アミノ酸のエドマン型蛍光試薬の開発

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

アミノ酸のエドマン型蛍光試薬の開発

今給黎, 修

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University

https://doi.org/10.11501/3075410

出版情報：Kyushu University, 1993, 博士（薬学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

アミノ酸のエドマン型蛍光試薬の開発

( 1 9 9 4)

今給禁 修

の

アミノ酸のエドマン型蛍光試薬の開発

(1994)

今給禁 修

目次

緒論 1

第1章 3-(2-フェナンスラオキサゾリル)フェニルイソチオ シアネートによるアミノ酸のプレカラム蛍光誘導体 化とHPLC

1 - 1

基準操作

1

- 2

蛍光スペクトルと安定性

10

1

-

³ rn-POPTC-アミノ酸及び、rn-POPTH-アミノ酸のHPLC分離

条件

15

1

-

⁴ 誘導体化反応条件

23 1

_- 5 反応収率， 検量線及び検出限界

31

1 - 6 トリペプチドのエドマン分解

33

1 - 7 小括

40‘

第2章 4-(2-フェナンスラオキサゾリル)フェニルイソチオ シアネートによるアミノ酸のプレカラム蛍光誘導体

イヒとHPLC 42

2 - 1 基準操作

2 - 2

蛍光スペクトルと安定性

2

- 3 アミノ酸誘導体のHPLC分離

2 - 4 誘導体化反応条件

nJb anuτ 円Ef

41ム

an吐 anuz an- r「U

2 - 5 反応収率， 検量線及び検出限界 ₅₅

2

-

⁶ 小括 ⁵⁸ 98

謝辞

99

実験の部 第3章

4-(2ーシアノイソインドリル)フェニ♂ルイソチオシア

ネートよるア ミノ酸及びジペプチドのプレカラム蛍 ¹⁰⁵

参考文献

光誘 導体化とHPLC ₆₁

3

^{- 1} 基準操作 ^{6 1}

3

- 2 蛍光スペクトルと安定性 ₆

4 3 - 3

アミノ酸誘導体のHPLC分離 ₆₇

3 - 4

ジペプチド誘導体のHPLC分離 ₆₉

3

-

⁵ 誘導体化反応条件 69

3

- 6 反応収率， 検量線及び検出限界 78

3

^{- 7} 小括 ⁷⁸

第4章 4-(2-シアノイソインドリル)フェニルイソチオシア

ネートを用いたトリペプチドの蛍光エドマン分解 ₈₁

4

^{- 1}

基準操作

4

^{- 2} カッフリング反応条件

4 - 3

反応収率と検量線

4 - 4

トリペフチドのエドマン分解

4

- 5

小括

414 n‘u

《hu

nwu r「U nHU nku

nHU

nHU nud

総括 ⁹⁶

緒論

近年， 医学や分子生物学などの幅広い研究分野において タンパク 質及びペプチドの遺伝子レベルでの研究が行われ， またタンパク質 の機能を調べるためにも ， タンパク質あるい はペプチドのアミノ酸 組成及びそのアミノ酸配列順序の決定は欠くことのできない重要な 分析手法である.

ペプチドのアミノ酸分析及びアミノ酸配列決定を 行うにあたって

まず必要なことは， アミノ酸及びペプチドのN末端アミノ基と選択 的に反応する試薬を見出すことである. また近年の生体成分の分析 において は， 測定対象物質が微量であることが多いので， 高感度な 測定法も要求されている. そこで高選択的かっ高感度測定が期待で きる手法として蛍光法が挙げられる. 発蛍光性の官能基を蛍光プロ ーブとしてアミノ基と反応する試薬に導入するか， あるい はそれ自 身は無蛍光性でありながらアミノ基と反応し発蛍光するような試薬 を新たに開発し， アミノ酸及びペプチドを蛍光誘導体に導くことに より高選択的かっ高感度な測定が可能になる.

アミノ酸分析法の開発は ， 1951年のSteinとMooreのニンヒドリン 反応1 ) の条件確立及びイオン交換クロマトグラフィーの導入2) が 最初である. さらに改良が加えられ1958年にはアミノ酸の自動分析 計が考察された3. 4 ì その後1970年頃から高速液体クロマトグラフ ィー(HPLC)が導入され始め， 現在自動分析計のポストカラム反応検 出システムの中にはprnol単位の 微量アミノ酸分析が可能な ものもあ る引. アミノ酸のHPLCにおけるポストカラム誘導体化反応に用い ら れる種々の蛍光試薬が開発され ている. 代表的 な試薬として， 第一

級アミンと反応するフルオレ ッサミンf.

.

⁷ )及びo -フタルアルデヒド (OPA)3-14J， また第一，

二級アミンとも反応する 4-フルオロー7- ニト

ロベンゾオキサジアゾール(NBD-F)15-18iなどがある.

またアミノ酸のプレカラム誘導体化試薬としては上述の試薬のほ かに， _2， 3-ナフタレンジアルデヒド(N D A) ^{1 �I}

-

^{2 2} )及び1ージアミノナフ タレン-5-スノレホニルクロライド(ダンシルクロライド)とトと7)などが

Chart 1 Edman degradation of peptide ^with PITC

。即 NH2-ーCH-co-NH-CH-CO-NH一ーCH-CO- ^R1 f2 fs

Peptide

挙げられ， 高感度アミノ酸分析にしばしば用いられている.

一方ペプチドのN末端アミノ酸決定法としては， 1945年に Sanger が開発したトフルオロー2，4-ジニトロベンゼンを用いる 方法(DNP法) が最初で あると::; ) さらに Sangerはこの方法を用いて1953年に初めて

4ンシュリンの全一次構造を決定したととり. DNP法は低感度で長時聞 を要するという欠点、があったが， Grayらが開発したダンシルクロラ イドを用いるDNS法主o iは高感度なN末端アミノ酸分析を可能にした.

しかし数種のアミノ酸の同定ができないという問題点、があり一般的 に使用するのが難しい. これに対し1949年にEdmanにより開発された フェニルイソチオシアネート( P1 TC)法汁一川Jはエドマン分解法と呼 ばれ， PITCとペプチドを塩基性条件下で反応させ， 生じるチオカル

パモイル誘導体からN末端アミノ酸をチアゾリノン誘導体として遊 離させ， 酸性条件下でチオヒダントイン誘導体に導き分離測定する (Chart 1). この手法は段階的にペプチドのN末端側からアミノ酸を

1残基ずつPITC 誘導体として遊離させる ことができるので， アミノ酸 配列決定iこ最も効率が良く， 現在でも多くの研究者の間で広く利用

Coupling 陀action

C〉-NH-f-NH-L-co-rlreo-NH-L-coー

Cleavage reaction

?2 1 fa

NH2-CH-

^co-

NHーCHーCOー

。 ペ _{X _R1}

Thiazolinone derivative

|

…n reaction

ひいR1

Thiohydantoin derivative

Next 問action

されている.

