選択的β3受容体遮断薬の開発研究

選択的β3受容体遮断薬の開発研究

著者

柳澤 輝行

選択的β 3受容体遮断薬の開発研究

(課題番号 07557327)

Z

平成7年度∼平成9年度科学研究費補助金(基盤研究(A)(串)

研究成果報告書

平成10年3月

研究代表者 柳揮 輝行

(東北大学医学部･教授)

はじめに

従来､ βアドレナリン受容体は､ β1､ β2の2種類に分類されてきたが､一方 ではこれらとは異なる第3番目の非定型β受容体が脂肪細胞に存在すると考えら れてきた｡また､心筋にも非定型β受容体が存在していることが推定されたきた｡ 1989年にEmorineらにより脂肪細胞のレセプターの一次構造が明らかとされ､ P 3 受容体と命名された｡ β 3受容体はエネルギー消費や内蔵肥満､インスリン抵抗 性､耐糖能の異常に関与する因子として注目を集めている｡しかしながら､ β 3 受容体作動薬は種差特に寄歯類とヒトにおいて効果の違いがみられており､寄歯 類で効果のあったものがヒトでは効果を示さないという報告もある｡また､そこ でヒトにおけるβ 3受容体作動薬の効果を予測し､下に述べる選択的β 3受容体 遮断薬を開発するために､ヒトβ 3受容体cDNAを発現する動物細胞を作製し､ この細胞を用いてβ 3受容体関連薬物の結合や薬理作用について検討したo さらには､現在､脂肪細胞のβ 3受容体刺激薬が存在するので､刺激薬と遮断 薬の構造活性相関を検討してβ 3受容体刺激薬と遮断薬の基本構造を3次元コン ビュタ-グラフィクスの方法を用いて描出することも有力な手段である｡心筋β 3あるいはβ 4受容体の薬物活性中心であるフアルマコフォアを推定するには､ 新たにクローニングを目指しているβ 3 (β 4)受容体蛋白質の薬物結合部位構 造から行うしかない｡コンビュタ-グラフィクスの方法と分子生物学の両面から 選択的β 3遮断薬の構造をを推定する戦略は極めて有力と考える｡ 新規β 3受容体遮断薬に関する基礎的情報を得ることは､今後の学術的進展に 大きな意味を持つ｡まして選択的β 3受容体遮断薬が開発されれば､従来のβ遮 断薬を用いていたのでは分析できない交感神経系や中枢神経系の研究に大きな展 望が開ける｡我々の研究業績は一方では製薬企業に伝わり､新たな知見をもとに した選択的β 3受容体遮断薬という新治療薬の開発を促し､もう一方では臨床家 にとって新しい治療法の可能性を呼び起こすことになる｡ 00010133306

二二二二二二二｣

研究代表者 柳滞輝行

研究分担者 布木和夫

助川 浮

佐藤靖史

山田博幸

黒滞秀保

研究組織

(東北大学医学部･教授)

(東北大学医学部･講師)

(東北大学医学部･講師)

(東北大学加齢医学研究所･教授)

(日清製粉生物研究所･主任研究員)

(田辺製薬医薬育成研究所･主任研究員)

研究協力者

東北大学医学部第二薬理学教室(現東北大学大学院医学系研究科生

体機能制御学講座分子薬理学分野):平 則夫､石井邦明､

山岸俊夫､岡田 斉､村越秀行､景山正明､大内 力､山下 洋､

宮崎泰輔､清水雅行､須貝和幸､橋本吉弘､佐藤岳哉

東北大学医学部第-薬理学教室(現東北大学大学院医学系研究科生

体機能制御学講座細胞薬理学分野) :渡連建彦､谷内一彦､

横井映子､大内 譲

東北大学加齢医学研究所腫蕩循環研究分野:阿部まなみ､岩佐知任､

田中克宏､小田伸行

東北大学医学部脳神経外科学教室:本橋 蔵､吉本高志

岩手医科大学脳神経外科学教室:鈴木倫保

大阪大学医学部第二薬理学教室:福井裕行

研究経費

平成7年度    6,400千円 平成8年度    3,500千円 平成9年度    2,700千円 合計      12,600千円 2

研究発表

1.学会誌等 (*印は巻末に別冊､コピーを添付)

1.*  Okada, H., Ishii, K., Nunoki, K.andTaira, N･:

cloming of a sweuing-induced chloride current related protein from rabbit heart･ Biochim. Biophys･ Acta 1234: 145-148, 1995･

2. Ishii, K., Yamagishi, T., Nunoki, K･, Okada, H･and Taira, N･:

Amino acid residues responsiblefor sensidvity to pH of cloned K+ channels･ Heart Vessels Suppl. 9: 12-13, 1995･

3.*  Sasaki, Y., Ishii, K., Nunoki, K., Yamagishi, T･,and Taira, N･:

voltage-dependent K+ channel (Kv l ･5) clone仙･om rabbit heart aJld facilitation of inactivadon of the delayed rectifier current bythe rat b subunit･

FEBSLett. 372: 20-24, 1995.

