ティラピアの耳石日周輪の形成リズムに対応する耳石小のう内リンパ液成分の日周期的変化

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(1)Title. ティラピアの耳石日周輪の形成リズムに対応する耳石小のう内リンパ液成分の日周期的変化. Author(s). 田中, 邦明. Citation. 北海道教育大学紀要. 第二部. B, 生物学,地学,農学編, 42(2): 9-18. Issue Date. 1992-02. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/6479. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) . 北海道教育大学紀要（第２部Ｂ）第４２巻第２号ｌｏｆＨｏｋｋａｉｄｏＵｎｉｖｅｒｓｉｉＪｏｕｍａｉｏｎ２Ｂ）ＶｏｌｔｙｏｆＥｄｕｃａｔｔｏｎ（Ｓｅｃ ‐４２ ‐２，Ｎｏ. 平成４年２月Ｆｅｂｍａｗ，１９９２. プィラピアの耳石日周輪の形成リズムに対応する耳石小のう内リンパ液成分の日周期的変化. 田. 中. 邦. 明. 北海道教育大学函館分校理科教育教室. ＫｕｎｉａｋｉＴａｎａｋａｒ. ＤａｉｌｙＣｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｏｔｉｃＦ１ｉｔｈＥｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｏ１ｕｉｄＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＤａｉｌｙＧｒｏｗｔｈｌｎｃｒｅｍｅｎｔｓｉｎ. ｏｔｏｌｉｌａｐｉａ（ＴｅｌｅｏｓｔＦｉｓｈ）０γｅｏｃ勿〆の吻葛形Ｚ所化“ｓｔｈｏｆＴｉ，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｃｉｉｅｎｃｅＥｄｕｃａｔｏｎ，ＨａｋｏｄａｔｅＨｏｋｋａｉｄｏＵｎｉｖｅｉｉｔｙｏｆＥｄｕｃａｔｒｓｏｎ，Ｈｏｋｋａｉｄｏ０４０. Ａｂｓｔｒａｃｔ. ＤａｉｌｙＣｈａｎｇｅｓｏｆｔｏｔａｌｃａｌｃｉｕｍｌｌｉｎｐｌａｓｍａａｎｄｏｔｏｌｉｉｌｔｈｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｅｖｅｃｆｕｉｄ（ＯＦ），ａｎｄｌｕｂｌｌｉｈｉｉｏＭ）ｉｉｔ（ＯＦｉｉｔ０２ｌｉｔｄｄ物Ｓｓｏｒｌｔｕｅｎｔａｐａｅｏｏｏｇａｎｃｍａｒｘｓｎｗｅｒｅｓ ◇“ ２ “”〆定雄‐Ｄａｉｙ， γ卿〆ｉｏｎｉｎｔｈｅｔｏｔａｌｃａｆｌｌｉｌｉｎＯＦｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｕｃｔｕａｔｌｉｎｇｄａｒｋｔｓｈｏｗｅｄｌｏｗｅｒｌｃｕｍｌｅｖｅｅｖｅｓｄｕｒ－ｌｉｏｄｓａｎｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｗｈｏｌｉｍｅｆｉｉｆｐｅｒｓｈｗｅｒｅｓｔａ・Ｖｉｎｇｏｖｅｒ２０ｄａｙｓｉｎｗｈｅｔｃｈｔｈｅｇ１ごｏｗｔｈｏ. ｉｔｈｓｉｔｏｐｐｅｄｌｔｉｉｏｔｏｌｓｓｌｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｄａｉｔｃｕｍｌｅｖｅｓｉｎＯＦｍａｙｂｅａｒｅｓｕｌｙｃｈａｎｇｅｓｉｎｃａｌ ‐ｌｌｙｃａｌｆｉｉｉｏｎｒｈｙｔｈｍｏｆｔｈｅｏｔｏｌｉｌｙｃｈａｎｇｅｓｉｎｃａｌｏｆａｄａｉｉｕｍｌｔｈａｎｄｄａｌｃｃａｔｃｅｖｅｓｉｎＯＦｍａｙｎｏｔｈｅｄａｉｌｙｃａｌｉｆｉｉｏｎｏｆｔｈｅｏｔｏｌｃｏｎｔｒｏｌｔｉｌｙ弾ビｏＷｔｈｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓｉｎｏｔｏｌｉｔｈａｎｄｆｏｒｍｄａｃｉｃａｔｔｈｓ．ＭｏｓｔｏｆｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｓｏＭｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｉｎＯＦｂｙｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ，ｂｕｔｎｏ. ｌｙｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎｆｉｃｏｍｍｏｎｄａｉｈｅ鱒「ｅａｔｖａｒｉｅｔｙｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｈｇ１ごｏｕｐｓｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｉｎｇｌｔｅｒｎｓｉｌｉｆｉｉｏｎｏｆｏｔｏｌｉｅｆａｃｔｏｒｗｈｉｃｈｃｏｎｔｒｏｌｔｈｓｗａｓｎｏｔｆｏｕｎｄｉｐａｔｓｔｈｅｄａｃｃａｔｙｃａｌｎｔｈｉｓ ‐ＮｏｓｌｙｓｏＭｈａｓｎｕｓｔｕｄｙ．ＡｐｐａｒｅｎｔｕｃｎｅｒｏｕｓｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎｄｉｓｓｅｃｒａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓａｃｃｕｌｕｓｗｈｉｃｈｓｕｒｒｏｕｎｄｓｔｈｅｏＦａｎｄｓｏｍｅｏｆｔｈｅｓｏＭｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｌｏｎｇｔｅｒｍ. ｆｃａｌｉｆｉｉｏｎｏｆｔｈｅｏｔｏｌｉｃｏｎｔｒｏｌｏｉｉｖｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｉｍｍｕｌｔｈｔａｔｃｃａｔｉｔｅｒｎｓｏｆｌｏｅｌｒｏｐｈｏｒｅｔｅｃｔｃｐａｔ ‐ＱｕａｌｉｓｏＭｉｎＯＦｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎｆｓｈｓｔａｒｖｅｄｆｏｒ２０ｄａｙｓ－. （９）.

