イソプレノイド生合成におけるプレニル鎖延長酵素の触媒機能発現機構

イソプレノイド生合成におけるプレニル鎖延長酵素

の触媒機能発現機構

著者

古山 種俊

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イソプレノイド生合成におけるプレニル鏡延長酵素の

触媒機能発現機構

(12480169)

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∼一､  ･｣ /  L

平成1 2年度∼平成1 4年度 科学研究費補助金【基盤研究(B) (2日

研究成果報告書

平成1 5年4月

研究代表者 古山 種俊

(東北大学多元物賃料学研究所 教授)

′

平成1 2年度∼平成1 4年度 科学研究費補助金

【基盤研究(B) (2) 】

研究成果報告書

は し が き

天然に著しい構造の多様性を示して存在するイソプレノイド化合物の基本骨

格はC5のイソプレン単位の重合体であるが･このイソプレン鎖延長反応は｢プ

レニルトランスフェラーゼ｣と総称される酵素によって触媒される｡プレニル

トランスフェラーゼによるC-C結合形成反応は非常にユニークなものであり､

有機化学的にも例を見ない｡その反応は立体化学的に厳密であり､且つ個々の

酵素は一定のイソプレン鎖延長で正確に鎖延長反応を停止する｡

われわれは主として細菌より1 0種以上のプレニルトランスフェラーゼを見

出し､そのキャラクタリゼ-ションや遺伝子クローニングを行い､プレニルト

ランスフェラーゼの触媒機能とタンパク的性質などによる分類やトランス型鎖

延長酵素によく保存されている7つの領域の触媒作用に関する役割の解明など

を行って来た｡ 1998年､懸案であったシス型鎖延長反応を触媒する酵素では最

初の例となる､ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の遺伝子クローニングに成

功し､シスプレニル鎖(Z型鎖)延長酵素はトランスプレニル鎖(E型鎖)延

長酵素とは全く異なる一次構造を有し､保存領域なども全く新奇なものである

ことを明らかにし､さらにこの酵素の結晶化に成功し､ X線結晶構造解析を進

行させた｡

本研究は上述したわれわれのプレニルトランスフェラーゼに関する研究成果

を土台として､さらに研究を進展させるべく､ X線結晶構造解析と部位特異的

変異導入実験等によるプレニル鎖延長酵素の活性部位の情報を総合して､ ｢プ

レニルトランスフェラーゼ｣の構造と触媒機能発現機構を分子レベルで詳細に

解明することを目的として開始されたものである｡

研究組織

研究代表者:古山 種俊(東北大学多元物質科学研究所 教授)

研究分担者:大谷 典正(山形大学･理学部 講師)

研究分担者:張  元偉(東北大学多元物質科学研究所 助手)

交付決定額(配分額)

(金額単位:千円)

直接経費 亊I

ｨﾆ

N

合計

平成12年度 迭ﾃ 0 迭ﾃ 平成13年度 釘ﾃC 0 釘ﾃC 平成14年度 ﾃC 0 ﾃC 総計 2ﾃs 0 2ﾃs

研究発表

(1)学会誌等

1. M. Nagaki, S･ Sato, Y･ Maki, T･ Nishino, and T･ Koyama

Artificial Substrates for Undecaprenyl Diphosphate Synthase from Micrococcus luteus BIP 26

J. Mol. Calal. B: Enqmatt'C, 9 (1-3) 33-38 (2000)

2. T･ Koyama, Y･ Gotoh, and T･ Nishino

lntersubunit Location or the Active Site or Famesyl Diphosphate Synthase

-Reconstitution of Active Enzymes by Hybrid-type Heteromeric Diners of

Site-Directed Mutants

B1-ochelm'stry, 39 (2) 463-469 (2000)

M･ N喝aki, A･ Takaya, Y･ Maki, J･ Ishibashi, Y･ Kato, T･ Nishino, and T･ Koyama

one-pot syntheses of the Sex Pheromone Homologs or a Codling Moth,

Laspeyresia promonella L I

J. Mol. Calal. B.･ Enqmatt'C, 10 (5) 517-522 (2000)

4. Y.-W. Zhang, Y. Kharel, and T. Koyama

overexpression, Purification, and Characterization of Selenomethionyl

Farnesyl Diphosphate Synthase of BacilhJS StearOlhermophfhJS J. Mo/. Cala/. B: Enqmatt'C, 10 (6) 623-630 (2000)

5. K. Hirooka, S. Ohnuma, A. Koike-Takeshita, T･ Koyama, and T･ Nishino Mechanism of Product Chain Length Detemination fわr Heptaprenyl

Diphosphate Synthase from Bact'/Ius slearolhermopht'lus

EIJr. J. Biochem., 267 (14) 4520-4528 (2000)

6. Y.-W. Zhang, X.-Y. Li, andT. Koyama

of Medium-Chain (E)-Prenyl Diphosphate Synthase are Involved in the product Chain Length Detemination

Btlochetm'stry, 39 (41 ) 12717-12722 (2000)

7. K Fujikura, Y.-W. Zhang, H･ Yoshizaki, TI Nishino, and T･ Koyama

significance ofAsn-77 and Trp-78 in the Catalytic Function of Undecaprenyl

Diphosphate Synthase ofMt'crococcus luleus B-P 26 J. Biochem., 128 (6) 917-922 (2000)

