九 州 女 子 大 学 紀 要 第51巻2号
酵母の早期灘集詑捧性
(
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)
に関する輔究
-PYF
生成菌及び抑制菌の調査一
山 下 博 、 岡 添 由 季 、 j説 明 日 香
古 庄 由 佳 、 室 井 史 織 、 岡 田 啓 介 ヘ 若 滞 誠 帥 九州女子大学家政学部栄養学科、北九州市八幡西区自由ヶ丘1-1(〒807-8586) 121 事アサヒピール株式会社研究生産本部酒類技術研究所、茨城県守谷市緑1-1-21(〒302-0106) 日アサヒビールモルト株式会社品質保証部、滋賀県野例市三上2311(〒520-2323) (2014年11月13日受付、 2014年12月18日受理)要 旨
PYF
現象を起こす原因となる微生物類の選別、及ぴPYF
因子を分解する微生物類の選別に ついて、各々のスクリーニング法を立ち上げ調査した岳その結果、PYF
因子生合成微生物と して活性を持つ4
株を、またPYF
因子作用抑制作用を示す3
株を選別することができた。PYF
生 合 成 株 の 内 、 強 い 活 性 を 示 す2
株 に つ い て 同 定 し た 結 果 、 各 々 を 徽1-3
Asperg羽田 thubingensis、機1-6 : Pyrenophoro射的;-陀1pen出と推定した.徹1-3株 が生成する酵母緩集因子は、PYF
麦芽からの緩集因子とほぼ同じ高分子酸性多糖成分である ことを確認した。 また、PYF
現象費抑制する株の内、活性の強い2
株について同定した結果、撤1-8 Rizop田 oryzae、機G3
-1
:
Aspergill田d
α
ba加sであるととが判った。 徹 1-8による抑制作用は、菌体外に生成するG
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が発酵工程中にデンプン質に 作用し生成してくるグルコースによって欝母の増殖がPYF
の凝集に勝り、あたかも緩集作用 を抑制jしたかのような現象を呈する結果によることが判った。一方で、 G3-1株の場合 は、培養液中に生産される菌体外酵素がPYF
因子に作用して酵母凝集作用を抑制していると 推察されるが‘吏に精製を進めて実態を調べ、酵素の性質を鳴らかにする予定であるa 本酵 素については、PYF
因子の媛集コア構造の解明にも活用できるものと期待できる司 緒 言PYF (
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:
酵母の熟成前の早期凝集沈降現象〉とは、アル コールの発酵仁程中において酵母の資化可能な糖成分がまだ残っているにもかかわらず、静 母が凝集・沈降してしまい、その結果発酵が停滞してしまう現象である九 私たちは、既にPYF
を引き起こす成分について異なる年度・地域で発生した麦芽から精製 しその性質を調べた結果から、高分7
ーの酸性多糖 (800KDa，500KDa，300KDaなど}であ ることを報告した"。このような成分がどのようにして生産されるかについては、過去にお いてPYF
の事故が発生した際の経験(天候不服"搬など微生物の付着4.-6)、穀皮の洗浄によ酵母の早期凝集沈降性 (PYF)に関する研究 122 -PYF生成菌及び抑制菌の調査一 (山下・田添・原・古庄・室井・岡田・若浦) る抑制効果7)など)から、大麦に付着したある種の微生物がPYFを発生させているものと推察 し、 PYF因子生成微生物の調査をスタートさせた。調査にあたっては、まずPYF麦芽からの 微生物類の単離、その他環境に存在する微生物類の蒐集、続いてPYF因子生成能を持つ微生 物のスクリーニング系の確立と選別、そして生成能を示す微生物の同定、生産されたPYF因 子の性質調査について進めることとした。 また、一方で発酵生産の立場からはPYF現象を抑制する手法の樹立が重要課題であること から、 PYF因子の抑制法についても併せて行うこととした。 いずれも、 PYF因子の詳細(機能の発現に必須の基本コア構造)に迫るに不可欠なところ であると考えられる。 実験材料及び方法
1
.
