかも当該用途も含

め

様

々

な用途に適用可能 で あること、即ち汎用性 が高いともいえ る。尚、木酵 素の反 応性及び基質特異性は、後述の実施例に 示

す

方法で測定 ・評価

す

ることができる。 ００ 木酵 素の由来、即ち木酵 素の生産菌はムコール属微 生物である。本発明者 らの検討の結 果、様

_々

なムコール属微 生物 が グルコースデヒ ドロゲナーゼを 産生

す

ることが判明した。上記特性を有

す

る木酵 素を産生可能 で ある限り_に おいて生産菌は限定 されないが、好ま しく_{は、木酵 素はムコールプ ライ ニ、} ムコー_ルヤバニカス、ムコー_ルダイ モ_{ル フ}オスポラス又 はムコー_ルサ_ルシ ネ ロイデスに由来

す

る。生産菌は野生株 (天 然からの分離株であって、遺 伝子 操 作などの変異 ・改変処理が施されていないもの) で あ_っても変異株であっ てもよ_い。尚、ムコール属微 生物のグルコースデヒ ドロゲナーゼ遺 伝子を宿 主微 生物に導 入して得られた形質転 換 体が産生

す

るグルコースデヒ ドロゲナ

一

ゼもムコール属 由来のデヒ ドロゲナーゼに該 当

す

る。 ００ 木酵 素の生産菌の具体例を示

す

とムコールプ ライ二 ０株 (現在はムコ ールサルシ ネロイデス 株として保 管されて_いる) 、ムコールヤバニ カス 株、ムコー_ルダイ モ_{ル フォ}スポラス 3 株、ムコー_ルサ_ル シ ネロイデス 株である。これらの菌株は 力ルチ

_ャ

ーコ レクショ ン (独立行 政法人 製品評価 技 術 基盤機構バイオテクノ _{ロジー木部 生物遺} 伝資源 部門、 〒 9 ０8 8

日

木国千葉 県木更津市かずさ鎌 足

8)

に保 管さ

れ

た菌株であり_{、独立行 政法人 製品評価 技 術 基盤機構バイオテク}ノ _ロジー 木部 生物遺 伝資源 部門 ( ) より_{、所定の手続きを経 ることによってそ} の分譲を受けることができる。 ００ 以下の通 り_{木発明者らは、ム}コールプ ライ二 ０株 ( 株 ) が 産 生

す

るグルコースデヒ ドロゲナーゼとムコー_ルヤバニカス 株 が 産生

す

るグルコースデヒ ドロゲナーゼについてその分子量、至適 及び至適温度 を明ら_かにした (_{詳細は後述の実施例の欄に記載}

_す

る) 。また、これらのグ ルコースデヒ ドロゲナーゼが補酵 素結 合 型であることを確認 した。 ００ (ムコールプ ライ二 ０株 ( 株 ) 由来の_グルコースデヒ ドロゲナ ーゼ) 分子量 : 約 万 a (ゲルろ過による) ; 至適p : 付 近 ; 至適温度 : 5_０。_{C付 近。} ００8 (ムコール_ヤバニカス 株由来の_グルコースデヒ ドロゲナーゼ) (3) 分子量 : 約 万 a (ゲルろ過による) ; ( ) 至適p : 付 近 ; ( )至適温度 : 4_０。_{C付 近。} ００ _{分子量はゲル}ろ過で測定 した値である。至適 については後述の実施例に 示

す

よう_に例えば v バ

_ッ

フ_ァー中で測定 した値であり_{、至適温度につ} いても同様に例えば a バ

_ッ

フ_ァー (P 6 5 中で測定 した値である。 ００ ０ (グルコースデヒ ドロゲナーゼの製造法 )

本発明の更な る局面はグルコースデヒ ドロゲナーゼの製造法を提 供

す

る。 本発明の製造法では、グルコースデヒ ドロゲナーゼの生産能を有

す

るムコー ル属微 生物を培養

す

るステ

_ッ

プ (ステ

_ッ

プ( ) 及び培養後の培養液 及び 又 は菌体 より_、グルコースデヒ ドロゲナーゼを回収

す

るステ

_ッ

プ (ステ

_ッ

プ( ) ) が行わ

れ

る。 ００ ステ

_ッ

プ( )のムコール属微 生物として例えば上記のムコールプ ライ二 ０株 ( 株 ) 、ムコール_ヤバニカス 株、ムコールダイ モル フ ォスポラス 3 株又 はムコールサルシ ネロイデス 株を用_いるこ とができる。培養法及び培養条件は目的の酵 素 が生産さ