8. M. Nagaki, S･ Sato, Y･ Maki, T･ Nishino, and T･ Koyama

An Artificial Substrate for Undecaprenyl Diphosphate Synthase from Micrococcus luteus B-P 26

Calal. Commun., I (1) 33-35 (2000)

9. N･ Ohya, Y･ Tanaka, R･ Wititsuwannakul, and T･ Koyama

Activity of Rubber Transferase and Rubber Particle Size in Hevea Latex

J. Rubber Research, 3 (4) 214-221 (2000)

10. M. Fujihashi, Y.-W. Zhang, Y. Higuchi, X･-Y･ Li, T･ Koyama, and K･ Miki

crystal Structure of ct･S-Prenyl Chain Elongatlng Enzyme, Undecaprenyl

Diphosphate Synthase

proc. Nall. Acad. Sci., U. S. A., 98 (8) 4337-4342 (2001)

1 1. Y. Kharel, Y.-W. Zhang, M. Fujihashi, K･ Miki, and T･ Koyama

ldentification of Significant Residues for Homoallylic Substrate Binding of

Micrococcus luteus B-P 26 Undecaprenyl Diphosphate Synthase J. Btlol. Chew., 276 (30) 28459-28464 (2001)

12. M･ Nagaki, K･ Kimura, H･ Kimura, Y･ Maki, E･ Goto, T･ Nishino, and T･ Koyama

Artificial Substrates of Medium-Chain Elongation Enzymes, Hexapreny1-and Heptaprenyl Diphosphate Synthases

13. M. Nagaki, H･ Ⅵmamoto, A･ Takahashi, Y Maki, Hshibashi, T･ Nishino, and T. Koyama

substrate Specificityof Thermostable Famesyl Diphosphate Synthasewith

Respect to 4-Alkyl Group Homologs of Isopentenyl Diphosphate

J. Mol. Catal. B: Enqmatic, 17 (2) 81-89 (2002)

14. Y. Maki, M. Komabayashi, Y･ Gotoh, N1 0hya, H･ Hemmi, K･ Hirooka, T･

Nishino, andーT. Koyama

Dramatic Changes in the Substrate Specificities of Prenyltransferases by a

Single Amino Acid Subst血tion

J. Mol. Catal. B: Enqmalic, 19-20, 43 1-436 (2002)

15.槙 雄二､長岐正彦､西野徳三､古山種俊

有機合成におけるイソプレノイド生合成関連酵素:酵素機能改変と炭

素一炭素結合形成ツールとしての有用性と展望

有機合成化学鯵会菰60 (8) 783-793 (2002)

16･ AI Takaya, Y-W･ Zhang, K･Asawatreratanakul, DI Wititsuwannakul, R,

Wititsuwannakul, S. Takahashi, and T. Koyama

clonlng, Expression and Characterization of a Functional CDNA Clone Encoding Geranylgeranyl Diphosphate Synthase ofHevea brast'lienst-s

Biochim. Bt'ophys. Acta., 1625 (2) 214-220 (2003)

17. S. Endo, Y.lW. Zhang, S. Takahashi, and T･ Koyama

IdentificatiOn of Human Dehydrodolichyl Diphosphate Synthase Gene

Biochim. Biopkys. Acla., 1625 (3), 291 -295 (2003)

18. Y. Kharel and T. Koyama

MolecularAnalysis of ct'sIPrenyl Chain Elongating Enzymes

NahJralProducI Reports, 20 (1), ll 111 18 (2003)

Isolation and Expression of Paracoccus denitrljicans Decaprenyl Diphosphate

Synthase Gene for the Production ofUbiqulnOne-10 in E･ colt

Bt'ochem. EngineeringJ., 3733 (1), 1-8 (2003)

20･ M･ Nagaki, K･ Kuwahara, K･ Kimura, J･ Kawakami, Y Miki, S･ Ito, N･ Morita,

T. Nishino, and T. Koyama

Substrate Specificities of Medium-Prenylchain Elongatlng Enzymes, Hexaprenyl-and Heptaprenyl Diphosphate Synthases

J. Mol. Calal., B: Enzymatlc, ln Press

21. K. Fujikura, Y.-W. Zhang, M. Fujihashi, K･ 池ki, and T･ Koyama

Mutational Analysts OfAllylic Substrate Binding Site of Micrococuus luteus

B-P 26 Undecaprenyl Diphosphate Synthase

(2)口頭発表

1.劉 宏涛､張 元偉､鈴木重敏､古山種俊

QCM法によるフアルネシル二リン酸合成酵素の基質認識機能と触媒過程

に関する研究

第3回 生体触媒化学シンポジウム,熱海(2000. I.20-21) 2.張 元偉､李 暁固､古山種俊

I.中鎖プレニル二リン酸合成酵素の部位特異的変異導入解析

第3回 生体触媒化学シンポジウム,熱海(2000. 1.20-21)

3.藤倉慶太郎､張 元偉､槙 雄二､古山種俊

ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の基質結合部位の特定

第3回 生体触媒化学シンポジウム,熱海(2000. 1.20-21) 4. YugeshKharel､張 元偉､古山種俊 Bact･llus stearolhermopht'lus由来フアルネシル二リン酸合成酵素のセレノメ