材料カナダ産PYF麦芽及び国内産PYF麦芽を材料として、微生物の単離を行い、 PYF因子生 成能或いは分解能を示す微生物類のスクリーニングを行った。また、野洲製麦工場の製造 ラインから単離された微生物類、或いは環境微生物などから単離した微生物類もその対照 としてスクリーニングを行った。 2.方法 ( 1 )微生物の分離法 分離培韮 聞の分離 MaltAgar-(ク口ラムフェニコーJL'-s{)pprn霊j目的 単 離 :Potate D extf"伺e Agaf"
25~ パヲテリア町分離 Stan dard A gaf" 希 釈 平 桓 法(0圃1耐震面塗布〉 ヨiO~ (2) PYF因子生成能を示す微生物の選別 本選別には、液体振渥培養法(図.1)に準じて行った。 図1.スクリーニング用液体振渥培養法
九 州 女 子 大 学 紀 要 第51巻2号 123 (3) PYF因子抑制能を示す微生物の選別 選別法としては、基質をオートクレーブ処理により無菌化したPYF麦芽を用い最少培 地の条件でPYF因子生成確認試験法に準じて行い、継時的にサンプリングを行って得ら れてくる培養液中のPYF因子の活性状況から抑制・分解能の有無を判断する方法で実施 した(図
.
2
)
。
最歩培地 分離菌接種 ;tJtートクレーヲ処理 2S"C、48hrx 1l0rpm回転振彊 培養漕過渡↓馴
殿
65% py同苦性自;IJ定用発酵試験 図2.分離菌株のPYF抑制能試験法 (4) PYF分解酵素の活性測定法PYF分解酵素の活性測定は、 PYF麦芽抽出液 (PYF麦 芽 / 水 =1 : 3) 5mlに酵素液
1mlを加え、 250 C・24時間反応後、 12mlのエタノールを加えて沈殿物を遠心して集め た。沈殿物を減圧乾固した後、 0.5"'1mlの熱水に可溶化後内300"'400μlを発酵試験に 供した。尚、対照としては酵素液を予め加熱処理 (1000 C・10min)したものを用いて 同処理を施したものとした。 (5) PYF活性確認発酵試験法 PYF活性確認試験法は3mlの光学セルを用いた発酵試験により実施した。 無菌化処理した光学セルに、発酵
C02
ガス分離剤として多孔性沸石(ケミカルストー ン、関谷理科脚)6粒を置き、 Brix13%にグルコースで補糖したコングレス麦汁3ml、 PYF因子成分100"'300μlを加えた後、標準酵母SMA(独VLB)をユニバーサル増殖法 で調製した培養酵母を初発酵母数約10X106cells/mlとなるように加え、 250 Cの恒温下 にて発酵を行い継時的に600nmの吸光度を測定することで酵母の凝集性を追跡調査し た。 (6 )各菌株の同定法 PYF生成能或いは抑制能を持つ徽・バクテリアについては、それぞれに適したDNA抽 出法 (Prepman.Ultra.Extractor-Plant Genome)を用い、 26S(LrRNAF及びLrRNA Tag)のプライマーを使ってPCR(反応時間:94t 2.5分、 940 C 30秒、 570 C 30秒後、 72t 1分、 720 C 3分、 40 C∞
を30サイクル)後、電気泳動にてシングルバンドである酵母の早期凝集沈降性 (PYF)に関する研究
124 -PYF生成菌及び抑制菌の調査一 (山下・田添・原・古庄・室井・岡田・若浦)
ことを確認した。シークエンスはDTCS Quik Start Master Mix、26SRTag(LrRNA RTag)を用い、反応温度 (960
C 20秒、 480
C 20秒、 600
C 4分を30サイクル)下で行 い、塩基配列解析はCEQ8000Genetic Analysisを用いて実施、 BRAST(ブラスト) 検索により同定した。 結 果 1.微生物の分離株 2種類のPYF麦芽、製麦工程中更には環境より分離した株は、総数
1
7
0
株であり、それぞ れの内訳は以下の通りである。 01. PVF麦 芽 力ナヲ産麦芽 50株 福島産麦芽 43株 b.麦芽製造工場 アザヒピーJ[，モ1レト野淵工場畠宝工程 45梓 C.環 境 PVF精事国査車壇 32株 2. PYF因子生成能或いは抑制能を示す微生物の選別 ( 1 )選別菌株 カナダ産及び国内産PYF麦芽より単離された株93株、麦芽製造工場の工程ラインから 単離された45株、環境分離株32株、計1
7
0
株を使って、 PYF因子生成能を示すものとし て1
0
株 (PYF麦芽由来3株、製麦工程由来5株、環境由来2株)及び同抑制能を示す1
0
株 (PYF麦芽由来4株、製麦工程由来6株)を得た。繰り返し活性測定を行い強い活性を示 す株として生成菌4株と分解菌3株を選別した。 表 1.PYF因子の生成・分解能を持つ菌株の選別 合成能を持つ株 分解能を持つ株 徽1-3
徽1
ー8
徽1-6
徽G3-1
バクテリア ZB バクテリアW2-15
バクテリアSW
