申請者名

論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨

申 請 者 名

髙 橋 知 也

乳 牛 は 分 娩 後 、泌 乳 と い う 莫 大 な エ ネ ル ギ ー 量 を 確 保 し な が ら 、脂 質 代 謝 を 盛 ん に 行 い 、日 々 恒 常 性 を 保 っ て い る 。特 に 分 娩 前 の 胎 子 へ の 栄 養 供 給 や 、 分 娩 後 の 急 激 な 乳 量 確 保 の た め に 、体 脂 肪 動 員 を す る こ と で 不 足 す る エ ネ ル ギ ー を 補 う な ど 、分 娩 前 後 の 脂 質 代 謝 は 著 し い 変 動 を 示 し て い る 。こ の 分 娩 前 後 の 脂 質 代 謝 に 支 障 を き た す と 脂 肪 肝 発 症 へ 進 行 す る 。ウ シ の 周 産 期 疾 患 発 症 と 脂 肪 肝 は 密 接 な 関 わ り が あ る と い う 報 告 は 数 多 い 。こ の よ う に 乳 牛 と 脂 質 代 謝 に は 深 い 関 わ り が あ り 、リ ポ タ ン パ ク 質 を 含 め た 詳 細 な 脂 質 代 謝 の モ ニ タ リ ン グ が 必 要 と 考 え ら れ て い る 。し か し な が ら 、ウ シ の リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 の 主 な 測 定 法 で あ る 超 遠 心 分 離 法 は 、時 間 と 労 力 を 有 す る ほ か 、ウ シ の HDL と LDL に 共 存 密 度 領 域 が 存 在 す る こ と か ら 、分 離 が 不 十 分 と な り 、 測 定 精 度 に 問 題 が あ る と さ れ て き た 。近 年 、ヒ ト お よ び ウ サ ギ に お い て イ オ ン 交 換 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 法(AEX-HPLC 法)で 高 密 度 リ ポ タ ン パ ク 質(HDL-C)、 低 密 度 リ ポ タ ン パ ク 質(LDL-C)、 中 間 密 度 リ ポ タ ン パ ク 質 (IDL-C)お よ び 超 低 密 度 リ ポ タ ン パ ク 質(VLDL-C)と い っ た リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 を 正 確 に か つ 迅 速 に 測 定 で き る よ う に な っ た 。 本 研 究 で は こ の AEX- HPLC 法 に よ る リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 の 測 定 に 着 目 し 、乳 牛 に お い て も 測 定 が 可 能 か 基 礎 的 検 討 を 行 っ て い る 。さ ら に 泌 乳 量 や 繁 殖 成 績 が 優 良 な 酪 農 家 と 不 良 な 酪 農 家 で 飼 養 さ れ て い る 牛 群 を 泌 乳 ス テ ー ジ ご と に 分 け て リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 の 比 較 を 行 う と と も に 、健 常 牛 に お け る 分 娩 前 後 の リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 の 推 移 を 調 査 し 、周 産 期 疾 患 発 症 牛 と 比 較 を 行 い 、臨 床 現 場 に お い て AEX-HPLC 法 に よ る ウ シ の リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 測 定 の 有 用 性 を 検 討 し た も の で あ る 。

第 2 章 で は ウ シ に お け る イ オ ン 交 換 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 法 を 用

い た リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 測 定 の 基 礎 的 検 討 を 行 っ て い る 。試 験 1 で は 、AEX- HPLC 法 に よ る 乳 牛 の リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 測 定 の 精 度 を 確 認 す る た め に 、6 頭 の ホ ル ス タ イ ン 種 成 乳 牛 を 用 い て ク ロ マ ト グ ラ ム の 波 形 の 確 認 、同 時 再 現 性 、 日 差 再 現 性 お よ び 希 釈 直 線 性 を 評 価 し て い る 。AEX-HPLC 法 に よ る ク ロ マ ト グ ラ ム は HDL と LDL の 溶 出 分 画 が 分 離 さ れ 、 ま た 、 各 々 の 溶 出 分 画 に 大 き な ズ レ は み ら れ な か っ た 。 ま た 、 ウ シ の IDL お よ び VLDL は 微 量 の た め 測 定 値 の 変 動 率 が 不 安 定 と な っ た が 、HDL お よ び LDL に 関 し て は 、 同 時 再 現 性 、日 差 再 現 性 お よ び 希 釈 直 線 性 と も に 良 好 な CV 値 を 示 し た こ と か ら 、AEX-HPLC 法 は HDL お よ び LDL に お い て 信 頼 で き る 測 定 法 で あ る と 評 価 し た 。