れ

るも_のである限り 特に限定 されない。即ち、グルコースデヒ ドロゲナーゼが生産されることを 条件として、使用

す

る微 生物の培養に適 合 した方法や培養条件を適 宜設定で きる。以下、培養条件として培地、培養 温度 及び培養時間を例 示

す

る。 ００ _培地としては、使用

す

る微 生物 が生育可能な培地 であ

れ

ば、如何な るも_の でも良_い。例えば、グルコース、シ

_ュ

クロース、ゲンチオビ_{オース、可溶性} デン プ ン、グリ_セ リ_{ン、デキス} トリ_{ン、糖蜜、有機酸等の}炭素源、更に硫 酸 ア ンモニ ウム、炭酸 ア ンモニ ウム、リン酸 ア ンモニ ウム、酢酸 ア ンモニ ウム 、ある_いは、ペ プ トン、酵母エキス、コーンステ_ィープリカー、カゼイ ン加 水分解 物、ふ

す

ま、肉エキス等の窒素源、更にカ リウム塩、マ グネシウム塩 、ナ トリ_ウム塩、リ_{ン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の}無機塩を添加 し たものを用いることができる。使用

す

る微 生物の生育を促進

す

るた

め

にビ タ ミ _ン、アミノ_{酸などを培地に添加 して}もよい。培地の は例えば約 3

～

8_、好 ま しく_は約

～

_{程 度に調整 し、培養 温度は通常約 ０}

～

_０。_{C 、好ま し}く_は約

～

3 。_{C程 度}で、

～

日間、好ま しく_は3

～

日間程 度 好気的条件下 で培養

す

る 。培養法としては例えば振揖 培養法、ジ

_ャ

ー ・フ_ァーメンターによる 好気的 深部培養法 が利用 で きる。 ００3 以上の条件で培養 した後、培養液又 は菌体 より_グルコースデヒ ドロゲナー ゼを回収

す

る (ステ

_ッ

プ( )) 。培養液から_回収

す

る場 合には、例えば培養上 清をろ過 (例えば珪藻 土をろ過助剤としたろ過 ) 、遠 心処理等

す

ることによ

って不溶物を除去 した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透 析 、各種クロマ ト_{グラフィーなどを適 宜組}

_み

_{合わせて分離、精 製を行}う_ことに よ り目的の酵 素を得 ることができる。他 方、菌体内から回収

す

る場 合には、 例えば菌体を加圧処理、超音波処理 などによって破砕 した後、上記 と同様に 分離、精 製を行う_ことによ り_{目的の酵 素を得 ることができる。尚、ろ過、遠} 心処理 などによ_って予

め

培養液から菌体を回収 した後、上記一連のエ程 (菌 体の破砕、分離、精 製) を行っても_{よい。尚、各精 製エ程では原則と}して グ ルコースデヒ ドロゲナーゼ活性を指標 と して分画 を行い、次のステ

_ッ

プ_へと 進む。但 し、予備試験などによって、適切な条件を既に設定可能な場 合には この限り_でない。 ００ 酵 素の精 製 度は特に限定 されないが、例えば比 活性 が ００

～

3００( g) 好ま しく_{は比 活性 が ０}

～

_{０( g) の状 態に精 製}

_す

_{ることができる。また} 、最終的な 形 態は液 体 状であっても_{固体 状} (_{粉体 状を}含む) で あっても_よい ００ (グルコースデヒ ドロゲナーゼの用途) 本発明の更な る局面は木酵 素の用途に関

す

る。この局面ではまず、木酵 素 を用いたグルコース測定法 が提 供される。本発明のグルコース測定法では木 酵 素による酸 化還元反 応を利用して試料中のグルコース量を測定

す

る。本発 明は例えば血糖 値の測定、食品 (調味料や飲料など) 中のグルコース濃度の 測定などに利用さ

_れ

る。また、発酵食品 (例えば食酢 ) 又 は発酵飲料 (例え ばビ_ールや酒) の製造エ程において発酵度を調べるた

め

に本発明を利用して もよい。 ００ _本発明はまた、木酵 素を含むグルコース測定用試薬を提 供

す

る。当該試薬 は上記の木発明のグルコース測定法に使用される。 ００ _本発明は更に、本発明のグルコース測定法を実施

す

るた

め

のキ

_ッ

ト _{( グル} コース測定用キ

_ッ

ト_{) を提 供}

_す

_{る。本発明のキ}

_ッ

ト_{は必須の構成 要 素として} 上記グルコース測定用試薬を含む。また、反 応用試薬、緩衝液、グルコース 標準液、容器などを任意の要素として含む。尚、本発明のグルコース測定キ