(3) . ８８. 田中邦明. はじめにｌｙ魚類の平衡感覚器である耳石には，その成長にともなって毎日１本づつ形成される日周輪（ｄａｉ１｝ ‐ これらは微細構造的にアラレ石針状結晶からなる炭酸カルシウｈｉ）が存在する．ｔｎｃｒｅｍｅｎｇｒｏｗｔ，Ｓ）４）｝カルシウムとムに富む層と網目状の有機基質２に富む層の反復構造として観察されることから３，有機基質，またはそのいずれか一方の日周期的な耳石への沈着リズムによって形成されるものと考８））７））しかしこれまで有機基質の沈着リズムに関する報告はないＭｕｇｉｙａら（１９８１）９えられている６．. ．. ，. はキンギョＣ伽硲鯛硲伽ｍ≠硲において，耳石への放射性カルシウムの沈着に日周リズムがあり，それらが外界からのカルシウム摂取および血梁カルシウム濃度の日周変化と対応していたことから，鯉からの日周期的なカルシウム摂取による血築カルシウム濃度の変化が，耳石の石灰化を調節しているものと考えている．. ｉ）は，内耳の小のう中に存在する．小のうは聴斑細胞最も大型の耳石である１対の偏平石（ｔｔｓａｇａをはじめとする薄い細胞層からなる袋であり，その内部は内リンパ液と呼ばれる液体によって満たされているため，耳石表面の大部分は直接この液体に接している．このことから，耳石の成長に必要０）内リンパ液をなカルシウムおよび有機基質の前駆物質は小のう聴斑部周辺の細胞から分泌され１，介して耳石に沈着するものと考えられており，この液体の性質，特にカルシウムおよび有機基質前駆物質の濃度がそれらの物質の耳石への沈着を調節，あるいは反映している可能性が考えられてい１２｝るｕ）．. ｌｉｔ魚類の耳石有機基質はそのアミノ酸組成の特殊性から，耳石に特異的な蛋白質として “ｏｎ”とｏ５｝は軟体動物の殻（炭酸カルシウム）の有機基４３）その形態的特徴１）および組織化学的性質１呼ばれ１，，６７）｝および外套膜外液１質と似ており，耳石と殻の石灰化部位にそれぞれ存在する小のう内リンパ液１の有機基質の電気泳動的性質も類似していることから，耳石の石灰化においても内リンパ液の有機基質前駆物質が重要な役割を果しているものと考えられる．本研究は，耳石日周輪の形成構成を明らかにするため，小のう内リンパ液のカルシウム濃度および耳石有機基質前駆物質の量的，質的日周変化について検討した．. 実験材料および方法１）実験魚と飼育条件ｉ）を用ｏｍｍ実験魚として，ティラピア０〆ｚｅｏｃ炉ひ粥禽雛Ｚｏｃ閑の幼魚および成魚（標準体長８０～１９２自然昼夜（明期０８００～２０００時）ま２－１いた．実験魚は２０～６０ぞの循環ろ過水槽で飼育し，ＬＤ１：：たはＬＤ１２一１２逆転昼夜（明期２０時）光周期．水温２７±１℃で２週間以上，十分な０：００～０８：０給餌を行って実験に供した．また，自然昼夜の光周期，水温２７±１０Ｃで２０日間絶食させた群を別に設けた．人工照明には白色蛍光灯を用い，水中の照度は６０ぞ水槽の底面で１５０～９００ｌｕｘであった．餌料はコイ育成用固形飼料を１日１～３回，飽食するまで与え，十分な耳石成長が起こるよう配慮した．この間，水質の悪化を防ぐため，数日に１回，飼育水およびろ過材を交換した．また，水温，光周期は同一条件で２０日間絶食させた群を設けた．２）カルシウム濃度の日周変化の測定３または６時間ごとに２４時間にわたって５～６個体から血築および小のう内リンパ液を採取し. て原子吸光分析器（日立５１８型）により，各個体ごとに測定した．測定時の希釈液としてはリンに０）（１.