今日ま で， 多くのPITC類似試薬が開発されている. uv試薬として 4-ジメチルアミノー3. 5-ジニトロフェニルイソチオシアネートさ巳J，

ナフチルイソチオシアネート36j， ペンタフルオロ フェニルイソチオ シアネート27i， 発色試薬としてジフェニルインドニルイソチオシア

Chart 2

Synthetic route of 3・ or4・(2・phenanthra[9'，10・-d]oxazolyl)phenylisothiocyanate

(m-

or p-POPIC)

ネート�; 8:'， p_フェニルアゾフェニルイソチオシアネート39〉，

4-N，

:�ネO2

NaBH4・CoCt2

N-ジメチルアミノアゾベンゼンー4'ーイソチオシアネート(DABITC)

48-44〉， さらに高感度化を目的として開発された蛍光試薬として4-

^Reflux

1 〉Qm

csα2

__

(c;HshN

し/O ) X

: m-POPIC

N，N-ジメチルアミノ-1-ナフチルイソチオシアネート45\ フルオレ ッセインイソチオシアネート(FITC)4t3.47J， 4-(5-ジメチルアミノー

1ーナフチルスルホニル)フェニルイソチオシアネート(DNSAPITC)

48.49 K 4一(N-t-ブトキシカルボニルアミノメチル)フェニルイソ チ オシアネート(BAMPITC)SØ.Sl)， 7-N，N-ジメチルアミノスルホニルベ ンズオキサジアゾールイソチオシアネート(DBD-NCS)， 7-アミノスル ホニルベンズオキサジアゾールイソチオシアネート(ABD-NCS) 5.2)な

Compound 1 Compound 11

x =

--O-NCS

_{: p-}

どがあげられる. 従来よりN末端アミノ酸を薄層クロマトグラフイ ー(TLC)で同定する手法 が用いられているが， 最近ではHPLCを組み合

わせることによってより迅速かっ微量化 が進んでいる. これらの試 薬 の中でもDABITC， FITC及びDNSAPITC などの実用化研究が進み多数の 報告がなされている. しかしながら， こ れらのエドマン類似試薬 は

ペプチドとのカップリングが完全でなく， カップリング反応時に未 反応のペプチドをPITCによって反応させるダブルカップリング法を 必要とするら3-�引.

Chart 3

Synthetic route of 4-(2・cyanoisoindolyl)phenylisothiocyanate (CIPIC)

αCHO

p-Aminoacetoanilide in MeOH， 20・28"C^{K01 in H20}

�:O-NHCOCH3

0・Phthal.aldehyde Compound 1[1

著者は， 分子内にイソチオシアネート基を有し， かつより高感度，

高反応性が期待できるエドマン類似蛍光試薬の開発を目的とし， 3-

Hα』

in EeOH，陀l1ux

�N-{}NH2

csα2..._

(c;HshN

�:ONCS

Compound IV CIPIC

及び 4-(2-phenanthra[g・， 10・-d]oxazolyl)phenylisothiocyanate (m- 及び p-POPIC)(Chart 2)， 及び4-(2-cyanoisoindolyl)phenyl- isothiocyanate(CIPIC) (Chart 3)の3種を合成した. これらのエドマ

-4-

ン類似試薬はPITCと同様に塩基性条件下でアミノ酸とカップリング

しチオカルパモイル誘導体を形成し， 酸性条件下でチオヒダントイ ン誘導体へ変換されるものと考えられる.

第1章では， まずrn-POPIC及び そのアミソ酸誘導体の蛍光スペクト ルを各種溶媒を用いて測定し蛍光検出HPLCへの適応性を調べた. 次 に逆相HPLCによってアミノ酸の蛍光誘導体化反応条件及び各アミノ 酸誘導体の分離条件を検討した. さらにトリペプチドを例に 用いて 本試薬のエドマン分解への応用の可能性を検討した.

第2章では， rn-POPICと場合と問機にp-POPICとそのアミノ酸誘導 体の蛍光HPLCへの適応性の検討及びアミノ酸の蛍光誘導体化反応条 件の検討を行った.

第3章ではJ CIPICとそのアミノ酸及びジペプチド誘導体の蛍光

HPLCへの適応性を検討し， 蛍光誘導体化反応条件の検討を行った.

またジペプチドのN末端アミノ酸分析を行った.

第4章では塩基触媒としてピリジン を用いて新たにカップリング反 応条件の検討を行った. またそれらの条件に基づき， トリペフチド

(Ala- Leu-Gly)をモデルペプチドとして含水溶液中におけるエドマン 分解について検討した.

-6-

第1章 3-(2-フェナンスラオキサゾリル)フェニルイソチオシアネ ートによるアミノ酸のプレカラム蛍光誘導体化とHPLC

フェナンスラキノンにニトロベンゼンを縮合させて合成される 56)フェナンスラオキサゾールは強い 蛍光を発することが知られてい る. 著者らはこのフェナンスラオキサゾール基にフェニルイソチオ シアネートを導入した蛍光試薬rn-POPICを合成した(実験の部参照).

m-POPICは分子内にイソチオシアネート基を有することより， アミノ 酸と塩基性条件下で反応しカップリング体であるチオカルパモイル 誘導体(m-POPTC-アミノ酸)を形成し， 酸性条件下でチオヒダントイ ン誘導体(m-POPTH-アミノ酸)へ変換すると考えられる(Char_t

1-1).

本章ではm-POPICによるアミノ酸誘導体の蛍光検出HPLCによる分析 条件 の検討を行った. 更に， その条件を用いて， トリペプ チドのエ ドマン分解を試みた.

1 - 1 基準操作

(1) 蛍光誘導体化反応(Fig. 1-1)

①m-POPTCーアミノ酸生成反応: _o.