試 験 2 で は 、AEX-HPLC 法 と 、 既 存 の 測 定 法 で あ る 超 遠 心 分 離 法 お よ び ゲ ル ろ 過(GP-)HPLC 法 を 比 較 対 象 と し 、測 定 値 の 相 関 関 係 を 検 討 し て い る 。 AEX-HPLC 法 と 超 遠 心 分 離 法 お よ び GP-HPLC 法 の 間 で 、Total-C、HDL- C お よ び LDL-C に 関 し て 有 意 な 正 相 関 が 確 認 さ れ た 。 し か し な が ら 、 超 遠 心 分 離 法 は HDLお よ び LDLの 密 度 領 域 の 重 複 に よ り 分 離 が 不 十 分 で あ り 、 GP-HPLC 法 は HDL お よ び LDL の 粒 子 径 が 類 似 し て い る こ と か ら 、ク ロ マ ト グ ラ ム の 溶 出 分 画 が 重 複 し 、測 定 法 と し て は 不 適 と 考 え ら れ た 。以 上 の こ と か ら 、AEX-HPLC 法 に よ る ウ シ の リ ポ タ ン パ ク 分 画 測 定 は 従 来 法 と 比 較 し て 最 も 信 頼 性 の あ る 測 定 法 で あ る こ と を 示 し た 。

第 3 章 と し て 、AEX-HPLC 法 を 用 い て 泌 乳 量 お よ び 繁 殖 成 績 が 優 れ た 酪 農 家（ 優 良 農 家 ）と 両 成 績 が 不 良 な 酪 農 家（ 不 良 農 家 ）で 飼 養 さ れ て い る 牛 群 の 間 で 泌 乳 ス テ ー ジ ご と の リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 に 違 い が あ る か 比 較 を 行 っ て い る 。 総 コ レ ス テ ロ ー ル(Total-C)に 対 す る LDL-C の 割 合 に お い て 、2 酪 農 家 間 で 有 意 な 違 い が 認 め ら れ 、優 良 農 家 に お い て 泌 乳 最 盛 期 、泌 乳 中 期 お よ び 泌 乳 後 期 で 不 良 農 家 と 比 較 し て 有 意 に 高 値 を 示 し 、LDL-C 量 で は 高 値 を 示 す 傾 向 が み ら れ た 。 優 良 農 家 と 不 良 農 家 と の 間 に LDL-C の 量 お よ び 割 合 に 違 い が 見 ら れ た の は 、 優 良 農 家 の 方 が 泌 乳 量 を 補 う た め 、 乳 腺 へ VLDL に よ る TG 運 搬 を 盛 ん に 行 っ た こ と で 、VLDL の 代 謝 産 物 で あ る LDL

が 増 加 し た と し 、VLDL→IDL→LDL と い う 代 謝 経 路 が 活 性 化 し た と 考 察 し て い る 。 こ れ に よ り LDL-C の 割 合 を み る こ と が 優 良 牛 群 と 不 良 牛 群 の 摘 発 の 判 断 材 料 に な る と い う 画 期 的 な マ ー カ ー に な る 可 能 性 を 秘 め て い る 。今 ま で 何 を も っ て 牛 群 を 評 価 す る か 判 断 し か ね る の が 現 状 で あ っ た が 、 将 来 、 LDL-C 量 お よ び 割 合 が 優 良 不 良 の 判 断 の 一 助 に な る 他 、 牛 群 を 優 良 に す る 目 標 マ ー カ ー に な る 可 能 性 も あ り 、 評 価 に 値 す る 。