(4) . ティラピアの耳石日周輪の形成リズムに対応する耳石小のう内リンパ液成分の日周期的変化. ８９. よる阻害を防止するため１％塩化ランタンを含む蒸留水を用い，血疑で１０１倍，内リンパ液で５１倍の希釈率とし，市販の血清用標準液を同一の希釈液で４種類に希釈し検量線を求めた．なお，肉眼で生殖線を観察して成熟が確認されたメス個体は，著しく高いカルシウム濃度を示すため，他の個体と区別して扱った．. ３）測定試料の採取と保存実験魚は水槽から素早く取り上げ，ただちに尾部切断により，ヘパリン処理のガラス毛細管に採血し，３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って，血築を採取した．採血後，ただちに実験魚の脊髄および腹大動脈を切断して脳室での出血を防止し，頭蓋を眼球の上縁の高さで水平に切開し，脳および脳脊髄液を除去して，露出した小のうから内リンパ液をガラス毛細管で吸引，採取した．血柴および内０Ｃで数日から数カ月間冷凍保存したリンパ液は測定使用時まで－３０．. ４）耳石有機基質の抽出耳石有機基質の前駆物質を免疫化学的に検出するため，ティラピアの耳石に含まれている有機基質を抽出し，抗血清を作製した．有機基質はｐＨ７４に調整した１０％ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ．ｉｉｄ）２Ｎａ溶液３０ｍ″ で１ｇの耳石を脱灰し，ＥＤＴＡ可溶性および不溶性分画を抽出ｔｔｔｒａａｃｅｃａｃｅした．これらをＶｉｓｋｉｎｇチューブに入れ透析し，セファデックスＧ２５の粉末で約１ｏｍぞに濃縮し. ｏＣで１た．これを耳石有機基質溶液（ｓｏＭ）として４℃で数日から約１ヵ月間冷蔵，または－３０～６カ月間冷凍保存した．. ５）抗血清の作製と特異性の確認耳石有機基質に対する抗血清は，体重約３ｋｇのウサギに耳石有機基質溶液１～２ｍβ を２週間おきに５回注射して作製した．なお耳石有機基質溶液はＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバントに懸濁させ，背部皮下に注射した．ウサギからの抗血清の採取は，オクタロニ一法で明瞭な沈降線が形成されるほどｏＣで約１年以内４０Ｃ抗体の力価が高まっていることを確認してから行った．抗血清の保存は－３０，では０‐０１％アジ化ナトリウムを加え数日から約１カ月冷蔵保存した．なお，耳石有機基質に対する抗血清の特異性はオクタロニ一法により抗原との間に形成された沈降線で確認した．. ６）耳石有機基質前駆物質の濃度および質的日周変化の測定８｝および二次元免疫電小のう内リンパ液中の耳石有機基質前駆物質は，ロケット免疫電気泳動法１９｝によって分析定量したロケット法では個体ごとの内リンパ液５ｇ″または各測定群の気泳動法１，．個体をプールしたもの１０βぞを泳動し，ロケット状に形成さた沈降線の高さから，有機基質前駆物質の相対的濃度を測定した．ロケット法では抗耳石有機基質血清（ａｏＭ）を７．５％含む１％アガロース板上に作製した直径３ｍｍの小穴に内リンパ液を注入し，水冷式電気泳動槽でゲル長ｌｃｍあたり２～３Ｖで，約２４時間，明瞭な沈降線が現れるまで通電した．二次元法では１ ‐２％アガロースでＢＴＢが試料穴から約ｌｃｍ移動するまで通常の一次元電気泳動を行い，このゲルを抗耳石有機基質血清（８‐７％含むアガロースに埋め込んで，最初の泳動とは垂直の方向に泳動した．二次元法ａＯＭ）を１においては沈降線の高さと形態から，それぞれ有機基質前駆物質の相対的濃度と質的差異を検討した．. （１１）.

(5) . . ９０. 田中邦明. 実験結果血業カルシウム濃度は，雄で平均６．８９±０‐１４（Ｓ‐Ｅ‐ ）ｍＥｑ／ぞ，雌で平均１３‐７１±０‐９７ｍＥｑ／ぞと，雌図１したが））に大きな個体差が認められた（＜００５で２倍以上の値を示し，雄に較べ有意（って，Ｐ ‐ ．０８００時）の光２：１２自然昼夜（００～２０本研究では雄の個体についてのみ日周変化を検討した．ＬＤ１：：. 周期下で十分な餌を与えた群では，暗期の後半から明期の前半にかけて低い値を示した（図２）．絶食２０日群では，各時刻間で有意差はないが，明期の前半に低く，明記の後半から暗期にかけて高い値を示した（図２）．また，絶食２０日群と給餌群の比較では，全時刻の個体を合わせた平均値は絶／″ と，絶食群で有意（Ｐ＜００１）に低かった．食群で５‐８０±０‐０７ｍＥｑ／ぞ，給餌群では６．４１±０ ‐ ‐０７ｍＥｑ０８６ム ①のｏー０トＥ）」－＼▽山Ｅ一部〉①」Ｅコａａｏ－｛. ２ . ＼. ０ . ｛ー＼冨Ｅ－－ ①＞①」Ｅコ８ＢＱ一０｝０ト. Ｍｄｅ ▲・Ｆーｅｍｏｅ △Ｏ. ▲ ▲ ▲. ａｌ。ｌ．ム. . 。も. ～. ．２０. ０２. Ｐーｄｓ１ｎｑ. ｏ８玉裂傷ｐｈ. ７ｏ６５．６Ｏ．５５．５Ｏ．. Ｔｉｍｅ図１. ティラピアの血凝および小のう内リンパ. Ｆｅｄ. 図２. ２０. ０２. ０８１１１ム１７Ｔｉｍｅ. ティラピアの血擬カルシウム濃度の. 液のカルシウム濃度. 日周変化と絶食の影響. ００時）の光周期，００～２０ＬＤ１２一１２（明期０８：：水温２７±０．庁Ｃの条件で，２週間以上飼育し，経. ＬＤ１２一１２（明期０８００～２０００時）の光周期，：：水温２７±０．守Ｃの条件で，２週間以上飼育した。絶食群は２０日間，給餌を行わなかった． ●は給. 時的に各６個体から血梁および内リンパ液を採. 餌群，０は絶食２０日群で，各点は６個体の平均. 取した．血葉は，それぞれ， ▲雄， △雌，内リンパ液は， ●雄，０雌の個体を示している．. 値と標準誤差を示している．. 内リンパ液のカルシウム濃度は，いずれの個体においても，血葉に較べて低く，２‐１～３．６，平均２‐ ９４ｍＥｑ／″と，雄および未熟雌魚の血梁カルシウム濃度の約４０％であり，個体差についても，雌雄と. もに，血薬カルシウム濃度の場合よりも著しく小さかった（図１）．雌雄差は，雄に較べ雌で有意（Ｐ＜００５）に大きかったが，血業でみられた程の大きな差は認められなかった．日周変化については，個 ‐ 体ごとに測定した自然昼夜群（図３，Ａ）および逆転昼夜群（図３，Ｂ）で，いずれも明期に低くなる傾向がみられ，特に自然昼夜群の１４：００時では，他の時刻をすべて合わせた平均値に較べて有意パ液をプールして測定した自然昼夜群でも，各時刻に５～６個体分の内リン＜た（００５）に低かＰ．っ．２）（１.