チオニル変異体の大量生産､精製と性質

第3回 生体触媒化学シンポジウム,熱海(2000. I.20-21)

5.駒林真理子､菊地彰子､坂爪洋､大谷典正､槙 雄二､達見久､西野徳

三､古山種俊

フアルネシル二リン酸合成酵素の機能改変の試み(2)

第3回 生体触媒化学シンポジウム,熱海(2000.1.20-21) 6.張 元偉､古山種俊

中鎖プレニル二リン酸合成酵素の鎖長制御機構

日化第7 8春季年会,船橋(2000.3.28-31)

7.古山種俊､後藤幸生､西野徳三

フアルネシル二リン酸合成酵素のサブユニット二量体会合面に形成され

る活性部位の検証

日化第7 8春季年会,船橋(2000.3.28-31)

8.長岐正彦､山本活人､高谷昭行､槙 雄二､石橋潤史､西野徳三､古山種

俊

耐熱性フアルネシル二リン酸(FPP)合成酵素の人工基質(その5)

日化第7 8春季年会,船橋(2000.3.28-31)

9.長岐正彦､佐藤俊介､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

‥ウンデカプレニル二リン酸(Upp)合成酵素の人工基質(その3) 日化第7 8春季年会,船橋(2000.3.28-31)

10.池田貴穂､石橋潤史､長岐正彦､大谷典正､森田 昇､伊藤俊司､古山種

俊､槙 雄二

フアルネシル二リン酸合成酵素の基質特異性-アリル性基質の3位のメ

チル基の役割について-第1 0回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,仙台(2000.7.19)

ll. Y. Kharel, Y.-W. Zhang, M. Fujihashi, K. Miki, and T. Koyama

ldentification of Significant Residues in the Homoallylic Substrate Binding Site of Undecaprenyl Diphosphate Synthase

第1 0回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,仙台(2000.7.19)

12.長岐正彦､木村康生､木村浩昭､槙雄二､西野徳三､古山種俊

ホモアリル性基質ホモログを用いたE-およびZ-型プレニル基延長酵素の

基質特異性

第1 0回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,仙台(2000.7,19) 13.藤橋雅宏､張元偉､藤倉慶太郎､ Yugesh Kharel､樋口芳樹､李暁園､古

山種俊､三木邦夫

ウンデカプレニル二リン酸合成酵素のⅩ線結晶構造解析

第1 0回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,仙台(2000.7.19)

14.池田貴穂､石橋潤史､長岐正彦､大谷典正､森田 昇､伊藤俊司､古山

種俊､槙 雄二

フアルネシル二リン酸合成酵素の基質特異性 -アリル性基質の3位のメ

チル基の役割

第44回香料･テルペンおよび精油化学に関する討論会,札幌(2000.9. 15-17)

15.長岐正彦､佐藤俊介､高橋あゆみ､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

I.フアルネシル二リン酸合成酵素とウンデカプレニjL,二リン酸合成酵素の

基質特異性

第44回香料･テルペンおよび精油化学に関する討論会,札幌(2000.9. 15-17) 16.張 元偉､李暁園､古山種俊

部位特異的変異導入による中鎖プレニル二リン酸合成酵素の生成物鎖長

制御に重要なアミノ酸残基の同定

化学系7学協会連合東北地方大会,秋田(2000. 9. 30-10.I) 17. YugeshKharel､張 元偉､古山種俊

部位特異的変異導入によるウンデカプレニル二リン酸合成酵素のホモア

リル性基質の結合部位の同定

化学系7学協会連合東北地方大会,秋田(2000. 9. 30-10.1)

18.藤倉慶太郎､張 元偉､古山種俊

ct'S一型プレニル鎖延長酵素のアリル性基質認識部位 化学系7学協会連合東北地方大会,秋田(2000. 9. 30-10.1)

19.高橋あゆみ､長岐正彦､佐藤俊介､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

耐熱性フアルネシル二リン酸(FPP)合成酵素の人工基質(6)

化学系7学協会連合東北地方大会,秋田(2000. 9. 30-10.1)

20.木村康生､長岐正彦､木村浩昭､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

-キサブレニル二リン酸(HexPP)合成酵素の人工酵素 化学系7学協会連合東北地方大会,秋田(2000. 9. 30-10.1)

21.佐藤俊介､長岐正彦､高橋あゆみ､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

ウンデカプレニル二リン酸(Upp)合成酵素の人工基質(4) 化学系7学協会連合東北地方大会,秋田(2000. 9, 30-10.1)

22.木村浩昭､木村康生､槙 雄二､西野徳三､古山種俊､長岐正彦

- -ブタプレニル二リン酸(HepPP)合成酵素の人工基質 化学系7学協会連合東北地方大会,秋田(2000. 9. 30-10.1)

23.合田達哉､宮下芳之､佐藤幹也､大谷典正､藤倉慶太郎､古山種俊､槙 雄

ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の基質特異性(3)

化学系7学協会連合東北地方大会,秋田(2000. 9. 30-10.1)

24. Y. Maki, N. Ohya, M. Komabayashi, H. Henmi, T. Nishino, and T. Koyama Substrate Specificities of a Single Mutations of Tyrosine-81 in FamesyI