ッ

ト_{には通常、使用説明書 が添付}さ

れ

る。

実

施例

００8 (活性測定法) グルコースデヒ ドロゲナーゼは、電子受容体存在 下 で グルコースの水酸 基 を酸 化 して グルコノ_一む_{一ラク トンを生成}

_す

_{る反 応を触媒}

_す

_{る。グルコース} デヒ ドロゲナーゼ活性の検出は、下記の反 応 系で行_った。 数 ( ) _クルコース

s

_クルコ ラク トン 還元型

s

(

2 )

2還元型

s

B

2

s

f O a z a 式中の h na

hos

a を表 し

ro

ra or

u b u を表

す。

００ 反 応 ( ) において、グルコースの酸 化に伴_って還元型 が生成 し、更に 反 応 ( ) において還元型 による の還元によ り_{生成 した}

_or

_{a a を} n の波長で測定

す

る。酵 素活性 (ユニ

_ッ

ト) は以下の計算式によ_って算出さ

れ

る。 数

(

D

_酎一 D

拙

)

X

V

x d

酵素活

，性 一 一

2

０

X

X

_Vs

式中の は総液 量を、 s はサン プル量を、 ０ ・ はd

or a anの

・ o

l

eあ たり_の吸光係 数 (c ０5 _u ) を、 _・0 は光路長 (c ) を、 は希釈倍 数を そ

れ

ぞ

れ

表

す。

００ ０ ０ (

v)

トリ トン ００を含む ０ p 日 a 衝液p 5 2 5 、 グルコース溶液０_・０g L、3 p _溶液０ ・ L、及び ・ 溶液０・ Lを 混合 し、3 。_{Cで 分間保温後、上記 培養}ろ液０ ・ Lを添加 し、反 応を開始 した 。酵 素反 応の進行 と共に ０n に吸収 を持つ

or a an

が生成される。 分間

あたり_の ０n における吸光度の増加を測定

す

ることによ り_グルコースデヒ ド ロゲナーゼ活性を測定 した。 ００3 「_・ ムコールプ ライ二 ０株 ( 株) 由来グルコースデヒ ドロゲナ ーゼの取得 ( 「) 菌株の培養 ムコールプ ライ二 ０株 ( 株) を培養 し、培養液を得た。酵母 エキス0_・ (

v)

、大豆ペ プ トン0_・ (

v)

、グルコース _・０ (

v)

０ ０ (

_v)

g ０ ００ ０ (

v)

(p ) の組成からな る 前培養の培地を調 製 した。この液 体 培地 ０_Lを3００ _{三角 フ}ラスコに分注 し、 。 C 、 _・ a_{で ０分間殺菌 後、ム}コールプ ライ二 ０株 ( 株) を接種 し、3０。_{C 、} ００

_{r p}

で3日間培養 した。続いて以下の組成、即ちグルコー ス ０ ０ (

v)

as p 2 ０ ₍

_v)

_大豆ペ プ ト_{ン ０ (}

_v)

０ ０3 (

v)

０ ０2 (

v)

及び y

roq

on (p ０) か らな る木培養用の培地を調 製 した。この木培養の培地 ０

」

_を3０

」

ジヤー ・ファ ーメンター中で 。C 、 _・ a _{2００r p} で ０分間殺菌 後、3０。Cに冷却した。 上記前培養の培養液 ００_Lを木培養の培地に接種 し、3０。_{C 、}3 ０r p 、 _・０ a 、通気量０ ・ vv で 日間培養 した。ろ過後の培養液をサン プルとして上記 活 性測定法に供 した結 果、グルコースデヒ ドロゲナーゼ活性を確認 した。 ００3 ( ) グルコースデヒ ドロゲナーゼの精 製 培養液を遠 心分離、珪藻 土等のろ過助剤 を用いたろ過、限外ろ過、透 析に 供 し、低分子等を除去後、 日 _{p a}