(6) . ティラピアの耳石日周輪の形成リズムに対応する耳石小のう内リンパ液成分の日周期的変化. ９１. 明期の中央の１４：００時に低く，暗期の後半の０２：００～０５：００時に高い傾向を示した（図４）．絶食２０日群では，どの時刻においても給餌群より有意（）に高かったが，暗期に高く，明期に低い０１ｐ＜０．. という，給餌群と同様の日周変動を示していた（図４）．. 壱 . ３５. ｏ６＾３．. ２０・. Ａ＋. よ. ／，，“. ，. 命. Ｔｉｍ・ｖ. Ｂ . . . . さ. ｄデー. . ≧品２５，. . . . . 一三ｅ ‐ １％. 図３ティラピアの小のう内リンパ液カルシウム濃度の日周変化各点は，６個体の平均値と標準誤差を示して. いる．Ａは自然昼夜，ＬＤ１２一１２（明期０８：００～２０００時），Ｂは，逆転昼夜，ＬＤ１２一１２（明：期２０００～０８００時）の光周期で２週間以上飼育：：した．＊ｐ＜００５で有意差あり． ‐. ２０・．２０. Ｔｉｍｅ. １叫，．．０２０５０８１１１ ‘ １７Ｔｉｍｅ. 図４ティラピアの小のう内リンパ液カルシウム濃度の絶食による影響ＬＤ１２－１２（明期０８００～２０００時）の光周期，：：水温２７±０．げＣの条件で，２週間以上飼育した．絶食群は２０日間，給餌を行わなかった． ●は給. 餌群，０は絶食２０日群で，各熟ま６個体分をプールした内リンパ液の値を示している．. オクタロニ一法による，抗耳石有機基質血清（ａｏＭ）の特異性の検定では，抗原であるＥＤＴＡ可溶性耳石有機基質（ｓＯＭ）（写真１，Ａ，Ｂ，Ｃ）と小のう内リンパ液（ＯＦ）（写真１，Ａ，Ｃ，Ｄ）との両方に対して複数の明瞭な沈降線が形成された．また，抗耳石有機基質血清（ａｏＭ）とティラピア血清（ＴＳ）との間には弱い１本の沈降線がみられたが（写真１，Ｅ矢印），抗血清の特異性を高めるため，抗血清にティラピア血清を加えて，ティラピア血清に対する余分な抗体を吸収したところ，この弱い沈降線は消失した（写真１，Ｆ）。このことから，内リンパ液中の耳石有機基質前駆物質の測定には，３分の１量のティラピア血清（ＴＳ）を抗耳石有機基質血清（ａｏＭ）に加えて遠沈し，特異性を高めた抗血清を使用した．給餌群および絶食群のロケット免疫電気泳動像は３～５本の重複する沈降線を示し，その形態および本数は個体間で著しく異なっていたため，両群ともに各時刻での沈降線の高さを単純に比較することは困難であった（写真２，Ａ，Ｂ）．しかし，絶食群の沈降線の染色度は給餌群と明らかに異なっており，背の高い沈降線が薄く現れている個体が多かった（写真２，Ｂ）．二次元免疫電気泳動像では，給餌群（写真２，Ｃ）および絶食群（写真２，Ｄ）ともに，複数の（１３）.

(7) . ９２. ‘. 田. 中. 明. 邦. 沈降線が分離して現れ，給餌群ではそのうち３本（Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３）は明瞭であったが，時刻による沈降線の形態および高さの変化は認められなかった．一方，絶食群では，給餌群ではみられな４：かった沈降線（Ｌ４）が現れ，最も背の高い沈降線（ＬＩ）の染色性は低くなっていた．また，１００時および２０：００時で各沈降線の高さが低い傾向を示していた．. 考. 察. ０はニジマスＳα脳ｏ解か吻ｅＺとイシガレイ瓦解“関脇〆◇昭雄について，血清ｉ１９６６）２Ｍｕｇ γ ｙａ（と小のう内リンパ液のカルシウム濃度を比較し，総カルシウム濃度は，内リンパ液では血清より常に低く，両者の年周変化のパターンは必ずしも一致していないが，膜透過性のカルシウム濃度については血清と内リンパ液で一致した年周変化のパターンがみられることを報告している．本研究においては，ティラピアの内リンパ液中の膜透過性カルシウムの測定は行っていない．しかし，ニジマスとイシガレイでは，一定の時期における内リンパ液中の総カルシウムと膜透過性カルシ１）このことから，小のう内リンパ液中の総カルシウム濃度は，ウムの濃度比は，ほぼ一定であった２．膜透過性カルシウム濃度を指標するものと思われ，本研究で測定された総カルシウム濃度の日周変. 写真１オクタロニ一法による抗原性比較からの抗耳石有機基質ウサギ血清の特異性の検定ａＯＭは抗耳石有機基質ウサギ血清，ｓＯＭはティラピアの可溶性耳石有機基質，ＯＦはティラピアの小. のう内リンパ液，ＴＳはティラピアの血清を示している．Ａは，ａｏＭに対するＳＯＭ，ＯＦおよびＴＳとの反応．Ｂは，ａＯＭに対するｓｏＭの希釈列の反応．Ｃは，ａＯＭに対するｓＯＭと０Ｆの希釈列の反応．Ｄは，ＯＦとａｏＭの希釈列の反応．Ｅは，ａＯＭとＴＳの希釈列との反応．Ｆは，ｓＯＭに対する，ａｏＭとＴＳの混合列の反応を示している．. ４）（１.