Diphosphate Synthase from Bact'llus stearothermophilus

15th FAOBMB Symposium 2000 Perspectives of Biochemistry and Molecular Biology in the 21 Century, Beijing, China (2000. 10. 22-25)

25. K. Fujikura, Y.-W. Zhang, and T. Koyama

Site-directed Mutagenesis of Undecaprenyl Diphosphate Synthase ofMicrococcus luleus B-P 26

15th FAOBMB Symposium 2000 Perspectives or Biochemistry and Molecular

Biology in the 21 Century, Beijing, China (2000. 10. 22125)

26. Y.-W. Zhang, X.-Y. Li, H. Sugawara, and T. Koyama

Medium-Chain (E)-Prenyl Diphosphate Synthase: Structure and Catalytic Mechanism 15th FAOBMB Symposium 2000 Perspectives of Biochemistry and Molecular Biology in the 21 Century, Beijing, China (2000. 10. 22-25)

27. Y. Kharel, Y.-W. Zhang M. Fujihashi, K. Miki, and T. Koyama

Identification of Significant Residues in the Homoallylic Substrate Binding Site or Undecaprenyl Diphosphate Synthase

1 5th FAOBMB Symposium 2000 Perspectives or Biochemistry and Molecular Biology in the 21 Century, Beijing, China (2000. 10. 22-25)

28. Y. Kharel, Y.-W.i Zhang, and T. Koyama

Structure and function of ct'S-prenylchain elongatlng enZyme: Binding site for

homoallylic substrate

lnternational Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2000),

Honolulu, U. S. A. (2000. 12. 14-19)

29. K. Fujikura, Y.-W. Zhang, and T. Koyama

Structure and function of cis-prenylchain elongatlng enZyme: Identification of the

allylic substrate binding slte Or undecaprenyl diphosphate synthase

lntemational ChemicalCongress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2000),

Honolulu, U. S. A. (2000. 12. 14-19)

30. T. Koyama, M. Fujihashi, K. Fujikura, Y.-W. Zhang, X.-Y. Li, andK. Miki

Structure and function of Gis-prenylchain elongatlng enZyme

lnternational Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2000),

Honolulu, U. S. A. (2000. 12. 14-19)

31. N. Ohya, Y. Tanaka, 氏. Wititsuwannakul, Y. Maki, and T. Koyama

Activityofrubber transferase andrubber particle size in Hevea latex

lnternadonal Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2000),

Honolulu, U. S. A. (2000. 12. 14-19)

32. N. Ohya, Y. Tanaka, Y. Maki, and T. Koyama

Structure and biosynthesis mechanism of cis-Polyisoprene in Laclarjus mushrooms lntematiOnal Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2000), Honolulu, u S. A. (2000. 12. 14-19)

33. K. Fujikura, N. Ohya, Y. Tanaka, Y. Maki, and T. Koyama

CompariSon of substrate specificities of FPP synthases from avian liverand Bact']lus stearothermopht'lus

InternatiOnal Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2000),

Honolulu, U. S. A. (2000. 12. 14-19)

34. M. Nagaki, H. Kimura, Y. Maki, T. Nishino, and T. Koyama

Substrate specificities of some prenyl chain elongatlng enZymeS With respect to

3-- alkyl group homologs orisopentenyl diphosphate

lntematiOnal Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2000),

Honolulu, U. S. A. (2000. 12. 14-19)

35. Y. Maki, M. Komabayashi, N. Ohya, H. Hemi, T. Nishino, and T. Koyama

single mutations oftyrosinel81 in famesyldiphosphate synthase from Bact'llus slearothermopht'lus affect the substrate specifi citi es

Intemational Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM 2000),

Honolulu, U. S. A. (2000. 12. 14-19)

36.古山種俊

イソプレノイド生合成におけるシス型プレニル鎖延長酵素の構造解析(特

別講演)

第4回生体触媒化学シンポジウム,仙台(2001. 1. 19)

37. T. Koyama, N. Shimizu, Y.-W. Zhang, K. Ogura, M. Fujihashi, and K. Miki Structure and Function of ct'sIPrenyl Chain Elongatlng Enzymes

TERPNET Bonn 2001: 5th European Symposium on Plant lsoprenoids, Bonn, Gemany (2001. 3. 14-17)

38.古山種俊

Z型プレニル鎖延長酵素の構造と機能解析(依頼講演)

39.長岐正彦､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

-キサブレニルおよび-ブタプレニル二リン酸合成酵素の基質特異性

日化第79春季年会,神戸(2001.3.28-31)

40.長岐正彦､高橋あゆみ､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

耐熱性フアルネシル二リン酸(FPP)合成酵素の人工基質(その7)

日化第79春季年会,神戸(2001.3.28-31) 4ユ. T. Koyama

Stmc山Ⅰ･e and Function or Bacterial Prenyl Chain Elongating Enzymes (hvited)

The Third European-Japanese Bioorganic Conference ･ Rauischholzhausen,

Gemany, (2001. 5. 16)

42. YugeshKharel､張 元偉､藤橋雅宏､三木邦夫､古山種俊

IdentificatiOn of Significant Residues for Homoallylic Substrate Binding of Micrococcus luleus B-P 26 Undecaprenyl Diphosphate Synthase