05

mM アミノ酸溶液(90%アセト

ニトリル水溶液)100μ1J アセトニトリルーピリジンートリエチルア ミン混液(90

: 8.75 _:

1. 25，

v/v)50μ1及び1. 5 mM

m-POPIC(アセト ニトリルージオヰサンJ 1:1，

v/v中)50μ1をノマイアル管にとり，

1000Cで10分間加熱する. 氷冷して反応を止める. 反応液に20 rnMリ ン酸塩緩衝液(pH 8. 5) 250μlを加え， さらに四塩化炭素300μlを加 える. パイアルを約10回強く振り混ぜ， 遠心分離し， 水層20μlを

-7-

。zωュ.ア4

唱。ωω目立oaoユ〈印伸一包20202呈コO白OE乏53・。『マ司020

20ω

2

M 2

Zーの-:0

。

。

o

z

m-POPIC

+

g・。『同WBMM《)司回。

with

kpEE。RE

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ω--の -

の

。

。

acids anl1no

吋FZ85Mg。句zoES民・40(E-。『司・司。司ヨVMZE525)

ロ1問

。

of

ミr。

derivatization the

吋由民。同回一句《町田件。宮島Awユgas(自・湾問γ司。司吋出品目町田。"豆島)

for 1-1

Procedure Fig.

00

acid (in 90も acetonitri1e) 100μl Amino

50μ

l

vjv)

μ 1 (90:8.75:1.25，

vjv)50 1:1，

acetonitri1e:dioxane，

Acetonitri1e-pyridine-triethy1amine m-POPIC(in

1.5

mM

100

"c

_{， 10min}

250μ エ 8.5)

300μl buffer(pH 七e七rach10ride

Phosphate Carbon

20

mM

HPLC to

μ l App1y 20

Centrifuge A_gtleous 1ayer \

50μ l acid

Hydroch1oric

M

1) 10 (100 μ

サ

50μ

1

hydroxide

100

Sodium 七o HPLC

M

"c ， 10min

l 4

Apply 20μ

サ

HPLC'こ付した.

②m-POPTH-アミノ酸生成反応:上記の水層100μlを 10M 塩酸50

μlに加え， 100 ocで10分間加熱す る. 氷冷して反応を止め， 反応液 に4M 水酸化ナトリウム 水溶液50μlを加える. その20μlを HPLCに付 しずこ.

( 2)

H P L C

逆相分配型のTSKgel ODS-120T カラム(150 x 4. ⁶ mm i. ^d. ， 粒径 5μm， 東ソー)を使用した. 溶離液にはアセトニトリル， テトラヒ ドロフラン， O. 1 M トリエチルアミンー0.1M酢酸混液(pH 8 .5)及び 水の容量比が， 45 : 5 : 10 : 40 (v /v)及び85 : 5 : 10 : 0

(v/v)の2種類を用いた. 流速は1.0 ml/min で， アセトニトリル濃度 を30分間で45-85%ま で 変化させる直線グラジエントで行った. 検出 は 励起波長330 nm及び発光波長400 nmで行った. 操作は室温(2 2士

4 OC)で行った.

1 -2 蛍光スペクトルと安定性

(l)m-POPICの蛍光スペクトル

m-POPICはジオキサン， テトラヒドロフラン及びクロロホルム に可 溶であるが， 水， アセトニトリル， メタノール及びベンゼンに は難 溶であった. 試薬が可溶な溶媒に溶かし スペクトルを測定した. 得 られた蛍光励起及び発光極大波長を Table 1-1に示す.

m-POPICをジオキサン， テトラヒドロフラン， クロロホルム及びジ オキサンーアセトニトリル 混液に溶かしたときは， その蛍光励起及

-10-

へ‘

び発光極大波長ともに大差はなかった. m-POPICをジオ牛サンーアセ トニトリル(1: 1. v/v)溶液に溶かしたときのスペクトルをFig. 1-

2Aに示す. またm-POPICの酸性あるいは塩基性 における蛍光励起及び 発光極大波長の変化を調べ るために， m-POPICのジオキサンーアセト ニトリル溶液のpHの異なる 2種の溶液(pH 8. 5 及び pH 5. 0 の0.1M トリエチルアミンーO. 1M酢酸混液)で10倍希釈し て蛍光スペクトル

を測定した. し かし， pH による著しいスペクトル の変化は認められ なかった. ジオキサンーアセトニトリル溶液中でm-POPICは4 ocの冷 所保存したとき少なくとも2カ月は安定で， 一定の蛍光強度を示した.

(2) m-POPTC-アミノ酸及びm-POPTH-アミノ酸の蛍光スペクトル

A la， Hyp， His及びAsn(1 mM)を基準操作にしたが って反応させ た. この反応液をHPLCに付し， rn-POPTC-アミノ 酸及び、m-POPTH-アミ ノ酸の蛍光ピーク を前述のpHの異なる2種の溶離液で分離分取した.

各分間の蛍光励起及び発光極大波長をTable 1-2 に示す. rn-POPTC­

Ala及び、rn-POPTH-Ala から得られた蛍光スペクトルは， 互いに 類似 した形を示し(Fig. 1- 2 ^B， C)， 他の3種のアミノ酸蛍光体のスペク トルも互いに類似していた. また， pH 変化による スペクトルの違い も認められなかった. m-POPTCーアミノ酸は約3時間， m-POPTHーアミノ 酸は約1時間安定であった. アミノ酸誘導体の励起波長はm-POPICの

それ に比べ約30nm短波長域にあるので， HPLC検出で は未反応の試薬 が検出され にくいと考えられる. よってrn-POPIC及びその蛍光アミノ

酸誘導体はHPLCにおいて励起波長340 nm， 発光波長400 nmで検出し た.

-11-

トー‘�

ト....

CÑ

4加J -刊

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ロω5{

_+H

5

^J

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M ωωM

_・A刊

M

F0 ロ4 ⁾ 6

�

Table 1-1

Excitation and emission ma玄ima of the fluorescence of m-POPIC in various solvents

Solvent Excitation maximum

(nm)

Emission maximum

(nm)

Dioxane 365

Tetrahydrofuran 365

Chloroform 365

Dioxane-acetonitrile(l:l，v/v) 360

Dioxane-acetonitrile-0.1M triethy1arnine 359 -O.lM acetic acid mixture(pH 5.0)(1:1:18，v/v)

Dioxane-acetonitrile-0.1M triethylamine 359 -O.lM acetic acid mixture(pH 8.5)(l:1:18，v/v)

(A)m-POPIC (B)m-�OPTC-Ala

Ex Em Ex Em

395

395

395

400

401

401

(C)m-POPTH-Ala

Ex Em

260 300 350 400 450 2

i

0 3

h

0 3510 4

d

0 450 260 300 350 400 450 wavelength

(nm)

wavelength (n皿) wavelength (nm)

Fig.1-2 Fluorescence excitation and emission spectra of (A)1.5 ^mM m-POPIC in dioxane-acetonitrile(l:l，v/v)，(B)m-POPTC-Ala and (C)m-POPTH-Ala in aqueous aCetonitrile containing 0.1Mtriethylamine-0.1M acetic acid mixture (pH 8.5).