(8) . ティラピアの耳石日周輪の形成リズムに対応する耳石小のう内リンパ液成分の日周期的変化. ９３. 化は，本質的に，耳石へ供給されるカルシウム量の日周変化に基づくものと考えられる血疑およ．び内リンパ液のカルシウム濃度には，いずれも日周変動がみられたが血葉では明期の後半に高い，値を示したのに対し，内リンパ液では逆に明期で低く，暗期で高かったしたがって血柴と内リンパ．，液それぞれのカルシウム濃度が平行的に変化する傾向は認められなかった．また，成熟雌の血柴カルシウム濃度は雄の２倍以上もの高い値を示すにもかかわらず内リンパ，液カルシウム濃度は雄に較べて１０％高かったにすぎないこと，さらに絶食群では血業カルシウム濃度が給餌群より有意に低かったのに対し，内リンパ液では有意に高かったことから血柴と内リン，パ液のカルシウム濃度は互いに独立して変動している傾向にあり血柴カルシウム濃度が直接内，，リンパ液カルシウム濃度を支配している可能性は低いものと考えられる．内リンパ液カルシウム濃度の日周変化は，光周期に対応して明期の中央時に低下する傾向がみ，られたが，点灯直後からのカルシウム沈着の開始，および暗期の後半におけるカルシウム沈着の停 ′ 十. ＡＯＭ. ー. ．. ・. . ÷. . . ０８. ＡＯＭ. ・十. ．ヰ. Ｂ. ↑ . . . 一 . . ０８. . 写真２. ４１. ０２. ２０. . . . . . ティラピア小のう内リンパ液成分の日周変化と絶食の影響についてのロケ. 動法および二次元免疫電気泳動法による解析. ット免疫電気泳. Ａは，給餌群のそれぞれ２０００，１４００，０８：００００時における，一個体ごとのロケット免疫電気泳動像：：：，０２．Ｂは，絶食２０日群の各時刻における一個体ごとのロケット免疫電気泳動像を示している．Ｃは，給餌群の，. 各時刻におけるプールした小のう内リンパ液の二次元免疫電気泳動像Ｄは絶食２０日群のプールした小の，．うリンパ液の二次元免疫電気泳動像。なお十は泳動時の陽極一は陰極 →は泳動による抗原の移動方向を，，，示している．ＡＯＭは抗耳石有機基質ウサギ血清を含んだアガロースである．. （１５）.

(9) . ９４. １. 田中邦明. ３２）２）を反映するような，時刻に対応した顕著な変動は認められなかった．また，耳石へのカルシウ滞２ム沈着が最も活発な明期の中央時に，むしろカルシウム濃度の低下がみられたことから，少なくとカルも日周輪の形成機構として，内リンパ液カルシウム濃度が日周期的に変化すること，すなわちシウム濃度が高まって，カルシウムが過飽和になり，日周期的な耳石成長が起こるとする機構は考えにくいものと思われる．耳石成長の活発な時間帯における内リンパ液カルシウム濃度の低下は，むしろ二次的な結果と考えられる．すなわち，この現象は，何らかの要因によって耳石へのカルシウム沈着が促進された結果，内リンパ液中のカルシウムが一時的に不足し，濃度の低下を招いたものと解釈される．同様の傾向は，耳石成長に大きな差があると思われる，給餌群と絶食２０日群の内リンパ液のカルシウム濃度の比較においてもみられ，完全に耳石成長が停止していると思われる絶食２０日群の方が，有意にが最も高いカルシウム濃度を示していた．また，年周変化においても，イシガレイでは，耳石成長４２｝活発であると思われる夏期に，むしろ内リンパ液カルシウム濃度が低下すると報告されており，耳石の成長と内リンパ液カルシウム濃度の低下傾向は普遍的な現象と思われる．したがって，小のう内リンパ液中のカルシウム濃度が耳石の成長を直接支配している可能性は低いものと考えられる．ａＯＭ）にロケット免疫電気泳動法および二次元免疫電気泳動法において，抗耳石有機基質血清（対して内リンパ液（ＯＦ）が３～５本の沈降線を形成したことは，内リンパ液中に存在する耳石有機基質前駆物質が，耳石有機基質と共通の抗原性をもつ，複数の物質からなり，また同時に，抗耳石有機基質血清中に複数の抗体が含まれていることを示している．したがって，このような多価抗血清を用いる場合，同一抗原に対応する沈降線が識別可能であれば，ロケット法および二次元法で抗原の半定量を行うことができる．内リンパ液中の耳石有機基質前駆物質の濃度については，給餌群および絶食群のいずれにおいても，プールした内リンパ液の二次元法でも日周変化はみられず，また，ロケット法では著しい個体差がみられたことから，内リンパ液中の耳石有機基質前駆物質の質的，量的日周変化と日周輪の形成との対応は認められず，これらの変化が日周輪の形成を調節しているという証拠は得られなかった．鼻－一方，給餌群と絶食群の比較では，特に二次元法において，絶食群で出現，明瞭化する沈降線および染色性の低下する沈降線が少数ながら認められたことは，耳石有機基質前駆物質の成分の一部に，絶食によって量的，質的に変化するものが存在することを示している．このような絶食による耳石有機基質前駆物質の成分変化は，給餌群のいずれの時刻においても認められなかったことから，少なくとも日周輪の形成に関与しているとは考えにくい．しかし，絶食による長期的な耳石成長の停止とは何らかの関係があるものと思われる．一般に，長期の絶食によって耳石の成長は停止し，厚い有機基質層からなる明瞭な障害輪が形成される．今後，低水温，ストレスおよび水質の悪化などによる障害輪の形成と内リンパ液中の耳石有機基質前駆物質の成分の変化との関係についても明らかにする必要があろう．が本研究において，抗耳石有機基質血清と小のう内リンパ液との間に，複数の明瞭な免疫沈降線形成されたことは，耳石有機基質と同じ抗原性をもつ複数の物質が，小のう内リンパ液中に大量に含まれていることを示しており，耳石への有機基質の供給が，小のう内リンパ液を介して行われていることを証明するものである．また，ティラピア血清との間にごく弱い沈降線が形成されたことは，耳石有機基質成分の少なくとも一部は血清由来のものであることを示している．したがって，耳石有機基質成分の大部分は耳石と小のう内リンパ液に特異的なものであり，小のうを取り囲む何５）はティラ）２１９８９ｉｔｏｈ（，らかの細胞が耳石有機基質前駆物質を生産していることを示している．Ｓａ泌パ液中にのう胞状の分ピアの小のう細胞の電子顕微鏡的観察から，小のう細胞の表面から内リン６）（１.