日本生化学会東北支部第6 7回例会,仙台(2001.6.16-17)

43. T. Koyama

Structure and Function of Z-PrenyI Chain Elomgating Enzymes (Invited)

6th UsIJapan Seminar on Biosynthesis of NaturalProducts "Learnlng nature･s

strategies for making ntural products: pathways, mechanisms, functional genomics, and biosynthetic applications ",Alyeska, USA, (2001. 6. 27)

44.槙 雄二､駒林真理子､後藤吉範､大谷典正､達見 久､広岡和丈､西野

徳三､古山種俊

プレニル二リン酸合成酵素の機能変換の試み

第1 1回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,東京(2001.7.27)

45.長岐正彦､桑原一博､槙 雄二､伊東俊司､森田 昇､西野徳三､古山種

俊

-キサブレニル二リン酸合成酵素の人工基質∼アリル性およびホモアリル

性基質の3-位のメチル基の重要性について∼ (その2) 第1 1回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,東京(2001.7.27)

46.藤倉慶太郎､張 元偉､藤橋雅宏､三木邦夫､古山種俊

ウンデカプレニル二リン酸合成酵素のアリル性基質認識部位の同定

第1 1回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,東京(2001.7.27)

47.藤橋雅宏､張 元偉､古山種俊､三木邦夫

_.ct'S型prenyl鎖延長酵素の反応触媒機構 第1 1回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,東京(2001.7.27)

48.遠藤章太､張 元偉､古山種俊

ヒトのデヒドロドリキル二リン酸合成酵素についての研究

化学系7学協会連合東北地方大会,鶴岡(2001. 9. 29-31) 49.高谷昭行､張 元偉､ KasemAsawatreratanakul､古山種俊

天然ゴムの樹由来ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のcDNAクローニン

グと発現系の構築

化学系7学協会連合東北地方大会,鶴岡(2001.9. 29-31)

50. Kasem Asawatreratanakul､張 元偉､ Rapepun Wititsuwannakul ､古山種俊

cDNA Cloning and Expression of cis-Prenyltransferases from Rubber Tree

(He ve a brasilt'ensis) 化学系7学協会連合東北地方大会,鶴岡(2001. 9. 29-31)

51.桑原一博､長岐正彦､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

ヘキサプレニル二リン酸合成酵素(HexPS)の人工基質(その2) 化学系7学協会連合東北地方大会,鶴岡(2001. 9. 29-31)

52.宮田和彦､長岐正彦､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

耐熱性プアルネシル二リン酸(FPP)合成酵素の人工基質(その7) 化学系7学協会連合東北地方大会,鶴岡(2001.9.29-31)

53.池田貴穂､大谷典正､遠見 久､西野徳三､古山種俊､槙 雄二

変異型フアルネシル二リン酸合成酵素の基質特異性

化学系7学協会連合東北地方大会,鶴岡(2001. 9. 29-31)

54.合田達哉､佐藤幹哉､大谷典正､達見 久､西野徳三､古山種俊､槙 雄

ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の基質特異性(4)

化学系7学協会連合東北地方大会,鶴岡(2001. 9.皇9131)

55.長岐正彦､槙 雄二､森田 昇､伊東俊司､西野徳三､古山種俊

-ブタプレニル二リン酸(HepPP)合成酵素の人工基質(2) 目化第8 0秋季年会,千葉(2001.9.20-23)

56.駒林真理子､後藤吉範､大谷典正､遠見 久､広岡和丈､西野徳三､古山

種俊､槙 雄二

プレニル二リン酸合成酵素の機能変換の試み一変異酵素の基質特異性一

第4 3回天然有機化合物討論会,大阪市(2001. 10.213)

57.長岐正彦､宮田和彦､槙 雄二､伊東俊司､森田 昇､西野徳三､古山種

俊

中鎖プレニル基延長酵素の基質特異性

第4 5回香料･テルペンおよび精油化学に関する討論会,富山(2001･ 10･ 13-15) 58.合田 達､佐藤幹也､大谷典正､張 元偉､古山種俊､槙 雄二

ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の基質アナログの合成と酵素活性

第4 5回香料･テルペンおよび精油化学に関する討論会,富山(2001･ 10･ 13-15) 59.古山種俊

プレニル鎖延長酵素の構造と機能(招待講演)

第7 4回日本生化学会大会,京都(2001. 10.25-28) 60.武田史世､張 元偉､古山種俊

生薬からのウンデカプレニル二リン酸合成酵素の特異的阻害剤の単離と

同定

第7 4回日本生化学会大会,京都(2001. 10.25-28)

61.藤倉慶太郎､張 元偉､藤橋雅宏､三木邦夫､古山種俊

‥部位特異的変異導入によるウンデカプレニル二リン酸合成酵素のアリル

性基質認識部位の同定

第7 4回日本生化学会大会,京都(2001. 10.25-28)

62.藤橋雅宏､張 元偉､古山種俊､三木邦夫

基質結合型ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の構造解析

第7 4回日本生化学会大会,京都(2001. 10.25-28)

63. Y. Kharel, Y.-W. Zhang, M. Fujihashi, K. Miki, and T. Koyama

site-directed mutagenesis of Micrococcus luteus B-P 26 undecaprenyl diphosphate synthase: Insight into the homoallylic substrate binding