ミノ酸及び、m-POPTH-アミノ酸のHPLC分離条件

(自己)

m-POPTC-ア

生成

∞白内泊∞門

oody

的∞門

。。噌由∞門

∞小門

的∞内

トグラムを

1-3 Bに示すように11種のアミノ酸

しfこ

1-2-(2)で述べたようにm-POPTHーアミノ酸の蛍光強度及びスペクト ルはpHに影響されないので，

1

-

³

M内の自\日凶

(的.∞

酢酸混 アミノ酸によっ

弱アルカリ性及び弱 酸性pHの緩衝液を でもm-POPTC-アミノ酸からm-POPTHーアミ

その他の蛍光ピークの構造は不 それぞれピークをHPLCで分取し酸性反応 m-POPTHーアミノ酸へ変換す るのは各アミノ酸につ 光ピークとして検出されるm-POPTH-アミノ酸に変換して分離を検討 すべてが検出できた.

それぞれ単一の蛍

カップリング反応において複数の蛍光ピークが確認さ 4種のアミノ酸に それぞれ2本の蛍光

その他のアミ

Hyp，

しかしm-POPTCーアミノ酸を 酸性条件下で 基準操作に したがってm-POPICと21種のアミノ酸を反応させ，

それぞれ単一ピークに なった.

ン- O. 1M

Th r，

のm-POPTCーアミノ酸のクロマ

Ser，

の蛍光体はそれぞれ単一のピークとして検出され た.

がってm-POPICとアミノ酸とのカップリング反応 は，

トリエチルアミ

Met，

て複数の蛍光ピークを生成する場合があるので，

するm-POPTCーアミノ酸をHPLCに付し たところ，

G 1 u，

phU 4・Bム

種のアミノ酸 (Asp，

き一つの蛍光ピークだけであった.

O. 1M

m-POPTHーアミノ酸に導くとF ig.

ノ酸に導くと複数のピークが，

の

用いて分離条件を検討した.

Hyp

Cys) Leu)

れたアミノ酸については，

(1)移動相のpHと溶媒 Met，

Lys，

ピークが認められた.

P he，

に用いたところ ，

G 1 u，

H

_i

s.

なお，

1-3 A に11

Va1.

Asp，

明である.

ノ酸(Arg，

Pro.

した.

F i

g.

A la，

示す.

，，-、

国仏ωロ吋白川町」[何回向け干ω叶何日#

ωロ刊白川wa門拘足以ω吋旬以

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z

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∞N門ロω41ULF仏O品t巨的∞門∞内門

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∞九山内同門門

トN門

ωJ明間lULF仏O仏自民

的∞内∞内門

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仏何回l出LF仏O仏lE

白九円出IULF仏O仏1巨

-14-

∞mv門

。内内

∞内門川町∞門トN門

。門門。内内同町Had-出LF仏O仏lE

MWHad-υLFn凶O仏tE ∞町内

∞N門的∞内∞N内

(自民)

凶内伺毘\M同国(旨口)(自H)

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斗4 0 伺国叶附川町田口O吋ωω叶国ω匂口のロOJ判川相川町川伊叶UM内凶

NIH ωa門AMWLF

Table

mO叶UMW

OロJ明日ω'mLF仏O仏t

巨

テトラブ チルアンモニウム- O. 1M ギ酸

O.1M

4.

0)，

液(pH 8. 5及び CA/A1毛)aττ.I=tτロo=ta::>v

、、

、

、

\

\ \

\ \

\ 、

\\d点"

、、

、、

\ \

、

\ 、

ギ酸混液(pH 8. 5 アンモニ ア- O. 1M

O. 1M

4.

0)，

8. 5及び

混液

ω マ 」

的∞L

ト溶離で 分離を検 これらの条件における各蛍光誘導体の保持時聞を

アセトニトリルのグラジエン を用い，

寸 及び

N (ロヨ旬)

ON

いずれの場合もpHを低くすると塩基性アミノ酸は速やかに溶出し，

これらの3種の溶離液の中で

CysのピークはAsnおよびAspのピークと重なるもののピ

1-4で示すように またPheが試薬由来のブランク AspとAsnそ してGluとGlnのrn-POPTHーアミノ

Glu rn-

21種のアミノ酸を完全に分離できる条件は得られ

メタノールを用いてそれぞれ単独ある いずれ

酢酸混液(pH 8.5)を用いたもの

この ブランクピークをアミノ酸と分離するこ ArgやHisなどは比較的ブロー

HPL Cの溶離液 に用いる有機溶媒としてアセトニト おそらくチオヒ ド基及びGlnのδーアミ ド基が加水分解によってカルボキシル基になり，

保持時間の近いアミノ酸のピークと重なった.

rn-POPTC-アミノ酸の場合には保持時聞が異なるにもかかわらず ，

それぞれAsp，

Table

Glnのピークが，

しかし，

POPTH-アミノ酸になると 保持時間が同じになった.

pHを高くすると酸性アミノ酸が速やかに溶出した.

Asn及びG1 u，

Asnのγーアミ

グラジエント溶離を行った.

(F i g.

分離状態やピークの鋭さから考えると，

と同じ挙動を示すものと考えられる.

また保持時間 は違っても，

円，Z4EE--

が他のものより良い分離が得られた トリエチルアミンとO.1M

しかしAsp.

ン誘導体形成の際に，

ドロフラン，

Leuと1 1 e，

ピークと重なるので，

ドなピークを与え，

ークは確認できた.

とも必要であ る.

酸は 分離されず ，

トラヒ いは混合して，

の溶離液でも

こ の結果，

討した.

に示す.

なかった.