4.*  Masaaki KAGEYAMA, Teruyuki YANAGISAWA & Norio TARA:

Effects of semotiadilfumarate, a novel Ca2+antagonist, on cytosolic Ca2'level

and fわrce of contraction in porcine coronazy arteries･ Br. J. Phamacol. 114(6), 1289-1295, 1995.

5.*  Murakoshi, H., Nunoki, K., Ishii, K.and Taira, N･:

Determinadon of KA Values by controlled receptor expression in Xenopus

OOCyteS･

Br. ∫. Phamacol. 116: 2062-2066, 1995

6. *  Hideo KUROSAWA, Teruyuki YANAGISAWA & Norio TARA:

Biphasic antagonisms of β -blockers against positive inob'OPic response via β 1

adrenoceptors in isolated caJheright venLricular muscles: possible involvement of

two β l a血enoceptor subtypes･

J. Cardiovasc. Pharmacol. 27(1), 262-268. 1996･

7. Iwasaka C. Tanaka K. At光M. Sato Y. Ets-1 regulates anglOgeneSis by inducing

the expression of urokinase-type plasminogen activatorand matrix metalloproteinase-1andthemigration of vascular endothelial cells･

J. Cell. Physiol. 169(3):522-531, 1996･

8

9*

10.

ll.

Kurosawa H. Narita H. Kaburaki M. Yabana H. Doi H. Itogawa E. Okamoto M･:

prolongation of the life span of cardiomyopathic hamster by die adrenergic txta 1 -selective partialagomist denopamine ･

Jpn. J. Phamacol. 72(4):325-33, 1996

YuzuruoHUCHI, Kazuhiko YANAI, Eiko Sakumi, Hiroyuki FFUKUI,

Teruyuki YANAGISAWA & Thkehiko Watan血: Histarnine-induced calcium

mobilizadon in single cultured cells expressing histamine Hl托CePtOrS: A

relationship between its sensitivityandthe density of Hheceptors･ Intem. J. Mol. Med. 1: 355-360, 1998.

Atx! M. Oda N. Sato Y. Cell-associated acdvadon of latent transforrrung growth

factor-txtta by calpain. J. Cell. Physiol･ 174(2): 186-93, 1998･

Kazuyuki Sugai, Teruyuki YanaglSaWa, Osamu Motohashi･ Michiyasu Suzuki･

Takashi Yoshimoto:Levcromakalim decreases cytoplasmic Ca2', vasculartoneand

Ca2'Sensidvityincamine basilarartery. Fund. Clin･ PhamlaCOl･ (in press)

12.* Teruyuki YANAGISAWA:

Hyperpolarization-relaxation coupling ln VaSCularsmoothmuscle: Findings with

K'channel openers.

In "Molecular and Ceuular Mechamisms of CardiovascularReguladon-I pp. 1 83-193, 1996, ed. by M. Endoh, H, Scholtz, M･ Morad & T･ Iijima, Springer-Verlag･

Tokyo. 13. 柳浮輝行: Kチャネルオープナーの平滑筋弛彼はKチャネル開口によるか一過分極 弛緩連関. 医学のあゆみ, 169(13), 1253-1255, 1994. 14. 柳滞輝行: caチャネル作動薬開発の新しい動向.特集/ca括抗薬 循環器科, 37(4), 325-333, 1995. 15. 柳浮輝行: ca括抗薬の種類と特徴.特集｢高血圧とカルシウム括抗薬｣ ClimiCalCalcium 5(7), 840-846, 1995. 4