第7 4回日本生化学会大会,京都(2001. 10.25-28)

64.池田貴穂､土本美代子､駒林真理子､大谷典正､達見 久､西野徳三､古

山種俊､槙 雄二

異型F PP合成酵素(3) -プレニル基受容部位の知見について-第5回生体触媒化学シンポジウム,岡山(2001. 12. 13-14)

65.長岐正彦､宮田和彦､西野徳三､古山種俊

耐熱性FPP合成酵素によるエポキシアルコールの不斉合成

第5回生体触媒化学シンポジウム,岡山(2001. 12. 13-14) 66. T. Koyama

(2002. 1. 15)

67.小関弘恵知､古山種俊

イソプレノイド化合物の膜間移送に関する研究(1)

日本化学会第81回春季年会,東京(2002.3.26)

68.長岐正彦､宮田和彦､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

耐熱性フアルネシル二リン酸(FPP)合成酵素の人工基質(その8)

_.日本化学会第81回春季年会,東京(2002.3.26) 69.古山種俊

イソプレノイド生合成におけるプレニル鎖延長酵素の分子解析(特別講

演) 第12回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,島根(2002.7.12)

70.槙 雄二､池田貴穂､土本美代子､後藤吉範､大谷典正､長岐正彦､達見 久､

西野徳三､古山種俊

プレニル二リン酸合成酵素の機能変換の試み(2)

第12回ドリコールおよびイソプレノイド研究会例会,島根(2002.7.12)

71. Y. Kharel, Y.-W. Zhang, M. Fjihashi, K. Miki, and T. Koyama

Structure-function relationship of highly conselVed aromatic residues in

undecaprenyl diphosphate synthase

43rd International Conference on the Bioscience of Lipids, Graz, Austria (2002.

9.ll-12)

72. S. Endo, Y.-W. Zhang, S. Takahashi, and T. Koyama

ldentificatiOn of human dehydrodolichyl diphosphate synthase gene  '

43rd IntematiOnal Conference on the Bioscience ofLipids, Graz, Austria (2002.

9.ll-12)

Wititsuwannakul, S. Takahashi, and T. Koyama

lsolation and characterization of geranylgeranyl diphosphate synthase gene from

He vea brast'lt'enst'S

43rd IntematiOnal Conference on the Bioscience of Lipids, Graz, Austria (2002.

9.ll-12)

74.近藤弘章､槙雄二､西野徳三､古山種俊､長岐正彦

フアルネシル二リン酸合成酵素(一ps)の人工基質(ll) -methylgeranyl _. diphosphateの反応性 化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

75.桑原一博､槙雄二､西野徳三､古山種俊､長岐正彦

-キサブレニル二リン酸合成酵素(HexPS)の基質特異性 化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6) 76.寺内大樹､ YugeshKharel､高橋征司､古山種俊 高等植物Arabt-dopst's thalianaにおけるデヒドロドリキル二リン酸合成酵素

の機能解析

化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

77.後藤吉範､佐々木夕紀子､池田貴穂､土本美代子､大谷典正､古山種俊､

西野徳三､長岐正彦､槙 雄二

フアルネシル二リン酸合成酵素の基質特異性一硫黄原子を含む基質アナロ

グ 化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

78.高橋宏和､後藤吉範､中村真也､大谷典正､古山種俊､西野徳三､長岐正

彦､槙 雄二

野生型および変異型ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の基質特異性(4)

化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

79.三浦洋之､小関弘恵知､古山種俊

蛍光基質を用いた小胞体における糖脂質の膜間移動現象解明へのアプロー

チ 化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 516) 80. ⅦgeshKharel､古山種俊 Micrococcus luteus B_P 26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素の保存性芳

香族アミノ酸の役割

化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

81.宮田和彦､槙 雄二､西野徳三､古山種俊､長岐正彦

野生型および機能改変型フアルネシル二リン酸合成酵素(一ps)を利用し

た昆虫フェロモンの開発の試み

化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

82.仲田美乃里､槙 雄二､西野徳三､古山種俊､長岐正彦

野生型および機能改変型フアルネシル二リン酸合成酵(一ps)の人工基質

(9) 化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

83.三木庸平､槙 雄二､西野徳三､古山種俊､長岐正彦

E一型およびZ-型プレニル二リン酸合成酵素の人工基質-homo IPPの反応 性 化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

84.高橋修子､槙 雄二､西野徳三､古山種俊､長岐正彦

ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素(GGPS)の基質特異性

化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

85.佐藤幹也､竹川政範､松本若菜､大谷典正､古山種俊､槙雄二

へブタプレニル二リン酸合成酵素の基質特異性

化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

86.中原博史､槙雄二､西野徳三､古山種俊､長岐正彦

フアルネシル二リン酸合成酵素(一ps)の人工基質(10)一環状化合物の

基質ホモログ

化学系7学協会連合東北地方大会,弘前(2002. 10. 5-6)

87.長岐正彦､宮田和彦､高橋修子､槙雄二､西野徳三､古山種俊

遺伝子組換え体､短鎖プレニル基転移酵素を用いたエポキシアルコールの

不斉合成

‥第44回天然物有機化合物討論会,東京(2002. 10, 9-10)