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times of retention

the phase on

mobi1e the

.1n 1-3

of pH m-POPTH-amino Table

Effect

acids

(min) time

Retention Amino acid

derivative

司J司・晶

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nu i--川lil-E

nコ'4v 、A

，aEaEa'EEAV

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し1MM川山

8 1

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EJ

A苛 El

2 1

ωωC00ωω」ωUCむUωω」Oコ【比

phase C Mobile

phase B Mobi1e

phase A Mobi1e

pH 8.5 pH 3.0

pH 8.5 pH 3.0

pH 8.5 pH 4.0

4.0 5.0 4.0

7.7

5.0 6.2 6.2 5.5 6.4 6.7 7.3 7.3 7.7

8.3 8.3 5.9 5.7 7.0 6.2

10 20

Retent10n time /min

acids m-POPTH-amino

nm;

phase，linear gradient(0-30min)

acetonitrile(45-85も)，tetrahydrofuran(5も)，

O.lM triethy1amine-0.1M acetic mixture(pH 8.5)(10も)

ODS-120T rate，1ml/min;

mobi1e

。

of

co1umn，TSKge1 i.d.，5μm); f10w

330 ^nm Em 400 conditions:

mm detection，Ex Chromatogram

(150x4.6 HPLC

Fig.1-4 7.7

9.3 9.1 10.7 10.6 10.5 13.4 7.7

9.1 9.1

14.0 14.6 15.7 15.7 7.7

8.2 10.0 9.9 11.6 11.5 11.5 15.0 15.6 16.3 18.1 18.1 6.4

7.6 7.6 8.3

6.6 6.0 6.0 6.6 6.6 5.3 3.3 6.5 3.9 7.2

10.4 10.3 10.6 12.9 13.3 13.9 15.5 15.5 7.8

9.7 9.7 11.3 11.3 3.8

4.2 4.2 4.8 4.8 5.3 7.3 7.0 8.2 8.2 8.0

8.3 5.4 3.3 6.6 3.7 7.2

11.4 14.9 15.5 16.1 18.0 18.0 9.6

9.4 10.6 10.8 10.8 13.7 14.2 14.7 16.1 16.1 4.0

4.9 4.9 6.6 6.6 5.4 5.7 6.6 6.8 7.3 8.0 9.9 9.8 Cys

Asp Asn

Arg_

G1u Gln Lys His Met

Ser Thr Hyp G1y

11.1 11.3 11.3 14.7 15.4 16.1 18.0 18.0 Tyr

A1a Trp Pro Va1 Phe

Leu of

Ile

「通園E・E・・E・ ・E・ .，E・E・・E・・E・・E・-

acid water(40-0も)

tube): l=Asp，

4=Met;

9=Hyp;

3=Lys;

8=Gly;

14=Val;

Gln;

7=Arg;

13=Pro;

工le.

and

reaction and

6=Thr;

nuU 414

12=Trp;

per 2=G1u

and each

11=A1a;

16=Leu Cys;

Ser;

nmol

and lO=Tyr;

15=Phe;

Peaks(5 and 5=His Asn phase: A， O.lM triethy1amine-0. 1M acetic acid( pH4. 0 or

8.5):water:tetrahydrofuran:acetonitrile(10も : 30-0も : 5毛 : 55-85 も) for 0-20min ; B，O.lM tetrabuthylammonium-O.lM formic acid(pH 3.0 or 8.5):water:tetrahydrofuran:acetonitrile(10も: 30-0も : 5毛 55-85も) for 0-20min ; C， 0.1M ammonium hydroxide-O .1M formic acid:water:tetrahydrofuran:acetonitrile(lOも : 30-0も : 5も : 55-85 も) for 0-20min. HPLC conditions: co1umn， TSKgel ODS-120T (150玄 4.6 ^nuu i.d.， 5μm); flow rate，1.0 ml/min; detection， Ex 330

Em 400

-18-

nm nm

_

Mobi1e

アセトニトリルのみを使用したとき分離できなかったProとValを，

テトラヒドロフランを添加することによって分離することができた.

またメタノールを用いると一般的に溶出速度が低くなった. これに テトラヒドロフランを添加することによって， アセトニトリルでは 完全に分離するこ とができなかったAlaとTrpが分離された. しかし メタノール及びテトラヒドロフラン混液を用いると， カラム内の圧 力が上昇し(約2倍)， カラムが劣化する恐れがあった.

次に， アセトニトリルーテトラヒドロフランーメタノールのグラ

ジエントプログラムを設定して分離を検討した. これは， アセトニ トリルで早く溶出するアミノ酸蛍光体をさらに早く， またメタノー ルで遅く溶出するアミノ酸蛍光体をさらに遅くして， アミノ酸蛍光 体の分離に好結果をもたらすためであ る. そこで初めにアセトニト リル濃度(35-5%. 6 0 min)の比率を高くし， 後半にメタノール濃度 (0-80%， 6 0 min)の比率を高めるグラジエント溶離とした. しかしや はりArgとHisがMet， SerまたはThrと重なるので， 2つの塩基性アミ ノ酸を早く溶出させるためにO. 1Mテトラブチルアンモニウムー 0.1Mギ酸混液(pH 3.0)を 用いて分離を試みた. そのクロマトグラム をFi g. 1-5に示す. AspとAsn， GluとGln， IleとLeuは分離できなか ったが， 比較的良好な分離状態が得られた. しかし， 長い溶離時間 ( 1時間)が必要であり， ピークがブロードになった.

(2)固定相

上述の分離条件の検討には， シリガゲル表面にオクタデシル基を 結合させた TSKgel ODS-120T (150 _x 4.6 mm i. d.. 粒径5μm， 東

ソー)カラム及び TS K g e _{1 0 D} S -8 0 T _1'，

₍

₁ 5 0 x 4. 6 m m _{i. d.} . 粒径5μm.

Tab1e 1-4

Effect of solvents 1n the mobile phase on retention time of m-POPTH-amino acids

Retention time (min) Amino acid

derivative Mobi1e phase A Mobile phase B CH3CN CHlICN-THF MeOH MeOH-THF

Cys 3.7 3.7 ^{15.0 11.6}

Asp 4.7 4.1 14.9 11.1

Asn 4.7 4.1 14.9 11.1

G1u 5.5 4.7 15.9 12.0

Gln 5.5 4.7 15.9 12.0

Lys 7.2 5.3 18.7 14.5

His 7.7 6.5 20.2 18.7

Met 7.7 6.7 20.2 16.7

Arg 8.1 7.2 ^{21.6 18.5}

Ser 8.1 7.3 19.4 16.4

Thr 8.6 7.8 19.8 16.8

Hyp 10.6 9.4 21.0 19.0

Gly 10.5 9.4 21.0 18.5

Tyr 11.3 10.8 23.1 20.1

Ala 11.3 10.8 23.0 20.0

Trp 11.0 10.6 23.6 20.8

Pro 15.8 13.6 25.6 21.7

Val 15.8 14.1 25.6 22、6

Phe 16.5 14.7 25.6 22.6

Leu 18.0 18.1 27.0 24.0

Ile 18.0 18.1 27.0 24.0

Mobile phase: A， acetonitrile(60-90も):O.lM triethylamine-0.1M acetic acid(pH8.5)(10も):water( 30-0も) for 0-20min or acetonitrile (55-85も):tetrahydrofuran(5毛): O. 1M triethyla皿ine-O.lM acetic acid (pH8.5){10も) :water( 25-0も) for 0-20min; B， methanol(60-90毛): 0 .1M triethylamine-O.lM acetic acid(pH8.5)(10毛): water( 30-0も) for 0-20 min or methanol(55-85毛):tetrahydrofuran(5も):O.lM triethylamine- O.lM acetic acid(pH8.5)(10も):water( 25-0毛) for 0-20min.