16. 柳揮輝行: カリウムチャネルと過分極弛緩連関.稔説 創薬科学一分子から個体への 薬理学. 目薬理詰, 106(1), 157-169, 1995. 17. 柳滞輝行: 新作用機序を持つ降庄薬: K+チャネルオープナー.特集｢腎と高血圧-最近の話題-｣ 腎と透析, 39(臨時増刊号, 1 1月),606-611, 1995. 18. 柳揮輝行: 血管平滑筋のK'チャネル. 血管と内皮, 6(3) 221-231, 1996. 19. 柳淳輝行: カリウムチャネルブロッカーとオープナー. 循環制御, 17(2) 180-188, 1996. 20. 柳揮輝行､須貝和幸: K'チャネルと血管平滑筋. 脳神経外科速報, 6(8) 585-589, 1996. 21.* 柳滞輝行: caセンシタイザ-.特集｢心臓の機能とカルシウム｣ ClimiCalCalcium 6(9), 1114-1117, 1996. 22.* 柳揮輝行､布木和夫､清水雅行: カルシウム括抗薬はなぜ効くか? カルシウム括抗薬の分子･細胞薬理学. 特集｢カルシウム括抗薬の新潮流｣ ClimiCalCalcitm 7(12), 1593-1600, 1997. 23. 柳滞輝行: 血管のKチャネル.その1 KむとKAT,の分子薬理学. 血管と内皮 8(1),82-86, 1998 24. 柳揮輝行､布木和夫: 血管のKチャネル.その2 Kc&とKvの分子薬理学. 血管と内皮 8(2), 1998 (inpress) 5

25. 26. 27. 28. 柳浄輝行､布木和夫､清水雅行: ヵルシウム括抗薬の分子薬理学.特集｢高血圧の分子医学｣ 現代医療 30(4),, 1998. (impress) 柳滞輝行: カルシウム桔抗薬の臓器選択性のメカニズム. カルシウム括抗薬一解明された基礎と臨床への応用一 失崎義雄,遠藤政夫(編集)医薬ジャーナル社1995,pp･54-68･ 柳淳輝行(編著) : 新薬理学入門 南山堂 1997.ll.28 仝372頁 柳揮輝行､布木和夫､清水雅行: c a括抗薬の分類と作用機序. 目で見る循環器病シリーズ14 薬物療法 斎藤宗靖(編) メジカルビュ- 1998. (impress)

2.口頭発表

1.  柳浄輝行､大内 力､平 則夫: ホルボールエステルの冠動脈収縮作用とKチャンネル開口薬による抑制 第4回Coroanryclub, 1995.1.21.仙台. 2. 柳揮輝行: 膜電位による膜酵素活性の制御-Kチャンネル開口薬での知見-第2回文部省経費によるシンポジウム, 1995.2.18.札幌. 主催 菅野盛夫 (北海道大学医学部薬理学第二) 3.  柳揮輝行: 慢性心不全の病態と薬物療法一血管拡張薬を中心に-. [講演] 日本ロシュ(秩) scientificForum, 1995.3.24.東京. 4. 柳揮輝行､岡田雄治､山岸俊夫､平 則夫: 過分極一弛緩連関-Kチャネル開口薬による知見-シンポジウムー15 K'チャネルオープナーと心臓 第6 8回日本薬理学会年会, 1995.3.25-28.名古屋.

5.  Teruyuki YjuAGISAWA, Chikara OUCHI, Yuji OKADA & Norio TAIRA:

Hyperpolarizahon deqeasesand depolarizadonincreasesthe Ca2'sensitivityin

coronaryarterialsmoothmuscle. 日英合同生理学会 岡崎シンポジウム, 1995.3.27-28.岡崎. 6. 柳揮輝行､平 則夫: protein kinase C活性化の冠動脈収縮作用と膜電位:過分極一弛緩連関の一 面. 第5 9回日本循環器学会学術集会, 1995.4.ト3.東京. 7.  Teruyuki YANAGISAWA:

HyperpolariZation-relaxadon coupling in vascularsmoothmuscle. (invited speaker)

Sendai IntemadonalSymposium on Molecular and CellularMechamisms of

CardiovascularReguladon 1995.5.10112.仙台.

柳津輝行､宮崎泰輔､平 則夫:

細胞内C a 2+濃度から見た新規強心薬N-3601の冠動脈拡張作用機序.

第4 6回日本薬理学会北部会, 1995.8. 26.札幌.