_ros

_{L を用いて精 製 した。即ち、} 几 リン酸 緩衝液p 8_・ で平衡 化 した担体に培養液を供 し、一般的な手法 である a

Ⅲ

濃度の増加によ り_{溶出した。培養液に含ま}

_れ

_{る大量の黒色 色素は} 、担体に非常に強く_吸着

_す

_るた

_め

_{大部 分 を除去 可能 で あった。溶出画分は、} 前述の活性測定法によ り_グルコースデヒ ドロゲナーゼを確認 し、 目的の活性 を有

す

る画分 を回収 した。限外ろ過によ り_{濃縮、脱塩を行い、これを酵 素サ} ン プルとした。 ００33 ( ) 特性の検討

(

₃

「) 基質特異性 0 (

v)

トリ トン ００を含む ０ p 日 _{a バ}

_ッ

_フ 5 2 、 基質 ( グルコース、_マル トース、 キシロース又 は ガラク トース ) 溶液０_・０g L、3 p _溶液０ ・ L、及び ・ 溶液０・ Lを混合 し、3 。 C で 分間保温後、酵 素サン プル0・ Lを添加 し、反 応を開始 した。酵 素反 応に よ_って生成

す

る

or

a a nを ０n の吸光度で測定 し、 分間当たり_の

_{or a}

a_{nの生成量を測定}

_す

_{ることによ} り_{酵 素活性を測定 した。 グル}コースに対

す

る活性を ００ _とした各 基 質に対

す

る相対活性を算出した。その結 果、過去に 報告されて_いるグルコースデヒ ドロゲナーゼと比較 し、キシロースに対

す

る 反 応性 が著 しく_{低いことが判明した (表 「) 。さ らにマル} ト_{ースやガラク} ト ースには反 応せず、血糖測定に適 した性質を有 していることを確認 した。尚 、 日 _pha

_ros

_{L による精 製の役に}

_p

_a

_ros

「

a s

_「

を実施

す

ることによ り更に純度を高

め

て特異性を確認 したところ、同様の結 果であっ た_０ 表

基

質

木目六_寸

_舌

化亡

グル

コ

ー

ス

00

マル

ト

ー

ス

０

キ

シ

ロ

ー

ス

4

ガ

ラ

ク

ト

ー

ス

０

００3 ₍ ) 至適 0 (

v)

トリ トン ００を含む ００ n バ

_ッ

フ (p 、p

・ 、p ・0、p ・0、又 はp 8・0に調整) 2 L、 グルコース溶液０・ L 3 p _溶液０ ・ L、及び ・ 溶液０・ Lを混合 し、3 。 Cで 分間保温後 、酵 素サン プル0 ・ Lを添加 し、反 応を開始 した。酵 素反 応によって生成

す

る o r a a nを n の吸光度で測定 し、 分間当たり_{の o r a a nの生成量を} 測定

す

ることによ り_{酵 素活性を測定 した。ム}コールプ ライ二 株 ( 株) 由来グルコースデヒ ドロゲナーゼの至適 は、 _・0であ_った (図「) ００3 _{( 一3 ) 至適温度} 0 (

v)

トリ トン ００を含む ０ p 日 _{a バ}

_ッ

_フ 5 2

I

グルコース溶液０_・ L_、3 p _溶液０ ・ L、及び ・ 溶液０・

」

_{を混合 し、} 4０ 5０ 5 _は ０。Cで 分間保温後、酵 素サン プル0 ・ Lを添 加 し、 4０ 5０ 5 _は ０。Cで反 応を開始 した。酵 素反 応によ_って生成

す

る o r a a nを ０n の吸光度で測定 し、 分間当たり_{の o r a a nの生成量} を測定

す

ることによ り_{酵 素活性を測定 した。ム}コールプ ライ二 ０株 ( 株) 由来グルコースデヒ ドロゲナーゼの至適温度は約 ０。Cであ_った ( 図2 ) o ００3 _{(3 ) 子量} L (ゲルろ過 東ソ

一

製 L 3０００ カラムを使用) _によ り_分子 量を測定 した。その結 果、分子量は約 万 aであ_った。 ００3 ₍ ) 作用機序 一般的な_グルコースオキシ ダ

