(4) 野生動物等の摂食を防止するため 遅くとも出穂期までには 防鳥網を本遺伝子組換えイネの栽培水田を取り囲むように設置する 栽培は慣行法に準じ 気象等に対応して防風網の設置を行う場合がある 2 隔離ほ場の作業要領 (1) 本遺伝子組換えイネ及び比較対照の非遺伝子組換えイネ以外の植物が隔離ほ場内の使

第 一 種 使 用 規 程 承 認 申 請 書 第 一 種 使 用 規 程 承 認 申 請 書 第 一 種 使 用 規 程 承 認 申 請 書 第 一 種 使 用 規 程 承 認 申 請 書 平 成 ２９年 ２月 ２４ 日 文 部 科 学 大 臣 松 野 博 一 殿 環 境 大 臣 山 本 公 一 殿 氏 名 国 立 研 究 開 発 法 人 申 請 者 農 業 ・ 食 品 産 業 技 術 総 合 研 究 機 構 理 事 長 井 邊 時 雄 印 住 所 茨 城 県 つ く ば 市 観 音 台 ３ － １ － １ 第 一 種 使 用 規 程 に つ い て 承 認 を 受 け た い の で 、遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 使 用 等 の 規 制 に よ る 生 物 の 多 様 性 の 確 保 に 関 す る 法 律 第 ４ 条 第 ２ 項 （ 同 法 第 ９ 条 第 ４ 項 に お い て 準 用 す る 場 合 を 含 む 。 ） の 規 定 に よ り 、 次 の と お り 申 請 し ま す 。 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 種 類 の 名 称 シ ン ク 能 改 変 イ ネ （ OsCKX2/Gn1a 改変 イネ系統） (Oryza sativa L. NIAS16-OSCas-Gn1a）

遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 第 一 種 使 用 等 の 内 容 隔 離 ほ 場 に お け る 栽 培 、 保 管 、 運 搬 及 び 廃 棄 並 び に こ れ ら に 付 随 す る 行 為 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 第 一 種 使 用 等 の 方 法 所 在 地 ： 茨 城 県 つ く ば 市 観 音 台 ３ － １ － １ （ 所 在 エ リ ア：観 音 台 第 4 事 業 場 畑 圃 場 HC-2 番 北 西 端 ） 名 称 ： 農 業 ・ 食 品 産 業 技 術 総 合 研 究 機 構 観 音 台 第 4 事 業 場 「 高 機 能 隔 離 圃 場 」 使 用 期 間 ： 承 認 日 か ら 平 成 ３ ４ 年 ３ 月 ３ １ 日 ま で １ 隔 離 ほ 場 の 施 設 （ １ ） 部 外 者 の 立 入 り の 防 止 の た め 、隔 離 ほ 場 を 取 り 囲 む 高 さ 1.8 ｍ の 金 属 製 フ ェ ン ス を 設 置 す る 。 （ ２ ） 隔 離 ほ 場 で あ る こ と 、部 外 者 は 立 入 禁 止 で あ る こ と 及 び 管 理 責 任 者 の 氏 名 を 明 示 し た 標 識 を 正 面 入 口 の 見 や す い 場 所 に 掲 示 す る 。 （ ３ ） 隔 離 ほ 場 で 使 用 し た 機 械 、器 具 、靴 等 を 洗 浄 す る た め の 洗 い 場 を 設 置 す る と 共 に 、 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ の 隔 離 ほ 場 外 へ の 流 出 を 防 止 す る た め の 設 備 を 有 す る 排 水 系 を 設 置 し て い る 。

