近 畿 大 農 総 研 報9123〜127(2001)
Bull. Inst. Compr. Agr. Sci. Kinki Univ. 9 : 123 — 127
Dictyostelium discoideum
(2001)
にお け る子 実体形 成 に関す る 遺伝 子群 の同定
高 本 耕 三1)・3)・ 大 瀧 保1)・ 吉 田 元 信2)・3)
Identification of Genes Involved in Fruiting-body Formation of Dictyostelium discoideum
Kozo TAKAmoTo"' 3), Tamotu OoTAKI1), Motonobu YOSHIDA2)' 3)
Synopsis
We tried to identify the genes which are involved in the fruiting-body formation of Dictyostelium discoideum. We have selected 17 cDNA clones for the preparation of a knockout construct, from cDNA library of Dictyostelium discoideum slug. They are expressed especially in prestalk cells. The knockout construct was made by insertion of blasticidin S resistance gene into a middle region in cDNAs. As a result, the cells transformed with SSK401 and SSK864 knockout constructs, respectively showed aberrant fruiting bodies and Southern blotting analysis suggested that the knockout constructs were inserted into D. discoideum chromosome DNAs.
緒 言
161fialtfriti Dictyostelium discoideum 6 ;1-;'-
*5-0)--h5±-7:gTIAT-Ctlikag 7 7 qc-)fo 7:C .Q -05j`Tc`i` Lit9L __41- PILAIMM V‘:
41A 0)7)z —!qMaineC114- Mkt L.,
fsz
)6P-1.1- L- &5*MIEWEJjt, WPM
1/, t
#a-T-0-)1)-1LiA-±.-1:11QtZfrjr9jtvEllo 17L-1)2),8), 7r)=11 n • 14- NI 1;4] 7:c,
-T-R-5211411r_ & STAT ts. eo)uv-twArJ Q 0)
さ ら に近 年 で は 、 粘 菌細 胞 に お い て ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トが 進 行 し、cDNAお よ び染 色 体 DNAを 用 い た 機 能 解 析 が 行 わ れ て お り、 粘
菌細 胞 移 動 体 期 で特 異 的 に発 現 す るmRNAよ りcDNAラ イ ブ ラ リ ー が 構 築 さ れ て い る 。 我 々 は 、 この 点 に 着 目 し、 子 実 体 の 形 態 形 成
に 影 響 を与 え る遺 伝 子 群 を 同 定 す る こ と を 目 的 と し て 、 予 定 柄 細 胞 特 異 的 に 発 現 す る cDNAク ロ ー ン を移 動 体 期 由 来 の18,000ク ロ ー ンのcDNAラ イ ブ ラ リー よ り選 別 し、 これ に ブ ラ ス トサ イ ジ ン耐 性 遺 伝 子(Bsr)を 挿 入 して ノ ック ア ウ トコ ンス トラ ク トを作 成 し 6)、 形 質 転 換 後 の 表 現 型 お よ び 遺 伝 子 型 の 解 析 に よ る 、 迅 速 か つ 簡 便 な子 実 体 形 成 に 関 す
る遺 伝 子 群 の 同 定 法 を検 討 した 。
1)東 北 大学 遺 伝 生態 研 究 セ ンター
2) 3)
近畿大学農学部農学科
(Institute of Genetic Ecology, Tohoku University, Katahira, Sendai 980-8577, Japan) (Department of Agriculture, Faculty of Agriculture, Kinki University, Nakamachi, Nara 631-8505, Japan) 近畿大学農学総合研究所(Institute for Comprehensive Agricultural Sciences, Kinki University, Nakamachi, Nara 631-8505, Japan)
124 近 畿 大 学 農 学 部 総 合 研 究所 報 告 第9号(2001)
材料と方法
1.ク ロ ー ン の 選 別 お よ び ノ ッ ク ア ウ トコ ン ス トラ ク トの 作 成