(10) . ティラピアの耳石日周輪の形成リズムに対応する耳石小のう内リンパ液成分の日周期的変化. ９５. 物が放出されており，それらが耳石有機基質前駆物質であることを示唆しているもしこれらの，．物質の分泌に日周期的な変化があるとするならば小のう細胞が何らかの分泌物質を介して耳石の，成長を調節している可能性が考えられる．小のう細胞が耳石の成長を調節しているという考えは，耳石の部位によってその成長率が異な，るという事実からも支持される．一般に，魚類の耳石は，魚体の成長がすすむにつれ大型になるとともに，しだいに偏平な形になる．大型魚の耳石では，成長する部位は縁辺部に限られ耳石偏平，面の中央部では，耳石成長はほとんど停止しており，日周輪の形成がみられないこのような成，．長率の差をもたらす機構が日周輪の形成にも関与している可能性が十分考えられるすなわち耳．，石の前駆物質であるカルシウムや有機基質の供給率が部位によって異なることは内リンパ液中に，おける，これらの物質の分布に何らかの濃度勾配があることを示唆している本研究においては．，内リンパ液全体のカルシウムおよび耳石有機基質前駆物質の濃度を測定しているがもしこのよう，な濃度勾配が，内リンパ液全体において部分的で小さい範囲のものならば仮にそのような物質の，濃度に日周変化があったとしても，内リンパ液全体の濃度変化としては測定されないことになる．本研究の手法では，このような濃度勾配の存在を確認することはできないが今後組織化学的な，，手法などにより，これら耳石前駆物質の内リンパ液中における分布や小のう細胞からの分泌活性を詳細に検討することが必要と思われる．. ま. と. め. ティラピア耳石の日周輪形成機構を明らかにするためティラピア血清と小のう内リンパ液の総，カルシウム濃度，および内リンパ液中の可溶性耳石有機基質の日周変化について調べた内リンパ．液と血清のカルシウム濃度は，互いに独立して変化していた内リンパ液の総カルシウム濃度に有．意な日周変化は認められたが，耳石の成長が盛んな時間帯にむしろ低い値を示したまた耳石，．，の成長が常に停止していると思われる絶食群において内リンパ液のカルシウム濃度は給餌群に，，比べ，．有意に低かった．これらのことから血清や内リンパ液のカルシウム濃度によって耳石の，，日周期的成長，すなわち日周輪の形成が支配されている可能性は低いと思われたさらに免疫化．，学的手法により，内リンパ液中に耳石有機基質の前駆体と思われる多くの成分が検出されたことから，小のう細胞が，内リンパ液への耳石有機基質成分の分泌を介して耳石の石灰化に関与してい，る可能性は示唆されたが，内リンパ液中の耳石有機基質成分は個体差が大きく有意な日周変化は，認められなかった．本研究においては，耳石の日周期的成長を調節し日周輪の形成を支配してい，る要因を明らかにすることはできなかったが絶食群において内リンパ液中の耳石有機基質成分に，変化がみられたことから，内リンパ液の耳石有機基質成分が長期的な耳石の石灰化調節に関与している可能性が示唆された．. （１７）.