一

ゼの測定系 ( ０ ph nor系) で酵 素サン プルの活性を調べた。その結 果、ほとん ど活性は認

め

られず、酵 素サン プル 中の_{酵 素 が グル}コースオキシ ダ

一

ゼではなく_{、グルコースデヒ ドロゲナーゼ} であることが確認された。一方、透 析によ り_{活性 が低下せず、補酵 素結 合 型} のグルコースデヒ ドロゲナーゼであることを確認 した。 ００3 ・ ムコールヤバニカス 株由来グルコースデヒ ドロゲナーゼの取得 ( 「) 菌株の培養 ムコールプ ライ二 ０株 ( 株) の場 合 と同様の条件でムコール

ヤバニカス 株を培養 し、培養液を得た。ろ過後の培養液をサン プル として上記 活性測定法に供 した結 果、グルコースデヒ ドロゲナーゼ活性を確 認 した。 ００3 ( ) _グルコースデヒ ドロゲナーゼの精 製 ムコールプ ライ二 ０株 ( 株) の場 合 と同様の条件で培養液を 精 製 し、酵 素サン プルとした。 ００ ０ ( ) 特性の検討 (

₃

「) 基質特異性 ムコールプ ライ二 ０株 ( 株) の場 合 と同様の方法で基質特異 性を検討 した。その結 果、過去に報 告されているグルコースデヒ ドロゲナー ゼと比較 し、キシロースに対

す

る反 応性 が著 しく_{低いことが判明した (表}

₂

) 。さ らにマル ト_{ースやガラク} ト_{ースには反 応せず、血糖測定に適 した性質} を有 していることを確認 した。尚、 日 _pha

_ros

_{L による精 製の後に} a

ros

_「

a s

_「

を実施

す

ることによ り_{更に純度を高}

_め

_{て特異性を確認} したところ、同様の結 果であ_った。 表

基

質

相

対

活

性

グル

コ

ー

ス

100

マル

ト

ー

ス

０

キ

シ

ロ

_ー

ス

4

ガ

ラ

ク

ト

ー

ス

０

００ (

3

) 至適

ムコールプ ライ二 ０株 ( 株 ) の場 合 と同様の方法で至適 を 求

_め

た。ムコー_ルヤバニカス 株由来グルコースデヒ ドロゲナーゼの 至適 は、 ・0 で あった (図

3

) o ００ ( ) 至適温度 ムコールプ ライ二 ０株 ( 株 ) の場 合 と同様の方法で至適温度 を求

_め

た。ムコー_ルヤバニカス 株由来グルコースデヒ ドロゲナーゼ の至適温度約 ０。C で あ_った (図 o ００3 (

3

) 子量 L (ゲルろ過 東ソ

一

製 L 3０００ カラム を使用 ) により_分子 量を測定 した。その結 果、分子量は約 万 a_{であった。} ００ ( ) 作用機序 一般的な_グルコースオキシ ダ

一

ゼの測定系 ( ０ p no

r

系) で酵 素サン プルの活性を調べた。その結 果、ほとん ど活性は認

め

ら

れ

ず、酵 素サン プル 中の_{酵 素 が グル}コースオキシ ダ

一

ゼではなく_{、グルコースデヒ ドロゲナーゼ} であることが確認された。一方、透 析により_{活性 が低下せず、補酵 素結 合 型} のグルコースデヒ ドロゲナーゼであることを確認 した。 ００

3

・ 他の菌株由来のグルコースデヒ ドロゲナーゼの取得 ( 「) _菌株の培養 ムコー_ルプ ライ二 ０株 ( 株 ) の場 合 と同様の条件でムコール ダイ モル フ_ォスポラス ( uc o

_r

o

rphosporus)

3 _株及びムコールサ ルシ ネロイデス ( uc o

r

rc

n d s ) 株を培養 し、培養液を得 た。ろ過後の培養液をサン プルとして上記 活性測定法に供 した結 果、いず

れ

の菌株に_ついてもグルコースデヒ ドロゲナーゼ活性を確認できた。 ００ ( _{) グル}コースデヒ ドロゲナーゼの精 製 ムコールプ ライ二 ０株 ( 株 ) の場 合 と同様の条件で培養液を 精 製 し、酵 素サン プルとした。 ００ ( 特性の検討 ムコー_ルプ ライ二 ０株 ( 株 ) の場 合 と同様の方法でムコール

ダイ モル フオスポラス由来の酵 素及びムコールサルシ ネロイデス由来の酵 素 の基質特異性を検討 した。その結 果、過去報 告さ

れ

て

い

るヴルコースデヒ ド ロゲナーゼと比較 し_、いず

れ

の酵 素に_ついてもキシロースに対

す

る反 応性 が 著 しく_{低いことが判明した (表}

₃

_{、 ) 。さ らにマル} ト_ースやガラク ト_ース には反 応せず、血糖測定に適 した性質を有 していることを確認 した。 ００8 ムコールダイ モル フオスポラス 3 株由来の酵 素の基質特異性 ) 表