HPLC conditions: column，TSKgel ODS-120T(150x4.6 mm i.d.，5 μ m) ; f10w rate， 1.0 mljmin; detection， Ex 330 nm Em ⁴⁰⁰ nm .

東ソー)並びに親水性ポリマーにオクタデシル基を結合させたTSK これらのカ Octadecyl-4PWカラ ムを用いて分離条件を検討した.

gel

1-5に示す(ODS- ラムを用いて分離したアミノ酸の保持時間を Table

80 {も)

Octadecyl-4PWはODS-120Tに比べて分離が不良で

1-3} .

120T はTable

ODS -80TMはODS-120Tと同様に鋭いピークと分離能を示した ODS-120T以上の好分離は得られなかった.

21種類すべての アミノ酸を分離することは 分離を検討した結果，

あった.

が，

1 0種類と1 1種類の分離可能な2グルーフのm-POPTH-アミ 1-6に示す .

トグラムをF

i

g.

誘導体化反応条件

50 35

できないが，

ノ酸のクロマ

1

-

⁴

Acetonitrile(35-5も)

a』ト

ωωロO仏ωωH

ωUロωUωωMOロHh同

Trp，

であ ると きピーク高さ

m-POPICとアミノ酸のカップリング反応は塩基性条件下で進行する ピリジンの2種について その結果1. 25%(v/v}のトリエチルアミン及び 塩基性触媒としてトリエチルアミン，

反応条件を検討した.

8. 75完(v /v )のピリジンを含むアセトニトリル溶液50μlを用いたとき

丹、vnf白

m-POPICは1. 5 mM以上になるとアセト

Met，

v/v)溶液に溶け難くなった.

m-POPICとモデル化合物として5種類のアミノ酸(G1 y，

について誘導体化反応条件を検討した.

mM

ピリジン及びトリエチルアミンの濃度

1 . 5

1. 5 mM)は，

ニトリルージオキサン(1: 1.

m-POPICの濃度(0. 5 が最大を示した(Fi g.

試薬濃度

ので，

Ile) Lys，

、‘』，， 4BEA ，，‘、、

、‘，，，n，心，，，a‘、

60

acids

HPLC conditions : column，TSKgel ODS-120T (150x4.6 mm i.d.，5 μm); flow rate，lml/皿in;

detection，Ex 330 nm Em 400 _nm; mobile phase，

linear gradient(0-60min) of acetonitrile (35-5も )，methanol (0-80も)，tetrahydrofuran

(5も)，O.lM tetrabuthylammonium-O.lM acetic acid mixture(pH 3.0) and water(50-0も ).

つ'uqL

each per reaction tube) 50

Chromatogram of m-POPTH-amino (5

40 (min) 30

Retention time

runol 10 20

。

Fig.1-5

Fコ一 ιL

1c

- e iE gE F

E reversed-phase columns on retention times 。歪 m-POPTH (A/A.毛)aTτzヰτuO=la::>v

acids

of (ωaロけ干

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刊以 Uωω HhHω仏間

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抑制

dsV 向。

d.(H

Em

acetonitrile(35-55も) (pH 8.5) mixture (pH 4.0) mixture (pH 3.0)

acetonitrile(35-65- 8.5) n皿

acid mi玄ture (pH 5.0)

6.2 5.0 5.0 6.4 6.4 7.3 9.4 9.2 10.0 9.6 10.2 11.5 ODS-80T ..

(e)

11.4 12.7 12.5 12.5 15.3 15.3 16.0 17.0 16.9 330

acid mixture acid

detection，Ex

(pH 5.2 4.9 4.9 5.2 5.2 8.0 10.0

(d)

9.4 12.0 9.9 10.8 12.1 11.9 13.0 13.3 13.3 16.2 16.2 17.0 18.0 18.0

acetic

acid mixture (min)

of gradient(0-40min) triethyla皿ine-0.1M acetic triethylamine-0.1M acetic ammonia-0.1M for.mic

gradient(0-10-24min)

-24-

time

acid of ml/min;

2.4 9.3 9.3 10.0 10.0 4.9 4.9 6.7 6.0 8.4 8.8 (c)

10.7 11.0 12.6 12.6 15.1 16.1 18.7 21.0 23.1 22.9 Retention

triethylamine-O.1M a皿monia-O.lM formic

M P 4-E 司ムY) c

b

et­d a ιL C O

17.4 20.0 22.6 24.6 24.0 rate，1.0

3.7 6.0 6.0 8.5 8.5 4.9 7.0 7.2 7.7 9.0 9.5 11.8 12.0 13.8 13.8 16.0

flow nm;

Octadecyl-4PW:linear (a) O.lM

(b)

0.1M (c) 0.1M ODS-80T..:linear

(d) (e)

4.0 3.5 3.5 3.8 3.8 4.9 7.0 (a)

7.2 8.9 9.0 9.6 11.6 11.9 13.8 13.8 15.9 17.3 19.9 22.4 24.3 24.0 conditions:

85毛}

O.lM 0.1M derivative

acid Amino

Cys Asp Asn

Gln Glu

Ser Arg

Thr Lys His Met

Hyp Gly Tyr Ala Trp Pro

Phe Leu Ile Val

HPLC 400

m-POPTH-アミノ酸の生成量 が最大であった(Fig. 1-8).

100

(4)試薬及び副産物の抽出

m-POPTC-アミノ酸形成反応液中には， rn-POPTC-アミノ酸以外にも 多数の副反応物， 未反応試薬及び試薬の分解物が存在していた. し たがってこの反応液を続けてrn-POPTHーアミノ酸の生成反応に用いる と， 大部分のm-POPTH-アミノ酸は， それらの妨害ピークと重なった.