88. Y. Kharel, Y.-W. Zhang, M. Fujihashi, K. Miki, and T. Koyama

The role of highly conseNed aromatic residues in Mt'crococcus luteus B-P 26

undecaprenyl diphosphate synthase

第75回日本生化学会大会,京都(2002. 10. 13-16)

89.遠藤章太､高橋征司､張元偉､古山種俊

ヒトのデヒドロドリキル二リン酸合成酵素の単離及び機能解析

第75回日本生化学会大会,京都(2002. 10. 13-16)

90.小関弘恵知､高橋征司､古山種俊

イソプレノイド化合物の膜間移動に関するアッセイ系構築について

第75回日本生化学会大会,京都(2002. 10. 13-16)

91.井上明大､武田史世､高橋征司､古山種俊

ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の特異的阻害剤の構造解析

第75回日本生化学会大会,京都(2002. 10. 13-16)

92.佐藤幹也､竹川政範､松本若菜､大谷典正､古山種俊､槙雄二

Synthases and Enzymatic Evaluation or Substrate Analogs of Medium-chain

Prenyl Diphophate Synthase

第46回香料･テルペンおよび精油化学に関する討論会･国際精油シンポ

93.後藤吉範､佐々木多起子､土本美代子､大谷典正､西野徳三､長岐正彦､

古山種俊､槙 雄二

耐熱性変異型フアルネシル二リン酸合成酵素の基質特異性∼イオウ原

子を持つ基質アナログについて∼

第6回生体触媒化学シンポジウム,奈良(2002. 12. 12)

94.小関弘恵知､高橋征司､古山種俊

イソプレノイド化合物の膜間移動に関する研究(2)

第83回目化春季年会,東京(2003.3. 18-21)

95.長岐正彦､仲田美乃里､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

4-methy1-4-pentenyl diphosphateに関するプレニル基転移酵素の反応性 について 第83回目化春季年会,東京(2003.3. 18-21)

96.長岐正彦､中原博史､槙 雄二､西野徳三､古山種俊

フアルネシル二リン酸(FPP)合成酵素の基質特異性について(その2)一

環状基質ホモログの反応性一

第83回目化春季年会,東京(2003.3. 18-21)

(3)出版物

1. N. OhyaandT.Koyama

Chapter 4･ Biosynthesis orNatural Rubber and Other Natural Polyisoprenoids : Biopolymers, Volume 2, Polyisoprenoids

(Editor: T. Koyama and S. SteinbBchel )

‥ Wiley-VCH Verlag GmbH , Weinheim

pp. 731109 (2001)

2. Y.lW. ZhangandT. Koyama

Chapter 5･ Biosynthesis Routes Diverting from Intermediates of Polyisoprenoid

Biosynthesis to Related Products or the Metabolism: Biopolymers, Volume 2,

Polyi soprenoi ds

(Editor: T. Koyama and S. Steinbdche) )

Wiley-VCH Verlag GmbH , Weinheim pp. 111-150(2001)

研究成果による工業所有権の出願･取得状況

研究成果

本補助金が交付された期間内に得られた研究成果の概要を以下に箇条書きに

して解説する｡また､この研究に関連して発表した論文､総説､および著者の

別刷りコピーを添付する｡

(A) シス型プレニル鎖延長酵素の分子解析[発表論文: 18]

1)ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の結晶構造解析[10]

シス型プレニル鎖延長酵素として初めて研究代表者らがクローン化した､

Micrococcus luteus B-P 26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素のX線結 晶構造解析を進め､ 2. 2Åの分解能でホモ二量体構造の立体構造の解明に成

功した｡この酵素のコア構造は6本のβ-シートにより形成される､全く新

しい折り畳み構造であった｡興味深いことに､トランス型プレニル鎖延長

酵素のフアルネシル二リン酸(FPP)合成酵素をはじめとする､イソプレノ

イド生合成関連の酵素の立体構造がα--リックスのみによって構成される

``Isprenoid Synthase Fold"と提唱されている共通の立体構造を持ってい

るのに対し､ウンデカプレニル二リン酸合成酵素はβ-構造の多い､新規な

折り畳み構造であることがわかった｡

2)部位特異的変異導入によるウンデカプレニル二リン酸合成酵素の触媒

機構解明[7,ll,21] M. luteus B-P 26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子に対する 部位特異的変異導入実験により､ 29D, 33R, 77N, 78W,80Rなどの保存残基がア

リル性基質の結合に重要であることが明らかになった他､結晶構造解析で

リン酸基の結合モチーフとして示唆されたP-ループ構造がアリル性基質FPP

の二リン酸部の結合に関与しており､特に33位のアルギニンが直接結合し

ていることが判明した｡さらに42位のアルギニンもFPPの結合に重要であ

り､他の生物由来の酵素で32位のグリシンと相補的な関係にあることも明

らかになった｡シス型鎖延長酵素反応が1回起こって生成されるシスーゲラ

ニルゲラニル二リン酸(Z-GGPP)は各変異導入酵素に対し､ FPPと全く異な るKm値を与えることが明確になり､反応中間体となるZ-GGPPはP-ループ

とは結合せず､全く別の結合部位が存在する可能性を明らかにした0

さらに､ 73F,74S, 197R,203R,216Eがホモアリル性基質IPPの結合に関与

している保存性残基として同定され､これらのアミノ酸残基はいずれも触

媒活性発現にも非常に重要であることが明らかとなっ･た｡

3)ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の効果的阻害剤の探索[未発表]