基

質

相

対

活

性

グル

コ

ー

ス

100

マル

ト

ー

ス

０

キ

シ

ロ

_ー

ス

ガ

ラ

ク

ト

ー

ス

０

００ ( ムコールサルシ ネロイデス 株由来の酵 素の基質特異 生₎

表

基

質

相

対

活

性

グル

コ

ー

ス

00

マル

ト

ー

ス

０

キ

シ

ロ

ー

ス

5

ガ

ラ

ク

ト

ー

ス

０

００ ０ _尚、更に検討を進

め

た結 果、ムコールヒエメイルズ、ムコールロキシ アナ ス、ムコー_{ル マ}ンシ

_ュ

リカス、ムコー_ルパ シ ラス、ムコー_ルサチ ライ シムス 及びムコー_ルプ ランベウスに_ついても_グルコースデヒ ドロゲナーゼ生産能を 認

_め

、ムコール属 が グルコースデヒ ドロゲナーゼの生産菌 と して有用 である ことが示された。

産

業

上

の

利

用

可

能

性

００ _本発明のグルコースデヒ ドロゲナーゼは基質特異性 が高く_{実用性に優}

_れ

_る 。また、生育の早いムコール属に由来

す

ることから、効率的な 生産に適 し、 安定的な供 給が可能とな る。本発明のグルコースデヒ ドロゲナーゼは血糖 値 の測定や食品 (調味料や飲料など) 中のグルコース濃度の測定などに好適で ある。 ００ この発明は、上記発明の実施の形態 及び実施例の説明に何ら限定 されるも のではない。特許 請求の範

囲

の記載を逸脱せず、当 業者 が 容 易に想到 で きる 範

囲

で種

々

の変形態 様も この発明に含ま

れ

る。 木明細書の中で明示した論 文、公開特許 公報、及び特許 公報などの内容は 、その全ての内容 を援用によ_って引用

す

ること と

す

る。

請

求

の

範

囲

請求項 以下の特性を備 え る、ムコール属 由来のグルコースデヒ ドロゲナー ゼ : ( )作用 : 電子受容体存在 下 で グルコースの水酸 基を酸 化 して グ ルコノ_一む_{一ラク トンを生成}

_す

_{る反 応を触媒}

_す

_{る ;} ( )基質特異性 : マル トース、 キシロース、及び ガラク トー スに対

す

る反 応性 が低い。 請求項 グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときの キシロースに 対

す

る反 応性 が8 以下 である、請求項 「に記載のグルコースデヒ ド ロゲナーゼ。 請求項 グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときのマル トースに対

す

る反 応性、 グルコースに対

す

る反 応性を ００ としたときの ガ ラク ト_ースに対

す

る反 応性 がともに 以下 である、請求項 「又 は

2

に記載の_グルコースデヒ ドロゲナーゼ。 請求項 マル ト_{ース及び ガラク} ト_ースに対

す

る実質的な反 応性 がない、請 求項

3

に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ。 請求項 ムコールプ ライ ニ、ムコールヤバニカス、ムコールダイ モ_{ル フ}オス ポラス又 はムコールサルシ ネロイデスに由来

す

る酵 素 である、請求項 「

～

の いず

れ

_か一項に記載の_グルコースデヒ ドロゲナーゼ。 請求項 ムコールプ ライ ニがムコールプ ライ二 ０株 ( 株 ) で あり、ムコールヤバニカスがムコールヤバニカス 株であり、 ムコールダイ モル フオスポラスがムコールダイ モル フオスポラス 3 株であり_、ムコールサルシ ネロイデスがムコールサルシ ネロイデ ス 株である、請求項 に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ 請求項 ムコールプ ライ二に由来

す

る酵 素 であり_{、以下の特性を更に備 え る} 、請求項 「

～

の いず

れ

_か一項に記載の_グルコースデヒ ドロゲナーゼ

(3) 分子量 : 約 万 a (ゲルろ過による) ; ( ) 至適p : 付 近 ; ( )至適温度 : 5０。C付 近。 請求項 ムコールヤバニカスに由来

す

る酵 素 であり_{、以下の特性を更に備 え} る、請求項 「

～

の いず

れ

_か一項に記載の_グルコースデヒ ドロゲナー ゼ : (3) 分子量 : 約 万 a (ゲルろ過による) ; ( ) 至適p : 付 近 ; ( )至適温度 : 4０。C付 近。 請求項 以下のステ