(11) . ９６. 田中邦明. 引用文献ｉｉｔｅｒｎｓｉｌｅｎｃｅｉｌｔｈｃａｌｐａｔｓａｎｄｐｅｒｏｄａｙｅｒｓｈｏｔｏｌ．１）Ｐａｎｎｅｌ：Ｄａｉａｙｇｒｏｗｔｈｌ，１７３，１１２４～１１２７，Ｓｃ，Ｇ－，１９７１，Ｆｉ. ｉｌｉｔｈｓｉｉｓｈｏｔｏｔｌａｒｓｔｔｕｒｏｎｏｆｆｉｒｕｃｅａｎｄｃｏｍＰｏｓｅｃｕｃｈ２）Ｄｅｇｅｎｓ，，，ａｎｄ日ａｅｄｒ，１９６９，Ｍｏｌ，Ｔ，，Ｒ，Ｌ，Ｄｅｕｓｅｒ，Ｗ，Ｇ，ＥＢｌ２５ ′ ～１１３Ｍ［ｉ１０ａＦ．．ｏ．，ｉｎｇｏｆｉｉｔｈｓｔｔｕｒｅｏｆｔｈｅｉｌｉｏｎｏｆＡｍｅｒｒｏｔｏｌｌｕｃｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓ３）Ｌｉｔｅｒｍｉｃａｎｅｅｎａｔｅｗ，Ｐ．Ｋ‐Ｌ，Ａｇｅ ‐ ，１９７４，Ａｇｅｄｅ）ｆｉｒｓｒｅｙｓｈ（Ｂａｇｅｎａｌ．，Ｓｕｒ，１２４～１３６．，ＵｎｗｉｎＢｒｏｔｈｅ，Ｔ．Ｂ．ｅｄｓｌｉｔｈｌｉｉｌｔｈＮ１９８ｔｔｕｒｔＣｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｏｔｏＷｂＭｄｒｕｃｅｏｆｔｈｅｏｔｏｌＤＧＤｒａｓｔｂｅｒｇｅｒＪ４）Ｄｕｎｋｅａａｅｅａｎａｎ，．，０，Ｔｈｅｕ，．．，．．，・６７～３７７ｈｌ１６３３産ＭＥ〆彰姦ｉすＪｌｉｏｒｏＢのｃ２熔 ” ７２格ｇｐｅｍｕｍｍｉｃｈｏｇ．ｌｎｊｕｖｅｎ．．，，，，ｉｉｌｃｔｏｎｓｏｆｔｈｅｏｒｇａｎｃｒｏｓｃｏｐｅｏｂｓｅｗａｔｅｃｒｏｎｍｉ５）Ｗａｔａｂｅ，１９８２，Ｓｃａｌｍｉｎｇｅ，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．ａｎｄＹａｍａｄａＪ．，Ｎ．ＭＢｉＺＬ）Ｅ万 ‘ 幻物（鑑定Ｊｏ ” す（Ｌ）ｄｘａｒ庇解れ α ｉｈＦ〆謬ゆｌｔｆｓ ““ ｉ熔．ａｎｔｈｏｆｔｈｅｔｅ硲〆り ‐ ｅｏｓ．．ｌｎｔｈｅｏｔｏｌ．， ‐ ｐｍａｔｈｘｉ ′～１３４Ｅｃｏｌ．．，５８，１２７. ６）前掲書，文献１）．ｉｌｒｅｃｏｒｄｓｉｌｇｒｏｗｔｈｏｆａｑｕａｔｌｉｔａｓｍｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｔｔａｅｃｏｒｇａｎｌｔｅｍｓｉｎｆｅｓｈｓａｇｉ７）Ｐａｎｎｅｌａ，Ｓｋｅ，Ｇｒｏｗｔｈｐａｔ，Ｇ．，１９８０）ｉｌｃｈａｎｇｅ（ＲｈｏａｄｓｓｅｎｕｍＰｒｅｓｒｏｎｍｅｎｔａ．ｏｆｅｎｖ．，ＮＹ，５１９～５６０，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｐ１，Ｒ．Ａ．ｅｄｓ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄＬｕｔｚｉｌｒｈｙｔｈｍｉｔｈＭ．１９８１，ＤｉｕｍａＳｈｉｍｉＤＧｄｏｔｏｌＭＤｋｌｂｎＷＮＤｊｚＹｂｉａｎｕｔ８）Ｍｕｇｒｒｎｅｅｅｕｅａｎａａｅｇｙａ．．，，．，．．，，，，，，，６２９ ′ ～６ｉｌ６８Ａ６５ｆｉｄｆｆｉｏｃｈｅｎｌｓｈ ”ｓα”“のｚ熔ｎａｔｎｔｈｅｇｏｌｏｒＩｏｎｉ．．Ｐｈｙｓｏ‐ ，，．Ｂｉ，Ｃαれ薦ｓ，ＣｏｍＰ. ９）前掲書，文献８）．）前掲書，文献４）１０ ‐. ｉｌｂｕｍｉｔｆｉｏｎｉｎｔｈｅｉｌｌｎｆｒａｃｌｉｆｉｉｏｎｉｉｙａ）Ｍｕｇ－ｍ，ＳｅａｓｏｎａｌｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆａＰｒｅａ１１ ‐ ｓｈｎｆｓｈａｎｄｓｈｅｃｃａｔ，Ｙ－，１９６４，ＣａＳｏｃｈｅｏｔｏｌｉＢｌＩｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｔｈＪｐｎｉｄｆｄｉｈｎｔｕｉｔｅｌｉｌｄｏｆｓｏｍｅｆａｅｚｏｎｎｏｔｅｅｒｏｏｏｕｔｈｆｃｏｒｒｅｓｏｎｓｈｑｐｐ．．