9. 清水雅行､柳滞輝行､山下 洋: ブタ冠動脈平滑筋における細胞内calcium store枯渇時のCalciuminfluxの検 討. 第4 6回日本薬理学会北部会, 1995.8.26.札幌. 10. 柳滞輝行: カリウムチャネルと過分極弛緩連関. [講演] 中外製薬富士御殿場研究所セミナー, 1995.ll.17.御殿場･ ll. 清水雅行､柳揮輝行: ブタ冠動脈平滑筋における細胞内calcium store枯渇時のCalciuminfluxの検 討. 第6回CoronaryClub, 1996. 1. 20.仙台･ 12. 柳浮輝行: カルシウム括抗剤の臓器選択性のメカニズム. [特別講演] 第1 7回カルシウム括抗剤九州研究会, 1996.3.15.福岡･ 13. 柳帝輝行,宮崎泰輔,平 則夫 冠動脈における各種ホスホジエステラーゼ阻害薬の拡張作用機序･ 第6 9回日本薬理学会年会, 1996.3.20-23.長崎. 14. 清水雅行､景山正明､柳滞輝行: ブタ冠動脈平滑筋における細胞内カルシウム流入に対するセモチアジル の抑制作用. 第6 9回日本薬理学会年会, 1996.3.20-23.長崎･ 15. 柳揮輝行: 新強心薬の作用機序. [特別講演] 第2回ブンゴイノトロピーアゴラ(世話人:有田 真) , 1996･4･19･大 分. 1 6･ Teruyuki YANAGISAWA:

Molecular and ceuularmechanisms of hyperpolarization-relaxation coup血gin coronary artery ･

the Gordon Research Conferences on.TCardiac Regulatory Mechanismsl.･ Marlene

Hosey'chair;別ard Marban, vice chair at Solby-Cowyer Couege･ NewLendon,

New Hampshire, 1996･ 7･7-12･

17. 清水雅行､柳滞輝行:

ブタ冠動脈平滑筋における細胞内Calcium store枯渇時のCalcium influxの検 討. 第1 2回高血圧とカルシウムカンフアランス,1996.8.3-4.箱根. 18. 柳揮輝行､須貝和幸､本橋 蔵､寺本高志: (シンポジスト) 細胞内C㌔+濃度から見た脳血管におけるK+チャネルと過分極弛媛連関. 第6回脳血管シンポジウム, 1996.9.7.大阪. 19. 清水雅行､柳滞輝行: ブタ冠動脈平滑筋における細胞内Calcium store枯渇時のCalciuminfluxの検 討. 第4 7回日本薬理学会北部会, 1996.10.12.山形. 20. 柳揮輝行､須貝和幸､本橋 蔵､吉本高志: イヌ脳底動脈に対するlevcromakalimの作用とその機序. 第4 7回日本薬理学会北部会, 1996.10.12.山形. 21. 橋本書弘､清水雅行､柳滞輝行: ブタ冠動脈平滑筋におけるベンゾチアゼピンタイプカルシウム括抗薬の 張力および細胞内カルシウムに対する作用. 第7 0回日本薬理学会年会, 1997.3.22-25.幕張メッセ. 22. 柳浄輝行: 特別講演会:薬理学から見た心不全の治療. ティジン東京研究センター, 1997.5.9. 23. 柳滞輝行: 特別講演会:細胞内C㌔+濃度から見た血管平滑筋張力:過分極弛緩連関. 第50回東北大学医学部癌集団会, 1997.5.22.東北大学医学部臨床大会議室. 24. 25. 柳滞輝行: 特別講演会: K+チャネルから見た循環器系調節機構. 第122回日本循環器学会東北地方会, 1997.6.6.仙台艮陵会館 柳津輝行: 特別講義:イオンチャネルから見た循環器系薬理学. 9

26. 27. 28. 29. 金沢医科大学医学部, 1997.6.12. 柳滞輝行: 特別講義: K+チャネルオープナーの血管拡張作用機序:過分極弛緩連関. 金沢医科大学医学部, 1997.6.12. 柳揮輝行: K+チャネルオープナーと過分極弛緩連関. 第39回日本平滑筋学会総会シンポジウムⅥ ｢膜レベルでとらえる弛緩｣ 1997.7.24-25.大阪 柳淳輝行､清水雅行: マンガンクエンチングによるブタ冠動脈平滑筋における2価陽イオン流 入の検討. 第4 8回日本薬理学会北部会, 1997.10.18.盛岡. 佐藤岳哉､助川浮､布木和夫､柳揮輝行: ヒトβ 3アドレナリン受容体遺伝子発現細胞の作成･ 第4 8回日本薬理学会北部会, 1997.10.18.盛岡. 10