このためm-POPTC-アミノ酸を生成させたのち， rn-POPTCーアミノ酸だ けを残してそれらの妨害ピークとなる成分を 除くために溶媒抽出を 検討した. クロロホルム抽出によって妨害物質は完全に除去された が， Leuや11 eなどのm-POPTCーアミノ酸も抽出された. 一方， 四塩化 炭素 を用いると， m-POPTC-アミノ酸をほぼ完全に残し， その他の妨 害物質を効率よく有機層に抽出できた. Fig. 1-10に四塩化炭素で抽 出しない場合とした場合のクロマトグラムを示す. 検 討したアミノ 酸はGly， Ala， Val， Leuである. これから， m-POPTH-アミノ酸のピ ークと重なっていた妨害ピークが溶媒抽出操作により除去されてい

(UVJ明白ロ

(3) rn-POPTC-アミノ酸形成の反応時間

m-POPICとアミノ酸のカップリング形成反応における反応温度を

1000CJ 50 ocと変化させ， それぞれの温度において2分から30分の反 応時間におけるm-POPTC-アミノ酸の生成量を調べた. 100 ocでは最大 のピークを得るのに約10分間の反応を必要としたが(Fig. 1-9A )，

500Cでは同じピーク高さを得るのに反応時間をより長くする必要が あった(Fig. 1-98). したがって基準操作では反応温度と反応時間 を100 oC， 10分間と設定した.

hLHMW旬以」判AHC

、_，uvzm判ωZMACω仏

Lys

。

0_5 0_75 1_0 1.25 1.5

m-POP工C (mM) Fig. 1-7

Effect of m-POPIC concentration on the formation of m-POPTH-amino acids (5 nmol each per reaction tube)

-26- n，b ηi

ω旬刊Uの10同J明日Mwtuh-仏On凶t

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五..:IeJ�τqJe)

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。

守ー

o c、4

�・ー

O Hh ωhJ

ρ

OOH

anll.no tube)

5

5

of reaction reaction

4 (も，v/v)

6

triethy1amine coupling

runol per

(も，v/v}

each

1 2 3

Triethylamine

9 7

pyridine 8

and m-POPIC(5

the pyridine concentrations on

。

10

with

。

of

1-8

Fig.

Effect acids

。

。 。

。 4

l(1?aa

�qfiτaq

(ヰτun五..:I1?J�τqJe)

..-

(A) (B)

ωωロon凶ωωLH

ることが明かである.

m-POPTH-アミノ酸生成における反応時間と 塩酸濃度

、‘，，，rhυ ，，z‘、

m-POPTC-アミノ酸からm-POPTHーアミノ酸への変換に用いる塩酸の 10 Mの塩 したがって基

ドマン分解法には

また基準操作にしたがって5種のアミノ酸(Gly，

ド(OP

Met，

1 1 e)をm-POPTH-アミノ酸とし HPLCによって検量線を作成

OPA-MCE反 応操作

A)とβーメルカプトエタノール(MCE)を用いて未反応のアミノ酸の量 各アミノ酸からの蛍光体の単離は試みてい 準操作では10Mの塩酸を用い1000Cにおいて10分間の反応時聞を設定

ンの蛍光試薬であるo -フタルアルデヒ M)及び1000Cにおける反応時聞を検討した.

1-11).

m-POPICによるアミノ酸の反応収率が高いほどエ

また21種のアミノ酸の検出限界を求めた.

酸を用いた方がより高い生成量を与えた(F^{i g.}

検量線及び検出感度

本研究では ， 第一級アミ 反応収率，

好ましい.

を測定した.

濃度(10 M.

Lys，

ないので，

1

-

⁵ した.

Trp，

し

、‘，F414 ，，t‘、

acids extraction with carbon tetrachloride，(B)

extraction，(C) m-POPTH-amino

hro

40

40

m-POPTC-amino

after

30 (min)

30 (min) 20 Time

20 Time 10

10

resulting

mixture

。

(D)

the

acids

コ@」一句〉

km-o

40

Fig.l-l0

40

(A)

コ@J''

m-POPTC-amino of

20 30 (min)

30 (min)

before Chromatograms

the

〉、

cl

、11伺

《

、

20

T工me

mixture

10 Time

ユ0

(C)

。

。

ωυロUωωωhHOロ叶仏

ωωGO仏ωωhH

ωU口ωUωωhH03叶向

0.05mMアミノ酸を1-1-(1)の基準操作に従いm-POPTCーアミノ酸生成

4 日1守

られる水層100μlにOPA-MCE試液(実験の部参照)20μlを加え1分間撹 酢酸エチル500μlですべての蛍光物質を抽出する.

反応を行い，

tube) .

i. d.

，

Em 400 120T(150x4.6 mm

330

(D)

reaction colu皿n，TSKgel

rate，lml/min; detection，Ex and

z

e s p

e of a c h

A o D

mixture nmol (5

acids of B conditions:

m-POPTH-a皿ino mixture acids

HPLC

励起波長350nrn， 発光波長 反応液20μlを逆相HPLCに付し，

1i n《U

460nmで、検出する1 _{1 )} 狩する.

nm;

flow

phase，linear gradient(0-20-40min of

(30-50-85も)，tetrahydrofuran(5も)，O.lM triethylamine-O.lM acid mi玄ture (pH 8.5) and H20(55-0も).

-30-

acetonitrile μm) ; nm

mobile

acetic 5

i-- 、‘a''n，b

反応収率

m匂J明Uの

10hH匂hnzm

反応に用い 1-6に示す.

未反応のアミノ酸を定量した結果をTable

OPA-MCE反応によって求めた反 nmolであり，

たアミノ酸は反応液中5

nmolであるので少なくとも

0-0. 25

応液中の未反応のアミノ酸は，

95-100完のアミノ酸はm-POPICと反応していることにな る. これはエ

Oロ

J明田MWEυLFn凶OA胸l自国OHh明

(悶)(J【U出) ω句吋UMWOロJ2MMw

t出lF仏O仏t巨刷0

・aoJ判μMUEHohM U刊-MOHぷUOH句hnz

(4)

日制Uω刷相同

・切J明弘

(ロ吋目)

。σ3

O N

J刊以ω自 句ロω

ドマン分解を指向した他のフェニルイソチオシアネート類似試薬 DNSAPITC:75-95 %48l)に比べてか

。y-

FITC: 60%46ì.

(DABITC:25-30%40> _，

匂」明UMW

ロOJ円以UMWω出

HU出乞

なり高反応収率である.

全てが原点を通る直線に

20種類のアミノの検出限界(S/N=3)は0. 6-3.8 pmol/カラム注入量

、、，，， aEi ，，‘、

上記のm-POPTHーアミノ酸の分離条件並びにm-POPTH-アミノ酸の生 トリペプチドであるGly-

トリル中) 100μiを1-1-(1)の基準操

円‘u円台V

m-POPICはF1 T C4 6 ì及びDAB1 TC プロ ット) .