第 4 章 で は 、健 常 ホ ル ス タ イ ン 種 成 乳 牛 に お け る 分 娩 前 後 の リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 推 移 と 周 産 期 疾 患 発 症 と の 関 連 性 に つ い て 検 討 し て い る 。 試 験 1 で は 、脂 質 代 謝 が 盛 ん に 行 わ れ る 分 娩 前 後 に 着 目 し 、AEX-HPLC 方 を 用 い て 、 健 常 牛 10 頭 の リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 の 推 移 を 観 察 し て い る 。Total-C お よ び HDL-C は 、 分 娩 予 定 4 週 間 前 か ら 低 下 し 、 分 娩 日 に 最 低 値 を 示 し た 後 、 上 昇 す る と い う 過 去 の 報 告 と 同 様 の 推 移 を 示 し た 。 し か し な が ら LDL-C は 、 過 去 の 超 遠 心 分 離 法 を 用 い た 報 告 で は Total-Cお よ び HDL-C と 同 様 の 推 移 を と る と 報 告 さ れ て き た が 、AEX-HPLC で は 、 分 娩 予 定 4 週 間 前 か ら 低 下 し 、分 娩 1 週 間 後 に 最 低 値 を 示 し た 後 、上 昇 す る 推 移 を 示 し た 。こ の 結 果 は 、 AEX-HPLC 法 は 超 遠 心 分 離 法 で は 解 明 で き な か っ た 分 娩 後 の 肝 臓 か ら の TG 動 員 の 遅 れ を 解 明 す る こ と が で き た こ と を 意 味 す る 。AEX-HPLC 法 は 分 娩 前 後 の 脂 質 代 謝 を 今 ま で 以 上 の 詳 細 な 検 査 が 可 能 と な り 、将 来 性 の 高 い 研 究 報 告 で あ っ た と 評 価 し た 。

試 験 2 で は 、周 産 期 疾 患 発 症 が 分 娩 前 後 に 発 生 す る 脂 肪 肝 と 密 接 な 関 わ り が あ る と 報 告 さ れ て い る こ と に 着 目 し 、 脂 肪 肝 発 症 牛 、 第 四 胃 変 位 発 症 牛 、 お よ び 乳 熱 発 症 牛 の リ ポ タ ン パ ク 質 を 試 験 1 で 求 め た 健 常 牛 の 推 移 と 比 較 し た 試 験 で あ る 。 脂 肪 肝 発 症 牛 と 乳 熱 の 一 部 で LDL-C が 低 値 を 示 す 症 例 が 存 在 し 、こ の よ う な ウ シ は 肝 臓 か ら の 脂 肪 排 出 が 低 下 し て い る こ と が 示 唆 さ れ 、ま た 、GOT や γ-GPT と 相 関 し な い こ と か ら 、臨 床 現 場 の 診 断 検 査 の 一 助 に な る 可 能 性 が あ る も の と 評 価 し た 。

以 上 よ り 、本 論 文 は AEX-HPLC 法 を 用 い た 乳 牛 の リ ポ タ ン パ ク 質 分 画 測

定 の 有 用 性 を 検 討 し た が 、今 ま で 以 上 に HDL と LDL の 分 離 が 可 能 と な り 、 よ り 詳 細 な 脂 質 代 謝 を モ ニ タ リ ン グ す る こ と が 可 能 と な っ た 。 特 に LDL-C は 牛 群 の 比 較 に お い て も 、分 娩 前 後 の モ ニ タ リ ン グ に お い て も 、学 術 上 お よ び 応 用 上 貢 献 す る と こ ろ が 少 な く な い 。

よ っ て 審 査 委 員 一 同 は 、本 論 文 が 博 士(獣 医 保 健 看 護 学)の 学 位 論 文 と し て 十 分 な 価 値 を 有 す る も の と 認 め 、 合 格 と 判 断 し た 。