M. luteus B-P 26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素の効果的阻害剤

の探索を抗菌活性を示す各種の生薬を対象として進めたところ､リノール

酸が阻害作用を示すことが明らかとなった｡さらにリノール酸の類似化合

_物を各種合成し､この酵素の阻害剤の化学構造と阻害作用の関係を追究し､

ウンデカプレニル二リン酸合成酵素に有効な阻害剤の構造を明らかにした｡

(B) トランス型プレニル鎖延長酵素の分子解析[2,4,5,6]

1)中鎖プレニル鎖延長酵素のプレニル鎖延長停止機構

トランス型プレニル鎖延長酵素の中で特異なグループである､中鎖プレ

ニル鎖延長酵素[-キサブレニル二リン酸合成酵素(M. luteus B-P 26)およ び-ブタプレニル二リン酸合成酵素(Bacilus subtilis)]の解離性-テロサ

ブユニットの各々について､反応生成物のプレニル鎖長の決定に関与する

アミノ酸残基を追究した結果､大きいサブユニット側で反応生成物の鎖長

決定に重要とされるDDXXDモチーフの上流のAlaやSerの他に､小サブユ

ニット側に保存されている領域についても基質の結合や反応生成物のプレ

ニル鎖長決定に関与する部位があることが判明した｡

2)フアルネシル二リン酸合成酵素のホモ二量体構造と触媒機能発現機構と

の関連について

ホモ二量体構造を持つことでプレニル鎖延長酵素としての触媒機能を発

現するフアルネシル二リン酸合成酵素について､部位特異的変異導入によ

り不活性化したサブユニットと野生型サブユニットとのハイブリッド型二

量体酵素をいくつか合成し､その触媒機能発現量を比較した結果､サブユ

ニットの二量化によって生じるサブユニット間に触媒機能発現に重要な領

域が生じることを明らかにした｡

(C) 各種プレニル鎖延長酵素の遺伝子クローニングおよび発現系の構築

1)デヒドロドリキル二リン酸合成酵素[17] M. luteus B-P 26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素の遺伝子クロー

ニングがきっかけとなって明らかになったシス型プレニル鎖延長酵素の保

存領域のアミノ酸配列を基にして､ヒトのデヒドロドリキル二リン酸合成

酵素の遺伝子の同定を行い酵母での発現系構築に成功した｡

2)天然ゴム生合成に関連するプレニル鎖延長酵素[9, 16] 天然ゴムの木(パラゴムノキ､ Hevea brasilieniis)の各組織(ラテッ

クス､葉､茎など)のcDNAライブラリーを作製し､天然ゴム生合成に関連

する可能性のあるプレニル鎖延長酵素として､ゲラニルゲラニル二リン酸

合成酵素および､ポリシスプレニル鎖延長酵素のcDNAクローニングに成功

した｡前者については天然ゴム生合成のプライマー基質を供給する可能性

を追究したが､ノーザンブロッテイングの結果によると植物のほとんどの

組織において発現が認められ､ラテックスに高い発現量を示すフアルネシ

ル二リン酸合成酵素がプライマー供給の役割を担っている可能性が高いこ

とが明らかになった｡ ラテックスと葉より､ポリシスプレニル鎖延長酵素のcDNAクローニング

を行い､大腸菌での大量発現系の構築を行った結果､弱いながらもポリシ

スプレニル鎖延長酵素反応の触媒能が確認できた｡興味深いことに､パラ

ゴムノキの新鮮なラテックスの超遠心分離による沈澱画分にゴム生合成に

重要な役割をすると思われるポリシスプレニル鎖延長酵素の活性化因子や

シスプレニル鎖延長反応の重合促進因子などが存在していることが明らか

になった｡ [タイ国プリンスオブ ソンクラ大R. Wititsuwannakul助教授 およびタイ国マヒドン大D. Wititsuwannakul助教授との共同研究] 3)デカプレニル二リン酸合成酵素[19]

ユビキノンー10のプレニル側鎖の生合成を担っているデカプレニル二リン

酸合成酵素をParacoccus denitrl'ficansよりクローン化し､大量発現系の

構築に成功した｡この遺伝子を導入した大腸菌内でのユビキノンー10の効率

の良い生産が確認出来た｡

(D) -各種人工基質ホモログによるプレニルトランスフェラーゼの基質特異

性の研究[1,3,8,12,13,14,15,20] B. stearothemophilusのフアルネシル二リン酸合成酵素､ M. luteus

B-p 26のヘキサプレニル二リン酸合成酵素やウンデカプレニル二リン酸合成

酵素およびB. subtilisの-ブタプレニル二リン酸合成酵素について､基

質のアルキル部分の構造をいろいろに変化させた人工基質ホモログに対す

る基質特異性の研究を展開し､多種多様なプレニルアルコールホモログの

酵素的合成が可能であることを示した｡ [弘前大･理工 長岐正彦助教授､

_山形大･理 槙 雄二教授､東北大･工 西野徳三教授との共同研究]

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