当該微生物の内、発酵試験の一例を図.3に示す。対照(菌の接種なし)と比較して、 PYF生成微生物である徽1-3を接種した発酵反応では酵母が発酵のピークを迎える前 に凝集(早期凝集)していることが濁度OD600nmの値の減少傾向から確認でき、一方 PYF抑制微生物である徽1-8の場合は、酵母が凝集することなく分散して増殖傾向が 続いていることが観察された。21> 2 ~ 11> 0 Cコ 1 <D Q 001>
。
(2)菌株の同定 九 州 女 子 大 学 紀 要 第51巻 2号 125 P Y F活李副I.JA' PYF抑 制 菌 ( 簡1-8) PYF生 成 菌 ( 輯 1-3) o 2 4 68Un214161ffi田22~æ8 要望馨率五量庄野司 (11寺￨剖) 図3.発酵工程中におけるPYF生成・抑制反応 PYF因子を生産する徽であると推定した中で、比較的活性の強い徽1-3、1-6を選んで 同定を試みた。徽1-3はDNA
の抽出が困難であることから、M
昭E
甜 配t
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Genome
一(TOYOBO)を、また徽1-6の場合は通常使用される
Prepman U
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を使用した。PCR
及びシーケンスには2
節の方法 で述べた手法に従って実施した。 徽1-3の塩基配列を以下に示す。 CCGNGTGCGTGCCGAGGTCAGTCTTAGAACATGCATTATATCGCATGACTGCCATGACCGTAACGCGTTCCTCGGTCCAGGCTGGCCGCATTGCACCCCT GGCTATAAGGTACCCCGGAGGGTACTACATTCCAGGGGCCTTTGAACCGGCCGCCCAAACCGACGCTGGCCCGCCCACGGGGAAGTACACCGGCACGAAT GCCGGCTGAACCCCGCGGGCGAGTCTGGTCGCAAGCGCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTTAACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCGA TCACTCTACTTGTGCGCTATCGGTCTCCGGCCAGTATTTAGCTTTAGATGAAATTTACCACCCATTTAGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCGA AGGAGCTTTACACGGGCACGGACACCCCGCCCAAGACGGGATTCTCACCCTCTCTGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACGGGGGCCGCACCCAAAGCA TCCTCTGCAAATTACAATGCGGACTCCGAAGGAGCCAGCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGATGCATTCCCGGTTGGTTTCT TTTCTCCGCTTATTAATGGCCAAA 同様に微1-6 GCGGCAGCAGGCGAGCCTCTTACCACACCCTATCTACGTCTCGATTATGTCAAGACTAAATGCGCGGACCTCAGTCCAGGCTGGTGGTATGTCGTCTCCC CTATAAGGCCTCCCCGAAGAGAGGTACGTGACAGAGACCTTTATCCCACCGCCCAAACTGATGCTGGCCTGCCTGCAGAAGAATGCACCGGGCACAAGGG CCCGGGTGAGCAACTGCAAGCAAGTCTGGCTGCAAGCGCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTTGACTCTCTTTCCAAAGTGCTTTTCATCTTTCG ATCACTCTACTTGTGCGCTATCGGTCTCTGGCCAGTATTTAGCTTTAGAAGAAATTTACCTCCCATTTAGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCG AAGGGGCTTTACACGGCAATAGCTAGCGACCACGTACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTCCTGTTCCAAGGAACTTGGACCGCTGCCAAAGCCAAAGCG CCCTCTGCAAATTACAACTCGGACTCTAAAAGAGCCAGATTTCAAATATGAGCTGTCTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAGGGCAATCGCTGTTGGTTTC TTTTTCTCCGCTTATGAAAAGNNNNN酵母の早期凝集沈降性 (PYF) に関する研究 126 -PYF生成菌及び抑制菌の調査一 (山下・田添・原・古庄・室井・岡田・若浦) これらの情報をもとに同定を行った結果、徹 1-3はAspergillus属の徽で、 Aspergillus thubingensisと推定された。 