研究成果

β,アドレナリン受容体(β,)は､従来非定型βアドレナリン受容体と考えら れていたものである｡これに特異的に働くβ 3作動薬が抗肥満薬､糖尿病治療薬な どをめざして幾つか開発されているが､ヒトに対して有効であるという報告がほ とんどなされていない｡そこでヒトへの効果を予測するためと選択的β 3受容体遮 断薬の開発する際の系としても重要であるので､ヒトβ ,アドレナリン受容体遺伝 子を発現する細胞系の確立を試みた｡ 1.ヒトβ ,cDNA導入ChineseHamster伽ary細胞の作製:ヒトβ , cDNAを発現 ベクターpcDNA3.1 (十)に組み込み､これをcHO-Kl細胞に導入した｡ヒトP 3 -cHO細胞の選択は､ P受容体のリガンド【125Ⅰ】-iodocyanopindololを用いる RadioligandBindingAssayで行い､ヒトP , cDNAを発現するG4細胞を得た. 2.ヒトβ ,受容体の解析:ヒトβ ,受容体の【125Ⅰ】-iodocyanopindololのKd値は707 pM､ Bmaxは634 hol/mgproteinであった. 3. BRL37344のヒトP ,受容体に対する作用: BRL37344のヒトβ ,受容体結合 能およびcAMP産生能について検討を行った｡BRL37344のKi値は1.9±1.4 FL M､ pD2億は6.75±0.09 FL Mであった｡またイソプロテレノールのKi借は4･2±2･3 FL M ､ pD2億は7･67±0･09 FL Mであったo 以上の結果よりヒトβ ,アドレナリン受容体遺伝子発現細胞を用いる本評価系 は､ヒトでの新規アゴニストのスクリーニングとその効果を予測､及び選択的β , 受容体遮断薬の開発し研究する系として有用であることが示された｡ 選択的アドレナリンβ 1受容体部分作動薬デノバミンは経口強心薬として我が 国で現在臨床使用されている｡そこで心筋のβ受容体に関する知見を得るために､ デノバミンの心筋症ハムスターに対する寿命延長作用を検討解析し, β受容体作 動薬･遮断薬の作用特性を解析して,デノバミンの有用性を作用機序と心筋のβ 1 受容体に関する新しい概念とともに考察した｡ デノバミンの心不全期の心筋症ハムスター(BIO14.6)に対する効果の検討｡コ ントロール群は40週齢より死亡例が出現し, 65週齢における生存率は23.8 %で あった｡デノバミン投与群では, 52週齢の時点まで,心臓死の症例は認められず, 65過齢における生存率は40%であった｡非心臓死を除いた65過齢における両群 の生存率には有意差が認められた｡心血行動態,心重量,デノバミンに対する反 応性および心筋内アドレナリンβ受容体密度には両群で差は見られなかったが, デノバミン投与群の血費中ノルアドレナリン･ドーパミン濃度の有意な低下が認 められた｡ イヌ摘出右心室筋標本におけるβ 1受容体を介する陽性変力作用の検討｡デノ バミンのカテコール誘導体, Ⅶ509とT1583は選択的なβ 1受容体完全作動薬で あり, Tt)509の陽性変力作用はムスカリン受容体作動薬のカルバコールにより非 11

競合的阻害を,ホスホジエステラーゼ阻害薬のIBMXにより増強を受けたことよ り,その作用がcAMPを介している. T0509とT1583は-相性の濃度依存的陽性 変力作用を示したのに対し, cAMPレベルを二相性に増加させた｡選択的β 1受容 体遮断薬のアテノロール,ピソプロロールと非選択的β受容体遮断薬のナドロー ルはⅦ509の陽性変力作用を-相性に括抗したのに対し, β 1 ･ β 2受容体非選 択的作動薬のイソプロテレノールの作用を二相性に括抗した｡ 速断薬の括抗作用の特徴は,古典的β 1 ･ β 2受容体の概念では説明できず, β 1受容体に二つの親和性状態あるいはサブタイプ(非定型β受容体)が存在するこ とを示唆する｡低濃度のⅦ509とT1583はcAMPの利用率の高い高親和性β 1受 容体を介して陽性変力作用を示し,また,高濃度においては低親和性β 1受容体 を介し, cAMPレベルを大きく増加させると考えられる｡デノバミンは高親和性β 1受容体を選択的に刺激して強心作用を発現すると考えられ,デノバミンは,それ 自身では心筋細胞内の過剰なcAMPレベルの増加を来さないで強心作用を表し, 慢性心不全患者において心不全時に働いている代償性の交感神経からのカテコー ルアミン遊離を抑制することを示唆する｡これらの機序により慢性心不全患者に とりデノバミンは有用な治療薬であると考えられる｡ 12

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