4 ø)とほぼ同程度の感度 を有することが分かった.

1-12)は，

各n=2

成条件を利用してエドマン分解の例を，

トリペプチドのエドマン分解 したがって，

1mMのペプチド溶液(アセ

Leu-Alaを使って検討した(Chart.

検量線及び検出感度

5 種のアミノ酸の検量線(Fi g.

なった(相関係数r=O. 993-0. 998.

トニ ドマン分解操作

1-7) .

であった(Table

コニ 1 _- 6

、、，，， ntu ，，E、、

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Amount(nmol) (nmol)

with

Amount tube) reaction

acid per

Amino nmol (5

acids amlno

of reaction coupling

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Asp

0.14

0.08 0.02 0.25 0.13

0.23 0.24 0.14

Pro.' Hyp.)

Leu Ile Val Phe Trp Tyr Gly

Ala

0.24

。 0.23 0.23 0.11 0.25 0.24 0.06 0.23

Cys.) Amino

Ser Thr His Gln

Lys Met Asn Glu

ーω品l

0.23 Arg

with reaction

fluorescence

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o-phthalaldehyde-2-mercaptoethanol(OPA-MCE)

Peak

the

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四塩化炭素(300μlx2)で抽出する.

トリフルオロ酢酸 100 作に従ってm-POPICと反応させ，

次 に，

減圧下トリフルオロ酢酸を 水層(200μ1 )を分取し凍結乾燥する.

μlを加え1000Cで10分間加熱したのち， 水層と酢

水200μlを加え酢酸エチル(200μ1 x 2)で抽出後，

内.H

留去し，

dy.H

0.H 0.H

m.0

∞.0

0 ∞. ∞.H

。. 0

由.0 (

H

O白血 )

酢酸エチル層の溶媒を減圧下留去

酸エチル層をそれぞれ分取する.

1000Cで10分間加熱す

71<

100μl及び濃塩酸50μlを加え，

反応液に4M水酸化ナトリウム50μlを加え20μlをHPLC したのち，

HVJ判回J明HdoJ判以Uω判ω口

ω匂刊U伺

残漬をカップリング反

N末端アミノ 水層は凍結乾燥したのち，

におけるクロマトグラム 分解

氷冷後，

一方，

応、に用いた(F^{i g.}

、‘，ynJU ，，E1

_ンエドマ

に付した.

る.

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ン誘導体(m-POPTZ-Gly) ，こ Gly-Leu-Alaを基準操作lこ従い m-POPICと反応させ，

(門HZ\ω)

このと 酸性でチオヒダントイン誘導体(m-POPTH-GlY)に導いた・

酸(G1 y)をペプ チドから切断しチアゾリノ

1-14 Aの

クロマトグラムはm-POPICとGly-Leu-Alaのカップリング反応液か‘ら

F

i g.

1-14に示す.

トグラムをF^{i g.}

し，

きHPLCにおけるグ ロマ

0.H N.N

N.」【 0.H

∞.0 叩.N

∞.門

m.J【 。.H

ト.H

0.N

(

H

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しかしエ m-POPTC-Gly-Leu-Alaのピークが検出される.

同濃度のGlyを1-1-(1)の基準操作に従って蛍 ドマン分解後ではGlyのチオヒダントイン誘導体(m-POPTH-Gly)のピ 得たもので，

ロ0.判μυω判ωロ

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またN末端アミノ 1-14 B)は，

ーク(F^{i g.}

酸が一つ少なくなったペプチド(Leu-Ala)を含む水層を凍結乾燥後，

光検出したピークの約15%しか検出できなかった.

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次の反応に用いたところm-POPTC-Leu-Alaのピークは確認できなかっ

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た. ングさせ

凍結乾燥して得た試料にアセトニトリル

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ドマン分解 の基準操作に従ってカップリ た反応液(水層 200μ1 )を，

同濃度のGlyをエ

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for Procedure 1-13

Fig.

(90:8.75:1.25， vjv) 50μl dioxane， 1:1， vjv) 100μl (in 90も acetonitrile) 100μ1

Acetonitrile-pyridine-triethylamine m-POPIC (in acetonitrile Peptide

n

lJY 副

nu

‘i

pu e

nu nu

句よ

1mM

2 x l 300μ μl

tetrachloride Centrifuge

200 mM

Carbon 1.5 Water

Lyophilize

Tirfluoroacetic

工一

e一n

zi- - M可i

a一m14一nu

句よ ℃

Aqueous

ーω∞1

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100μl

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rn-POPTC-Glyのピークが確認で 200μlを力日えてHPLCにイ寸したところ，

凍結乾燥後の試料に トリフルオロ酢酸を加えて反応 しかし，

きた.

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m-POPTC-Gly及び�m-POPTH-Glyのピークは確認できなかっ させたが，

これはトリフルオロ酢酸によってrn-POPTC-Glyが分解したものと

fこ.

ドマン分解を行なうに あたってN末端ア これより， エ

考えられる.

(同)

反応時間及び反 トリフルオロ酢酸濃度，

応温度についてさらに検討する必要がある.

1

ミノ酸切断反応に必要な，

ヴt 小括 rn-POPTC-アミノ酸及び‘rn-POPTH-アミノ 。 切叶U伺

rn-POPICのアミノ酸誘導体，

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ほぼ一定の HPLCの蛍光検出においてpHに影響されず，

酸の蛍光は，

UJ判パギωUの

rn-POPTCーアミノ酸は21種の 蛍光強度及び励起 ・ 発光波長を示した.

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m-POPTC-アミノ酸 数種のアミノ酸では，

アミノ酸で検出された が，

しかしrn-POPTC-アミノ酸からrn-POPTHーアミノ酸 が複数形成された.

21種のアミノ酸はそれぞれ各単一のピークとして検出で へ導くと，

したがってm-POPICはアミノ酸分析には有用な試薬と考えられ きた.

21種すべてのアミノ酸蛍光誘導体の分離条件の確立は る. しかし，

またm-POPICとアミノ酸の反応収率は高いものと考え できなかった.

ドマン分解 に用いた rn-POPICをペプチド(Gly-Leu-Ala)のエ

られる.

N末端アミノ酸

m-POPTC-Gly-Leu-Alaは検出できたが，

ところ，

。

(〈)

わずかしか認め ン誘導体(rn-P OPT H -G ₁ y)は，

(Gly)のチオヒダン トイ

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-41-

asuodsa.:x

-40-

られなかった.