（ ４ ） 野 生 動 物 等 の 摂 食 を 防 止 す る た め 、遅 く と も 出 穂 期 ま で に は 、 防 鳥 網 を 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ の 栽 培 水 田 を 取 り 囲 む よ う に 設 置 す る 。 栽 培 は 慣 行 法 に 準 じ 、 気 象 等 に 対 応 し て 防 風網の設 置を行 う場 合がある。 ２ 隔離ほ場の作業要領 （ １ ） 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ 及 び 比較対 照 の非遺伝 子組換えイ ネ 以 外 の 植 物 が 隔 離 ほ 場 内 の 使 用 区 画 で 生 育 す る こ と を 、 除 草 管 理 等 に よ り 最 小 限 に 抑 制 す る 。 （ ２ ） 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ 及 び 比較対 照 の非遺伝 子組換えイ ネ を 隔 離 ほ 場 外 に 運 搬 又 は 保 管 す る 場 合 に は 、 第 二 種 使 用 等 と し て 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 使 用 等 の 規 制 に よ る 生 物 の 多 様 性 の 確 保 に 関 す る 法 律 （ 平 成 15年 6月 18日 法 律 第 9 7号 ）第 12条 又 は 第 13条 で 定 め る 拡 散 防 止 措 置 を 実 施 す る 。 （ ３ ） 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ の 栽 培 終了 後 、当該イ ネ及び 比較 対 照 の 非 遺 伝 子 組 換 え イ ネ は 、 隔 離 ほ 場 内 に お い て 乾 燥 、 脱 穀 す る 。 （ ４ ） 栽 培 終 了後 、保管 し ない種子（ も み）は焼 却処 理に より 確 実 に 不 活 化 を 行 う 。 ま た 、 刈 り 取 ら れ た 稲 わ ら を 含 む 地 上 部 は オ ー ト ク レ ー ブ 又 は 焼 却 炉 に て 不 活 化 す る 。 刈 り 取 ら れ な い 残 り の イ ネ 残 渣 及 び ひ こ ば え は 、 ほ 場 内 に 全 て す き 込 み 又 は 埋 設 等 に よ り 不 活 化 す る 。 （ ５ ） 隔離ほ場 内で使用し た機械、機具及び靴等 は 作業終了 後 、 隔 離 ほ 場 内 で 洗 浄 す る こ と 等 に よ り 、 意 図 せ ず に 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ が 隔 離 ほ 場 外 に 持 ち 出 さ れ る こ と を 防 止 す る 。 （ ６ ） 隔離ほ場 が本来有す る機能 が十 分 発揮され るよ う、施設 の 維 持及び管理 を行 う。 （ ７） (１ )から (６ )に掲げ る事項を第 一種使用等 をする者に 遵 守 さ せ る 。 （ ８） 本遺伝子 組換えイネ による生物 多様性 影響 が 生ずるお そ れ が あ る と 認 め ら れ る に 至 っ た 場 合 は 、 別 に 定 め る 緊 急 措 置 計 画 書 に 基 づ き 、 速 や か に 対 処 す る 。

生物多様性影響評価書

生物多様性影響評価書

生物多様性影響評価書

生物多様性影響評価書

シンク能改変イネ（OsCKX2/Gn1a 改変イネ系統）

（Oryza sativa L. NIAS16-OSCas-Gn1a)