また、徽1-6はPyrenophora属またはその近縁種であり、均陀四ophoratritici-r匂，pentis と推定された。 同様に、 PYF抑制株の中から活性の強い徽 1-8及びG3-1株について同定を行った 結果、各々Rizo戸lSoryzae、Aspergillusclabatusであると推定された。 (3) PYF合 成 微 生 物 徹 1-3による酵母凝集因子の性質 PYF因子生成能試験法に準じ培養した培養上清を、オートクレーブ殺菌し不溶化物を 遠心除去後、エタノール60%飽和として沈殿物を集めた。沈殿物を 50mM Tris緩衝液 (pH8.5、50mM )に溶解後、 DEAEカラムにかけ同緩衝液の O"-'lMNaClのリニアー グラジエント法により分画を行った。その結果、 PYF麦芽からのPYF因子の精製の時と 同様、塩濃度0.3"-'O.4Mの聞に溶出されてくる糖質成分を含む画分に酵母擬集活性が確 認できた。このことから徽 1-3の酵母凝集成分はPYF麦芽からの酸性多糖成分PYF因 子2)と同様の組成を持つものと判断した。 (4) PYF抑 制 菌 徽 1-8による PYF活性の抑制反応 徹 1-8が、 PYFを抑制している傾向が確認されたが、図 3に示す様に対照に比べて PYF活性を抑制しているだけでなく、更に酵母増殖による濁度の上昇が観察されたこと から、その詳細について反応経過を追って調査した。 その結果、表2に示す様に培養上清中にグルコース含量の増加が観察された。更に、反 応上清からエタノール沈殿法を使ってPYF因子を分別した結果、 PYF因子は含有量の変 化なく存在していることが確認できた。これらのことから、 PYF抑制の現象は、 PYF因 子に徽 1-8株が直接アタックしているわけではなく、本株がグルコアミラーゼを菌体外 に多量分泌することで発酵試験液中にグルコースを生成することにより、酵母の増殖が活 性化されて酵母凝集に勝る結果、抑制しているが知くの現象に至ったものであることを示 唆している。この確認のため、発酵試験中にグルコースを補糖した結果、 PYF因子の有 無に関係なく酵母の活発な増殖が起こり凝集現象が観察されないことが判った。 表2.培 養 液 上 清 の 糖 組 成 分 析 値 m g/ml 対照
￨
徽1-8 フルクトース 4.171 5.58 グルコース 9.091 20.34 マルトース 30.84 30.81 マルトトリオース 9.6日 249 マルトデトラオース 3.511 1.95 マルトペンタオース 1.021 2.25 マルトヘキサオース 0.691 1.59 デキス卜リン 12.781 6.24主語
一一一一一一一一一一
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6"T
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-127 第
5
1
巻2
号 要 紀 学 大 子 女 州 九 PYF生成・抑制酵素類による反応試験 3. (1) PYF生成菌の菌体外粗酵素液によるPYF生合成反応 PYF生成菌の一つである徹1-3
を、無菌大麦を培地とした振壷培養により得られる を行い、その上清に冷エタノールを 培養液を漉過・遠心分離 (8，OOOrpmX10min)
60%飽和度となるように加え不溶化する沈殿物を遠沈して集め、少量の蒸留水に溶かし たものを粗酵素液とした。 PYF生成反応系の微生物接種に替えてこの粗酵素液を添加し、菌のスクリーニング時 エタノール沈殿として反応 と同様の条件で反応させ、継時的に一定量をサンプリング、 液に含まれるPYF因子の量を発酵試験法で確認した。図.4に発酵試験の結果を示す。無 添加の対照に比べ明らかに接触反応によりPYF活性が確認できてはいるが、反応経過と の定量性は認められていない。今後は、更に高生産能を示す菌或いは条件設定を行い、 至適条件下でのPYF生成酵素類について精製を進める予定である。 o Z 4 6 8 W U ~ ~ ~ a II 発信経遣担割問 (時間) 図4.徹1-3
粗酵素液によるPYF生成活性 25 L5 Q5 E E 。 。 匂 口 O(
2
)
PYF抑制菌G3-1
株粗酵素液によるPYF分解反応CM
-Sephadex
徽G3-1