_ッ

プ( )及び ( ) を含ん でな る、グルコースデヒ ドロゲナ ーゼの製造法 : ( ) グルコースデヒ ドロゲナーゼ生産能を有

す

るムコール属微 生物 を培養

す

るステ

_ッ

プ ; ( ) _{養後の培養液 及び 又 は菌体 よ}り_{、グルコースデ}ヒ ドロゲナ ーゼを回収

す

るステ

_ッ

プ。 請求項 ０ 請求項 「

～

8

の いず

れ

か一項に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ を用いて試料中のグルコースを測定

す

ることを特 徴 と

す

る、グルコー ス測定法。 請求項 請求項 「

～

8

の いず

れ

か一項に記載のグルコースデヒ ドロゲナーゼ を含むことを特 徴 と

す

るグルコース測定用試薬。 請求項 請求項 「 「に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定 用キ

_ッ

ト_。

INTERNATIONAL SEARCH REPORT International application No. PCT/JP2010/058603

A . CLASSIFICATION OFSUBJECT MATTER

C1

2N9/02

(2006. 01)

i , C12Q1

/32

( 2 0 0 6 . 0 1 ) i , C12Q1

/54

( 2 0 0 6 . 0 1 ) i

According toInternational Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC

B . FIELDS SEARCHED

Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)

C12N9/02, C12Q1/32, C12Q1/54

Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched

Jitsuyo Shinan Koho 1922-1996 Jitsuyo Shinan Toroku Koho 1996-2010

Kokai Jitsuyo Shinan Koho 1971-2010 Toroku Jitsuyo Shinan Koho 1994-2010

Electronicdata base consulted during the international search (nameofdata base and, where practicable, search terms used)

CAPlus/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS (STN) , JSTPlus/ JMEDPlus/ JST7580 (JDreamir

C . DOCUMENTSCONSIDERED TO BERELEVANT

Category* Citationofdocument,with indication, where appropriate,oftherelevant passages Relevant to claim No.

X/A DOW, J . M . et al., Substrate-dependent 9/1-8 , 10-12

activation o f uridine diphosphoglucose

dehydrogenase from the dimorphic fungus Mucor rouxii, Experimental Mycology, 1981, Vol. 5 ,

p .60-68, particularly, page 61, left column, 2nd paragraph, page 62, left column, 3rd paragraph, abstract

A W O 2007/139013 A l (Amano Enzyme Inc.), 1-9

0 6 December 2007 (06.12.2007),

particularly, claims 1 , 7 ; paragraph [0049];

table 3

& U S 2009/0181408 A l & E P 2022850 A l

& CN 101454443 A

Further documents are listed in the continuation of BoxC . See patent 伍 ily annex.

* Special categories of cited documents: " " _{later document published after the international filing date or priority} "A" document defining the general state of the art which is not considered date and not in conflict with the application but cited to understand

to be of particular relevance the principle or theory underlying the invention

"E" earlier application or patent but published on or after the international "X" document of particular relevance; the claimed invention cannot be filing date considered novel or cannot be considered to involve an inventive "L" document which may throw doubts on priority claim(s) or which is step when the document is taken alone

cited to establish the publication date of another citation or other γ" _{document of particular relevance; the claimed invention cannot be} special reason (as specified) _{considered t o involve an inventive step when the document is} "O" document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other means combined with one or more other such documents, such combination "P" document published prior to the international filing date but later than being obvious to a person skilled in the art

the priority date claimed "&" document member of the same patent family

Date of the actual completion of the international search Date of mailing of the international search report

0 9 August, 2010 (09.08.10) 1 7 August, 2010 (17.08.10)

Name and mailing address of the ISA/ Authorized officer

Japanese Patent Office

Facsimile No. Telephone No.

INTERNATIONALSEARCH REPORT International application No. PCT/JP2010/058603 C (Continuation). DOCUMENTSCONSIDERED TO BERELEVANT

Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.