子 実 体 形 成 に 影 響 を 及 ぼ すcDNAク ロ ー ン の 選 別 に 際 し て は 、 粘 菌 細 胞 移 動 体 期 の 予 定 柄 細 胞 で 発 現 量 の 強 いmRNA、 お よ び 発 生 開 始 後 約14〜16時 間 の 移 動 体 期 由 来 の pBluescriptII(KS‑)に 挿 入 さ れ たcDNAラ イ ブ ラ リ ー18,000ク ロ ー ン に お け る デ ィ フ ァ レ ン シ ャ ル ・ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 結 果 に 基 づ き 、 さ ら に ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トで 公 開 さ れ て い る 、cDNAク ロ ー ン の 塩 基 配 列 よ り予 測 さ れ る タ ン パ ク 質 ホ モ ロ ジ ー か ら 、 膜 結 合 性 タ ン パ ク 質 を 含 む17ク ロ ー ン を 選 別 し た (Table1)0
次 に 、 選 別 し た 各 イ ン サ ー トの 中 間 位 置 を 一 カ 所 で 切 断 す る 特 異 的 制 限 酵 素 サ イ トで 切
断 し 、klenowfragmentで 平 滑 末 端 に し た 後 、
選 択 マ ー カ ー と し てSmaIで 切 り 出 し 精 製 し た1.4kbの ブ ラ ス トサ イ ジ ン 耐 性 遺 伝 子 (Bsr)を16℃,1〜10時 間 ラ イ ゲ ー シ ョ ン し て ノ ッ ク ア ウ ト コ ン ス トラ ク トを 作 成 し た 。 な お 、 ノ ッ ク ア ウ ト コ ン ス ト ラ ク ト は ク ロ ー ン 毎 に 一Bsrを付 し て 表 し た 。
2.粘 菌 細 胞 の 形 質 転 換
粘 菌 細 胞 の 形 質 転 換 に は 従 来 、 リ ン酸 カ ル シ ウ ム 法 に よ る 遺 伝 子 導 入 が 主 流 で あ っ た が 、 我 々 は よ り簡 便 で 効 率 的 な エ レ ク トロ ポ レ ー シ ョ ン法 に 従 っ て 形 質 転 換 を 行 っ た 。 な お 、 後 述 す る す べ て の 実 験 系 に お い て 、 粘 菌 細 胞 は 人 工 培 地 で 分 裂 ・増 殖 可 能 なAX2株 を 使 用 し た 。 先 に作 成 し た ノ ッ ク ア ウ トコ ン ス
ト ラ ク ト10〜20μ9を10μ1の 緩 衝 液(6mM Tris・HCI,6mMNaCl,0.2mMEDTA)に 懸 濁 し、
1〜2×10710.8mlの 濃 度 に 調 製 し た 粘 菌 細 胞 に 混 合 し て 、GenePulser(BIORAD)を 用 い て Table1.Selected17cDNAclonesforthepreparationofaknockoutconstruct.
Clone Insertedsite(clonesize) Relatedprotein SSBb16
SSB622 SSC451 SSC570 SSE832 SSG879 SSH816 SSI618 SSI644 ssr66a SSK212 SSK27b SSK401 SSK819 SSK864 ssMiia SSM649
EcoT221(0.6kb) BglII(2.4kb) BclI(0.8kb) BglII(i.2kb}
NcoI(0.8kb) EcoRI(0.6kb) EcoR1(1.1kb) MunI(0.7kb}
MunI(1.1kb) EcoRI(1.bkb) BsrGI(1.Okb) EcoT141(0.9kb}
MunI(0.9kb) EcoRV(1.3kb) NcaI{0.7kb) BamHI{0.9kb) ClaI(0.'7kb)
SNC2‑yeastsynaptobrevinhomolog multidrugresistanceproteinCDRl hypotheticalproteinA288(tripanosoma) hypotheticalproteinY17G7B
hypothetical51.5kdproteinC3HB gene7ECuscutaleflexaprotein humanser/thr‑proteinkinase
probablemembraneproteinYIVL179c{yeast) hypothetica128.5kdproteinCID4
acidicphosphoproteinprecursor probablemembraneproteinYCRO34w H+‑transportingATPase
superoxidedismutase CaenorhabditiselegansKO7Bl calmodulin‑bindingprotein outermembranelipoprotein
hypotheticalproteinYMR269w(yeast)
Theseclonesweretreatedwitheachspecificrestrictionenzyme,andtheywereusedasaknockout constructfortransformationafterinsertionofBsrgene
高 本 ・大 瀧 ・吉 田:Dictyosteliumdiscoideumに お け る 子 実 体 形 成 に 関 す る 遺 伝 子 群 の 同 定 125
3μF,1〜1.5kV/0.4cmの 条 件 で の エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン に よ り粘 菌 細 胞 内 に トラ ンス フ ェ ク シ ョ ン し た 。
トラ ンス フ ェ ク シ ョン後 、 最 終 濃 度10μ91ml のBlasticidinS(フ ナ コ シ)を 含 む10mlHL5 液 体 培 地 で2〜3日 置 き に培 地 交 換 し、 約10
日 間 の 培 養 中 に 形 成 さ れ た コ ロ ニ ー を 実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 し な が ら単 離 した 。
3.サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン
形 質 転 換 体 の 遺 伝 子 型 の 解 析 に は 、DIGラ ベ リ ン グ に よ るDNAプ ロ ー ブ を 作 成 し 、 被 検 体 と の サ ザ ンハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 行 っ た 。DIGラ ベ リ ン グ お よ び サ ザ ンハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 手 法 はBoehringerMannheim社 の プ ロ トコ ー ル に 従 っ た 。
単 離 した コ ロ ニ ー をHL5液 体 培 地 で 培 養 し、
QIAGEN社 の 手 法 に 従 っ て 形 質 転 換 体 の 染 色 体DNAを 抽 出 し た 。 次 に 、 抽 出 したDNAを 各 cDNAク ロ ー ン お よ びBsrを 切 断 し な い 制 限 酵 素 で 処 理 し、0.7%ア ガ ロ ー ス ゲ ル で 電 気 泳 動 後 、VacuGene(AmershamPhamlacia)を 用 い て ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ン(B㏄h血ger)に トラ ン ス フ ァ ー した 。 ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ンへ のDNAの ク ロ ス リ ン ク は 、365nmのUV照 射 に 依 っ た 。 ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ン は ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ンバ ッ フ ァ ー(Boehringer)を 用 い て プ レハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン さ せ 、DIGラ ベ ル し た cDNAク ロ ー ン お よ びBsrプ ロ ー ブ を25〜100 ng!mlの 濃 度 に 調 製 し、42℃ 、ovemightの 条 件 で ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン した 。
次 に 、 ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ン を2×SSC、5 min、0.1×SSC、15minの 条 件 で 洗 浄 後 、 ア ル
カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 抗DIG抗 体 を ブ ロ ッ キ ン グバ ッ フ ァ ー(B㏄ ㎞nger)で75mu!ml に 希 釈 し 、0.6ml130cm2の 希 釈 抗 体 液 中 で メ ン ブ レ ン を30分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト した 。DIGラ ベ ル さ れ た 面 に 発 光 基 質 と な るCSPDを 滴 下
し、 直 ち に パ ラ フ ィ ル ム で 気 泡 を残 さ な い よ う に 被 い 、5分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し て 化 学 発 光 反 応 させX線 フ ィ ル ム で シ グ ナ ル を 検 出 し
た 。
4.寒 天 培 地 上 で の 子実 体 形 成 観察
AX2株 お よび 形 質 転 換 体 の表 現 型 を比 較 す
a
る た め に 、 寒 天 培 地 上 に 粘 菌 細 胞0.1〜0.2ml と 同 量 の 大 腸 菌B/2株 を 滴 下 ・混 合 し 、 培 地 表 面 を 乾 燥 さ せ て22℃ で イ ン キ ュ ベ ー ト し、
実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 し た 。
結果および考察
1.サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ る 遺 伝 子 型 の 解 析
17ク ロ ー ン の ノ ッ ク ア ウ トコ ン ス トラ ク ト に よ り形 質 転 換 さ れ た 形 質 転 換 体 か ら染 色 体 DNAを 単 離 し、 サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ
ン を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 い ず れ の ク ロ ー ン に お い て も ノ ッ ク ア ウ トコ ン ス トラ ク トの 染 色 体DNAへ の 挿 入 が 確 認 さ れ た 。 ノ ッ ク ア ウ ト コ ン ス ト ラ ク トSSK401‑Bsrに お い て は 、DIG 標 識 さ れ たBsrプ ロ ー ブ と の ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン で、 い ず れ の 形 質 転 換 体 に お い て も お よ そ8.Okbの 位 置 に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た 。 ま た 、AX2株 で は シ グ ナ ル が 全 く認、め ら れ な か っ た(Fig.1)。 こ れ に よ り染 色 体DNA上 の SSK401に 対 応 す る シ ン グ ル コ ピ ー の 遺 伝 子 群
MC2561011
Fig.1.SouthernblotanalysisoftransformantswithSSK401 0rSSK864‑Bsr.