株をPYF麦芽を基質として得られる培養液について、 麦汁液 (3倍抽出 を基質として24時間250C
のもとで反応を行った。徽1-8
で観察されたグルコアミ ラーゼ等の作用を加熱処理(
1
0
5
"C、10
分)により失活させた後、 C-25によるパッチワイズ法で濃縮した粗酵素液画分を使って、 PYF 液) エタノールを2倍量 添加して PYF成分を遠沈して集め、減圧乾燥後 0.5~lml の熱水で溶解、その 300 .-v400 μlを発酵試験に供してPYFの状況を調査した。 としては、粗酵素液画分を予め (Bl) 発酵試験結果を図5
に示す。尚、酵素ブランク100
"C1
0
分の加熱処理を行ったものを発酵試験に供したものである。G3-1
株の菌体外粗酵素液中にはPYF因子に作用して凝集性 図5
に示される如く、酵母の早期凝集沈降性
(
P
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)
に関する研究-PYF
生成菌及び抑制菌の調査一 (山下・田添・原・古庄・室井・岡田・若浦) 128 を失わせる作用をもっ酵素が含まれていることを覗わせている。 C1V[ll}il.着・Bl-・
-CJ.lJl'!且着画分 ...非'1l.着・Bl 非吸着画分 2.5 5 1S
M
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口 O 0.5 0 02 4681也21416182也l'24!6!Sl侶lB4lffi8!O 妥議線量昼時事司 (時間) 4T鰐髭豪殺E輔 鯉5主 pγF分解菌類 PfF麦芽/培養議波(24時間l
CM録瓜弱ll(Ji，ツチ法)1
1
M
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副 Et01ppt↓
透析函分 ，.11醇泰濠として湖生温度 図5. G3-1株培養液のCM抽出組酵素液のPYF分解活性(
3
)
PYF
因子分解酵素の精製 カラムクロマトグラフィー a CM Sephadex C-25 (pH5.6、25mM酢酸緩衝液) に於いて得られる粗酵素液をCMカラムクロマト (2) により分画を行った。図6に示す様に、 NaCl濃度0.7 M付近で溶出される画分(フラク ション No.95~100) に PYF 因子分解酵素が溶出されてくることが判った。活性状況を 図7に示す。-
圃
'
・OD2
15.
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旬
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.... 酔・OD280••••••
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1.4 0.2 O H 守 hS222 R R R Z Z伝写g写2自由EEz E R史巨匠SEEazEs E E Eロ目 2Rz REn rl rl rl rl rl rl rl rl rl rl rl rl Fraction NO.(8gftube) 0.88
0
6
0.4 1.6 1.22.5
ε
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1
0.5 o 九 州 女 子 大 学 紀 要 第51巻 2号 ー←非吸着 ___Fr.33 ・喧~Fr .45 ・今e・・Fr.53 ・酬ーFr.59・
・
_Fr.63 ・・炉・Fr.67 -Fr.71 -ーー-Fr.75 -司'・Fr.81 ・4酔・Fr白9 ・司~Fr.95 -・・・Fr.l01 ーやーFr.l11 o 10 12 14 16 18 20 222426 28 Fr.l1 9 発 酵 経 過 (時間町} 図7.PYF
分解酵素各画分の分解活性 b. Hydroxyapatiteカラムクロマトグラフィー1
2
9
CMカラムクロマトにより得られた活性画分を透析後、 pH6.8、25mMリン酸緩衝 液にて平衡化したハイドロキシアパタイトカラムにかけ、硫酸アンモニウム 0""1 Mの 濃度勾配の条件で溶出させた。図8
にその際の溶出パターンと、図9
にPYF
分解活性 測定結果を示す。フラクッションN
O
.
2
3
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"
2
9
の画分にPYF
分解活性が確認できたが、 未だ精製までに至っていない。 0.06 0.05 0.04 0.03 8 002 0.01。
.... 回・OD215・
4ト・OD280 - 硫安濃度 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Fraction No.(8g/tube)図8
.