ｏｔｏｕｉｐｇ，，０ノＹ６７３９５５９ＦｉｈＳｃｉｓ．． ‐ ，，ｉｌｔｅｍｓｏｆｔｈｅｔｔｉｌｌｆｉｔｕｄｙｏｎｐａＰｅｒｅｃｐａｔｌｉｆｉｉｏｎｉｎｆｒｏｐｈｏｒｅｉｙａｅｃ）Ｍｕｇ ‐Ｖ．Ａｓ１２ ‐ ｓｈｓｈａｎｄｓｈｅｃｃａｔ，Ｙ．，１９６６，ＣａＳｃｉｉｈＢＩＬｆｆｌｉｈｆｌｉｄｊｉｌｉｈｉｉｖｅｍａｔｕｐｎｌｉｄｅｓａｎｄＰＡＳ‐ ｉｄｍｕｃｏｐｏｔｅｒａｓｎｔｅｏｔｏｔｕｏｓｏｍｅｓ，．Ｓｏｃ．．ａｃｐｏｓｙｓａｃｃｈａｒ３２ ′ ～２９Ｆｉｓｈ．，，１１７１．. １３）前掲書，文献２）．１４）前掲書，文献４）．. ｉｌｉｉｔｈａｎｄｉｍｉｆＶｎｔｔｗｅｅｎｔｈｅｏｔｏｌｉｔｏｃｈｅｍｉｆｉｌｌｌｉｉｉｏｎｉｎｆａｒｅｓｂｅｉｙａｓｃａｌｓ１５）Ｍｕｇ－ｓｈａｎｄｓｈｅ ‐ ｓｈｃｃａｔ．Ｈｉ，１９６８，Ｃａ，Ｙ．ｉｈｆｏｒｍａｔｌｉｏｎｏｆｆｉｆｈｉｌｔｔｉｉｈｔｔｓｈｌｔｉｏｌｅｒｅｎｃｅｏｅｏｗｓｅｃａｒｅｅｒａｎｂｏｗｔｒｏｕｔｔｈｅｍａｃｕｕｓｉｎｊｕｖｅｎｉｐａｒｅｇｏｎｏｆｓａｃｃｕｌ，，ｌＳｃｉＢｕｌＳｏｃＪｐｎｓｈ‐ ．．．．．Ｆｉ，３４，１０９６～１１０６. ））前掲書，文献１２１６．. ｉｄｌｉｆｔｔｕｄｙ，ｏｎｔｈｅａｃｉｔｉｌｌ．ｉｆｉｉｅｃｃｓｉｓリー９６４，Ｃａｒｏｐｈｏｒｅ）Ｋｏｂａｙａｓ１７ ‐ ｓｈ．ＬＡｐａｐｅｒｅｓｈａｎｄｓｈｅｃｃａｔｏｎｉｎｆｉＢｌｌｉｌｌＪｌｉｌｆｌｉｆｈｌｄｎｉｉｉｌｎｓｓｕｔｔｓｃｅｃｅｔｔｄｄＰＡＳｎｓｏｍｅｍｏｕａｐｌｈｉａａａｕｓｏｅｅｘｒｐｏｓｖｅｍａｅｒａ … Ｐ ‐ ．ｍｕｃｏｐｏｙｓａｃｃａｒｅｓａｎＰ，ＳｃｉＳｏｃｓｈつ３０，８９３～９０７．，．Ｆｉ. ０，ロケット免疫電気泳動法，電気泳動法のすべて，医歯薬出版株式会社，）藤巻道男・加藤正俊・総荘和子，１９８１８１３４ ′～１３８．. ）３９～１４３９８０１９）河合式子・河合忠，１．，１，交差免疫電気泳動法，前掲書，文献１８２）２０）前掲書，文献１．２）２１）前掲書，文献１ ‐. ｉｌｙｇｒｏｗｔｈｐａｔｉｉｎｇｏｎｄａｔｆｅｃｅｒｎｓｉｎｔｏｐｅｒｔｓｏｆＰｈｏｉｙａＪｏｄａｎｄｆｅｅｄ２２）Ｔａｎａｋａ．，，１９８１，Ｅｆ，Ｋ‐ ，Ｍｕｇ，Ｙ．ａｎｄＹａｍａｄａ９９～４６６ＢｌｌＳ７４５Ｕｉｌｌｉｔｈｓｏｆｊｕｖｅｎｓｈｕｅで勧め彰 “効力節，Ｆｉｏｔｏ．．． ‐．，，. ２３）前掲書，文献８） ‐. ｉｕｍｃｏｎｃｅｎ‐ ｌｉｕｍａｎｄｍａｇｎｅｓｆｆｌｌｉ．ｉｉｉｏｎｉｉｎｃａｃｉ２４）Ｍｕｇ ‐ ｎｆｓｈａｎｄｓｈｅｓｈｙ，ｃｃａｔｙａ．Ｓｅａｓｏｎａｌｃｈａｎｇｅｉ，Ｙつ１９６６，Ｃａｌｉｌｉｉｏｎｏｆｔｈｅｆｔｏｔｈｉｔｈｓｐｅｃｉｉｌｕｉｄｉｒｏｉｏｎｓｏｆｔｈｅｏｔｏｌｔｈｆｅｒｅｎｃｅｔｏｔｈｅｚｏｎｅｆｏｒｍａｔｔａｌｒｅｎｓｏｍｅｆｓｈ．ｒａｔ，Ｂｕｌ，ｗｉｉＪｐｎｓｈ． ‐ Ｆｉ．．Ｓｏｃ．Ｓｃ，３２，５４９～５５７ｌｉｏｎｔｏｉｉｔｈｌｉｌｉｕｍａｎｄｔｈｅｏｔｏｌａｔＹｔｈｅｃｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｒｅｉｈＳｄｄｔｔｕｒｅｏｆｓａｃｃｕ２５）ＳａＪｔｔｏ，．ａｎａｒｅｐｒａｓｒｕｃａｍａａ ‐ ，，Ｕ１Ａ肌ＺＳ１３）ｉｈｌｉｒｆＴｌｉＣｄ効声欄／）０ｉｔｃｒりｓｃｏｃｈｉＴｉｌｉ（ｅｍ“ ｓ粥ｌｉｈｅｃａｃ硲ｅｅｏｓ：ｗｔｔｔだ飾粥ｏａｏｎａＰ，ｏｏ，．．．．，０８（ｇｒｏ，２２３ ′～２３８．. ８）（１.

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