GenomicDNAstreatedwithClaIfromSSK401‑Bsr 励 ㎜ ㎏,DIG‑labeledBsr(a);orDIG‑labeled SSK401(b);genomicDNAstreatedwithEcoRI 丘omSSK864‑Bsrtransfbrmants,DIG‑labeledBsr (c);orDIG‑labeledSSK864(d).M:DNA molecular‑weightmarker,C:control(AX2).
126 近 畿 大 学 農 学 部 総 合 研 究 所 報 告 第9号(2001)
が 、 相 同 性 組 み 換 え さ れ た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 一 方 、SSK401を プ ロ ー ブ に 用 い た ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン で は 、Bsrが 挿 入 さ れ た 形 質 転 換 体 の 方 がAX2株 に 比 較 し1.4kbほ ど 上 方 に シ グ ナ ル が 現 れ る と考 え ら れ た が 、 実 際 に は ほ ぼ 同 位 置 に 観 察 さ れ た 。 実 験 に イ ン ト ロ ン を 欠 失 し て い るcDNAを 用 い た た め 、 配 列 の 差 異 が 相 殺 さ れ た 結 果 に な っ た も の と 考
え ら れ た 。
同 様 に ノ ッ ク ア ウ トコ ン ス トラ ク トSSK864‑
Bsrで は 、Bsrプ ロ ー ブ と の ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン で お よ そ9.4kbの 位 置 に シ ン グ ル コ ピ ー の シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た が、AX2株 で は 検 出 さ れ な か っ た(Fig.1)。 ま た 、SSK864を プ ロ ー ブ に し た 場 合 もAX2株 お よ び 形 質 転 換 体 で ほ ぼ 同 位 置 近 く に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た 。
SSK864‑Bsrの 形 質転 換 体 は と も に野生 株 に比 べ て 非 常 に倭 小 な子 実 体 を形 成 し、微 弱 な柄 を形 成 した一 方 で 、胞 子 形 成 に も影響 を及 ぼ した 。 選 別 した ク ロ ー ンは予 定 柄 細 胞 で の発 現 量 が 強 い もの を選 択 した に もか か わ らず 、 この よ う に胞 子 形 成 に も影 響 を及 ぼ した こ と は、柄 細 胞 の形 成 に 関係 す る遺 伝 子 が胞 子細 胞 の 遺 伝 子 発 現 に 関係 す る未 知 の転 写 調 節 因 子 に影 響 を与 え た結 果 と も考 え られ た 。
摘 要
細 胞 性 粘 菌D.discoideumの 予 定 柄 細 胞 特 異 的 に 発 現 す るcDNAク ロ ー ン を 用 い て 、 子 実 体 形 成 に 関 す る 遺 伝 子 群 の 同 定 を 試 み た 。 そ の 結 果 、 ノ ッ ク ア ウ ト コ ン ス ト ラ ク ト SSK401‑BsrとSSK864‑Bsrの 形 質 転 換 体 は 異 常 な 形 態 形 成 を 示 し 、 ま た サ ザ ン プ ロ ッ ト解 析 に よ っ て も 染 色 体DNAへ の ノ ッ ク ア ウ トコ ン ス トラ ク トの 挿 入 が 確 認 さ れ た 。
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