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カラムクロマトグラフィ-酵母の早期凝集沈降性 (PYF)に関する研究 -PYF生成菌及び抑制菌の調査一 (山下・田添・原・古庄・室井・岡田・若浦) 130 ... 宇・Fr.12 ー吟持ーFr.17
『
・
-Fr.19 ーーーーFr.23 ーーーーFr.25 『・ーFr.27 -1・ーFr.7 『金ーFr.9 2.5 2 1.5 1 0.5 E E O O @ Q O 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 日 6 4 2 o。
発 酵 経 過 〈 時 間 図9. PYF分解酵素各画分の分解活性 更に精製を進め、本酵素の性質からPYFのコア構造の解明へと進める予定である。察
考
PYF現象を全体的に解明することを目的に検討を進めている。本報では、その中でPYF現 これまで検討してきた結果につ 象を引き起こす微生物或いは抑制を示す微生物類について、 いて完結には至つてないが、纏める乙とにした。まず、 PYF因子の生合成を行う微生物につ いては、可能性として最短距離にあるPYF麦芽から単離した微生物中2種の徽が比較的強い これら2株については26SrDNAの塩基配 PYF合成能を有していることが明らかとなった。 列の解析より、徹1-3はAsp
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、徽1-6をPy
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と カビ毒の代表的なもので して同定した。徹1-3は、その近縁種としてA.o
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があり、 また、徹l あるオクラトキシンとの関係に於いて、安全性の面からも興味深い存在である。 -6についても検索した結果、 bar1eynet-spot blotch desease agentで大麦網斑病を発症さ せる原因菌と近縁種であることが判っている。いずれも病原性を有する徽である。 このような微生物凝集機能を持つ高分子の多糖類としては、 一般的に病原性の ところで、 微生物が栄養源となる基質に付着し、環境変化や外敵から内部の菌叢を守るバリアーや運搬 経路としての機能確保などに関連した細胞外多糖 (EPS:ExtracellularPolysaccharide)い これを生産する微生物がい わゆるバイオフィルムを形成することが知られている8-13)。 これらの共通点、即ちPYF因子が高分子酸性多糖であること、九 州 女 子 大 学 紀 要 第51巻2号 131 ずれも病原性に関連する徹類であるとと、以上を考え合わせると、パイオフィルムとの関連 性が緩めて高いものであると推察される。
PYF
生合成系に関しでは、これらの点からも検討を進めることが必要である。 吉て、PYF
抑制面については、この度PYF麦芽を基質としたスクリーニング法を立ち上げ 検討してきたが、抑制菌として選別した徽1-8
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の場合は予想だにしなかっ たGluc叩mylase
によるグルコースの生成が酵母の増殖を活性化する乙とで、PYF
凝集作用 をあたかも抑制したが如くの影響を及ぼすことが判った。醸造界では以前より、発酵不順が 続く状況や発酵酵母の状態が芳しくない状況下では、発酵工程の中期以降に新たに麦汁を添 加する方法(クロイゼン)が採ちれてきた経緯があり、まさにこの現象を今回理論的にも証 明するととになったものと考えている。但し、とのような酵母増殖能を活性化するととでPYF
現象による問題点を解決できるものであるならばも本方法も確かな対処の一方法として 位置付ける意味はあると考えている。 今回、PYF
因子に直接作用して酵母凝集作用を抑制している株G3-1 A甲田宮iIlu
s
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b
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tu5 を得ることができた。まだ、精製途中であるため完全には確定はできていないが、徽1-8
で検出された観察されたGlu∞
amylase
の作用による影響{生成物グルコースのエタノール 沈殿による反応系からの除去、Glucoamylase
の発酵試験中におけるグルコース生成反応を 抑制するための加熱失活処理}を除いた試験系での抑制作用であることは確かであり、PYF
因子の分解はもとよりPYF
の凝集活性コア構造の解析にも活用できるものと期待される。 謝 辞 本研究を遂行するにあたり、共問研究のかたちで多国のご支援賜りましたアサヒビール株 式会社にお礼申し上げます@また、特別研究として本研究課題に対し共に研究を進めてまい りましたが、表示の都合上申し訳ありませんが割愛させていただきました。共同研究者は本 報文表記メンバーの他、ゼミで本研究を担当踊いた高馬早紀氏、戸亀有E
佳氏、松尾街紀氏、 ;宮崎智子氏、 111回淳美氏、 I[J手優氏の皆さまに深謝申し上げます。参考文献
1.
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