ア ス パ ラ ガ ス 由 来 フ ル ク タ ン エ キ ソ ハ イ ドロ ラ ー ゼ に 関 す る 研 究
菅原 匡哉(食 品栄養機能化学)
1目 的1
ユ リ科 の 多 年 生 植 物 で あ る ア ス パ ラ ガ ス は貯 蔵 炭 水 化 物 と して イ ヌ リ ン型 及 び イ ヌ リ ン ネ オ 型 フル ク タ ン を 蓄 積 す る 。 フル ク タ ン は 春 か ら夏 に か け 分 解 され 、 芽 の 再 生 の た め の エ ネ ル ギ ー と して 利 用 さ れ 、 夏 か ら秋 に か け て は 冬 に 備 え 貯 蔵 の た め に合 成 され る と考 え られ る。 こ の フル ク タ ン の 分 解 に は フ ル ク タ ン エ キ ソハ イ ドロ ラー ゼ(FEH)が 関 与 す る。 最 近 、 当研 究 室 で は ア ス パ ラ ガ ス根 か らFEH遺 伝 子 と思 わ れ る遺 伝 子aoeh4を 単 離 し、組 み 換 え タ ン パ ク 質 を 生 産 し、そ の 諸 性 質 を調 べ て き た 。しか し、
詳 しい 酵 素 化 学 的 諸 性 質 は わ か っ て い な い 。 そ こ で 本 研 究 で は メ タ ノ0ル 資 化 性 酵 母Pichiapastor°isを 用 い て 組 み 換 え タ ン パ ク 質 を 生 産 し、 よ り詳 細 な 酵 素 化 学 的 諸1生質 に つ い て 調 査 した 。
【方 法 】
aoeh4遺 伝 子 が 挿 入 され た プ ラ ス ミ ドを 用 い て 形 質 転 換 さ れ たP.pczstyisに よ り組 み 換 え タ ン パ ク 質 (AoEH4)を 生 産 し 、 各 種 カ ラ ム クaマ トグ ラ フ ィ ー に 供 し て 酵 素 の 精 製 を 行 っ た 。 そ し て 、 得 ら れ た 精 製 酵 素 に つ い て 酵 素 化 学 的 諸 性 質 を 調 査 し た 。
酵 素 反 応 液 組 成 は0.2M基 質50ｵ1、Mcnvai飴 緩 衝 液(pH5.o)25ｵ1、 酵 素 液25ｵ1と し た 。 反 応 温 度 は30℃ と し 、 酵 素 反 応 に よ り 遊 離 し た フ ル ク トー ス 量 を 高 速 液 体 陰 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー (HPAEC)に よ り定 量 し た 。 加 水 分 解 活 性 は1分 間 に1ｵzealの フ ル ク トー ス を 生 成 す る 酵 素 量 を1ユ ニ
ッ ト(U)と し た 。
ζ結 剰
2ρ α31鷹 に よ り生 産 し たAoEH4組 み 換 え タ ン パ ク 質 はDEAFSepharoseFF、HiTrapPhenylFF、
SephadexG‑100を 用 い て 精 製 し、 部 分 精 製 酵 素(総 タ ン パ ク 質 量0.100mg、 総 酵 素 活 性0。888U、 比 活 性:'/mg)を 得 た(Table1)。 基 質 特 異 駐 の 試 験 で は ス ク ロ ー ス1ケ ス トー ス 、 ネ オ ケ ス トー ス 、6一 ケ ス トー ス 、 ニ ス トー ス 、4c、 フ ル ク トシ ル ニ ス トー ス 、Sd,Sc混 合 物 、6a、 イ ヌ リ ン を 基 質 と し て 用 い た 。 そ の 結 果 、 イ ヌ リ ン ネ オ 型 フ ル ク トオ リ ゴ 糖 で あ るSd,Sc混 合 物 に 最 も 作 用 し 、 同 じ く ネ オ ケ ス ト ー ス、4cに も 高 い 作 用 を 示 し た 。 ま た 、 イ ヌ リ ン 型 フ ル ク トオ リ ゴ 糖 で あ る ニ ス トー ス 、 フ ル ク トシ ル ニ ス トー ス 、6a及 び イ ヌ リ ン に も 作 用 し た 。 ス ク ロ ー ス 、 レケ ス ト0ス 、6一ケ ス ト0ス に は 作 用 し な か っ た(Fig.1,Table2)。 速 度 パ ラ メ ー タ の 試 験 で は ネ オ ケ ス トー ス と ニ ス トー ス の 臨 値 を 算 出 し た 。 そ の 結 果 、 ネ オ ケ ス トー ス の 属.値 は35mM、 ニ ス トー ス のKm値 は290mMと な り、 ネ オ ケ ス トー ス の 方 が ニ ス トー ス よ り も 親 和 性 が 高 い こ と が 示 唆 さ れ た(Fig.2,3)。 ア ス パ ラ ガ ス 根 由 来 抽 出 糖(DP≧6、
DP=3‑5)に 対 す る 反 応 生 成 物 の 経 時 変 化 の 試 験 で はAoEH4組 み 換 え タ ン パ ク 質 は フ ル ク タ ン に 作 用 し フ ル ク トー ス 、 ス ク ロ ー ス 、 レ ケ ス トー ス を 生 成 し た 。 長 時 間 の 反 応 で は フ ル ク タ ン が 分 解 され ネ オ ケ ス
トー ス や ニ ス トー ス 、4cな ど の フ ル ク トオ リ ゴ 糖 の 生 成 が 見 ら れ た(Fig.4,5)。
こ れ ら の 結 果 よ り 、AoEH4組 み 換 え タ ン パ ク 質 は β一2,1結 合 を 有 す る イ ヌ リ ン 型 フ ル ク トオ リ ゴ 糖 に 作 用 す る だ け で は な く 、 イ ヌ リ ン ネ オ 型 フ ル ク トオ リ ゴ 糖 の グ ル コ ー ス6位 と フ ル ク トー ス2位 の 結 合
に も 作 用 し 、 さ ら に 高 重 合 度 の フ ル ク タ ン に も 作 用 す る 酵 素 で あ る と 考 え られ た 。
'F
able 1. Summary of purification procedures of recombinant AoEH4.
Procedure Total protein Total activity Specific activity Recovery Purification
(mg)(U)(U/mg) (%) (-fold)
Crude enzyme
DEAE Sepharose FF
IliTrap Phenyl FF
Sephadex G-100
1,378
121
5.17
0.100 62.9
37.9
22.4
0.888
0.0457
0.313
4.33
8.88 100
60.3
35.6
1.41
6.89
95.0
195
Table 2. Substrate specificity of AoEH4.
Substrate Relative activity (%)
Sucrose 1-Kestose 6-Kestose Neokestose Nystose 4c
Fructosylnystose 5d, 5c 6a
Inulin
0 0 0 100 44.2 91.5 60.3 127
63.3 30.1
-0 .04 -0 .02 0.00 0.02 0.04 0.06
1/s, (mMYI
0_O8 0 10 0 12
Fig. 2. Lineweaver-Burk plot for hydrolysis of neokestose by AoEH4.
-0 .005 1.8
0.000 0.005 0.010 0.015
Us, (mM)1
0.020
Fig. 3. Lineweaver-Burk plot for hydrolysis of nystose by AoEH4.
0.025
A Neokestose
_