A W O 2004/058958 A l (Ikeda Food Research Co., 1-9

Ltd.) ,

1 5 July 2004 (15.07.2004) ,

particularly, claims 1 , 8 ; table 1

& U S 2006/0063217 A l & E P 1584675 A l & CA 2511656 A & CN 1726277 A

国際調査 報告 国際出願 番 号 ノ ノ A_・ 発明 の属する_{分 野 の分}類 (国際特許分類 ( I P C ) ) Int Cl C12N9/02 (2006. 01) i , C12Q1/32 (2006. 01) i , C12Q1/54 (2006. 01) i B_・ 調査を行 た分 野 調査を行 た最小 限資料 (国際特許分類 ( I P C ) Int Cl C12N9/02, C12Q1/32, C12Q1/54 最小 限資料以外の資料て調査を行 た分 野 に含 まれるもの 日本国実用新案公報 1 9 2 2 1 9 9 6午 日本国公開実用新案公報 1 9 7 1 2 0 1 0午 日本国実用新案登録公報 1 9 9 6 - 2 0 1 0午 日本国登録実用新案公報 1 9 9 4 - 2 0 1 0午 国際調査て使用した電子テ タ ス テ タ スの名称、調査に使用した用譜

CAPlus/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS (STN), JSTPlus/TMEDPlus/ TST7580(JDreamll)

C _・ 関連する 認 められる文献

引用文献の 関連する

カテ ホ 引用文献名 及ひ 部の箇所か関連する きは、そ の関連する箇所の表示 請 求項の番号

/ A

DOW, J

・M . et al. , Substrate-dependent activation o f uridine 9 / 1-8, 10-12

diphosphoglucose dehydrogenase from the dimorphic fungus Mucor rouxii,

Experimental Mycology, 1981, Vol. 5 , p .60-68,

特に、6 1頁左欄2段落、62頁左欄3段落、Abstract A W O 2007/139013 A l (天野 ンザイム株式会社) 2007. 12. 06, 1-9 特に、請求項 1,7 [0049]、表 3 U S 2009/0181408 A l EP 2022850 A l CN 101454443 A 洋 C欄 の続 きにも文献か 挙さ_れて る_{。 ヴ テ}y ト ア に関する別紙 を参 。 ホ 引用文献の力テ の日の役に公表さ_れた文献 ΓA 特に関連のある文献てはな<、 般的技術水 準を示す ΓT 国際出願日又 は優先日後に公表さ_{れた文献てあ て} もの 出願 矛盾するものてはな 、発明 の原理又 は理 論 ΓE 国際出願日前 の出願または特許 て あるか、国際出願日 の理解 のため に引用するもの 以 後に公表さ_れたもの ΓX 特に関連のある文献てあ て、当該文献のみて発明 ΓL 優先権主張に疑義を提 起する文献又 は他の文献の発行 の新規性 又 は進歩性 かな 考えられるもの 日若し は他の特別な理 由を確立する_{た め に 引}用す ΓY 特に関連のある文献てあ て、当該文献 他の1以 る文献 理 由を付す 上の文献t の、当業者 に て自明 てある組合 に ΓO 口頭による開示、使用、展示等 に言及する文献 よ て進歩性 かな 考えられるもの r p 国際出願日前 て、か 優先権の主張の基礎 なる出願 Γ& J 同 テ ト ア 文献 国際調査を完了した日 国際調査 報告 の発 送日 0 9 . 0 8 . 2 0 1 0 1 7 . 0 8 . 2 0 1 0 国際調査機 関の名称及ひあて先 特許庁審 査官 権限のある職員 4 B 3 3 3 5 日本国特許庁 ( I S AノJ P ) 吉田 知美 郵便番号1 0 0 - 8 9 1 5 東京 都千代田区霞か関三T 4 番 号 電話番 号 0 3 - 3 5 8 1 - 1 1 0 1 内線 3 4 4 様式P C TノI S Aノ2 1 0 (第2 ) ( 2 0 0 9午7 月 )

国際調査報告 国際出願番 号 ノ C (続 き) _・ 関連すると認 めら_れる文献 引用文献の 関連する テ ホ 引用文献名 及ひ 部の箇所か関連するときは、そ の関連する箇所の表示 請 求項の番号 A W O 2004/058958 A l (池 田食研株式会社) 2004.07. 15, 1-9 特に、請求項 1,8、表 1 U S 2006/0063217 A l EP 1584675 A l CA 2511656 A CN 1726277 A 様式PCT ノI S A ノ2 1 0 (第2 の続 き) (2 0 0 9_午7月)