国立研究開発法人

目 次

第 一 生 物 多 様 性 影 響 の 評 価 に 当 た り 収 集 し た 情 報 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ １ 、 宿 主 又 は 宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 に 関 す る 情 報 ・ ・ ・ ・ ・ （ 1） 分 類 学 上 の 位 置 付 け 及 び 自 然 環 境 に お け る 分 布 状 況 ・ ・ ・ （ 2） 使 用 等 の 歴 史 及 び 現 状 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ （ 3） 生 理 学 的 及 び 生 態 学 的 特 性 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ２ 、遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 等 に 関 す る 情 報 ・・・・・・・ ・ （ 1） 供 与 核 酸 に 関 す る 情 報 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ （ 2） ベ ク タ ー に 関 す る 情 報 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ （ 3） 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ （ 4） 細 胞 内 に 移 入 し た 核 酸 の 存 在 状 態 及 び 当 該 核 酸 に よ る 形 質 発 現 の 安 定 性 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ （ 5） 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 検 出 及 び 識 別 の 方 法 並 び に そ れ ら の 感 度 及 び 信 頼 性 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ （ 6) 宿 主 又 は 宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 と の 相 違 ・・・・・・ ３ 、遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 使 用 等 に 関 す る 情 報 ・・・・・・・ ・ (1) 使 用 等 の 内 容 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ (2) 使 用 等 の 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ (3) 承 認 を 受 け よ う と す る 者 に よ る 第 一 種 使 用 等 の 開 始 後 に お け る 情 報 収 集 の 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ （ 4) 生 物 多 様 性 影 響 が 生 ず る お そ れ の あ る 場 合 に お け る 生 物 多 様 性 影 響 を 防 止 す る た め の 措 置 ・ ・ ・・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ （ 5) 実 験 室 等 で の 使 用 等 又 は 第 一 種 使 用 等 が 予 定 さ れ て い る 環 境 と 類 似 し て い る 環 境 で の 使 用 等 の 結 果 ・・・・・・ ・ （ 6）国 外 に お け る 使 用 等 に 関 す る 情 報 ・ ・・ ・・・ ・ ・・・ ・ 第 二 項 目 ご と の 生 物 多 様 性 影 響 の 評 価 ・・・・・・・・・・ ・ １ 、 競 合 に お け る 優 位 性 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ２ 、 有 害 物 質 の 産 生 性 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ３ 、 交 雑 性 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 第 三 生 物 多 様 性 影 響 の 総 合 的 評 価 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 3 3 3 3 4 8 8 15 16 18 21 22 29 30 30 31 32 32 32 33 33 35 36 38

第 一 第 一 第 一 第 一 生 物 多 様 性 影 響 の 評 価 に 当 た り 収 集 し た 情 報生 物 多 様 性 影 響 の 評 価 に 当 た り 収 集 し た 情 報生 物 多 様 性 影 響 の 評 価 に 当 た り 収 集 し た 情 報 生 物 多 様 性 影 響 の 評 価 に 当 た り 収 集 し た 情 報 １ ． 宿 主 ま た は 宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 に 関 す る 情 報 １ ． 宿 主 ま た は 宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 に 関 す る 情 報１ ． 宿 主 ま た は 宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 に 関 す る 情 報 １ ． 宿 主 ま た は 宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 に 関 す る 情 報 （ １ ） 分 類 学 上 の 位 置 付 け （ １ ） 分 類 学 上 の 位 置 付 け （ １ ） 分 類 学 上 の 位 置 付 け （ １ ） 分 類 学 上 の 位 置 付 け 及 び及 び及 び及 び 自 然 環 境 に お け る 分 布 状 況自 然 環 境 に お け る 分 布 状 況自 然 環 境 に お け る 分 布 状 況 自 然 環 境 に お け る 分 布 状 況 ①①① ① 和 名 、 英 名和 名 、 英 名和 名 、 英 名 及 び和 名 、 英 名及 び及 び 学 名及 び学 名学 名学 名

イ ネ 、 rice、 Oryza sativa L.１ ) ②②② ② 国 内国 内国 内国 内 及 び及 び及 び及 び 国 外 の 自 然 環 境 に お け る 自 生 地 域国 外 の 自 然 環 境 に お け る 自 生 地 域国 外 の 自 然 環 境 に お け る 自 生 地 域国 外 の 自 然 環 境 に お け る 自 生 地 域 国 内 に お い て 宿 主 植 物 種 Oryza sativa 及 び 近 縁 野 生 種 の 自 生 は 基 本 的 に 見 ら れ な い 。近 縁 野 生 種 は 世 界 中 の 熱 帯 ・ 亜 熱 帯 に 分 布 し 、様 々 な 環 境 、特 に 生 育 地 の 多 様 な 水 条 件 に 適 応 分 化 し て い る 。遺 伝 的 多 様 性 の 中 核 地 域 は 、イ ン ド 東 北 部 の ア ッ サ ム 地 方 、ラ オ ス 、中 国 雲 南 省 南 端 の シ ー サ ン パ ン ナ ・ タ イ 族 自 治 州 、ミ ャ ン マ ー と 北 部 タ イ の 範 囲 で あ る と 考 え ら れ て い る 。こ れ ら の 地 域 は い ず れ も 山 岳 地 帯 、丘 陵 地 帯 で あ り 複 雑 な 地 形 を 有 す る 地 域 で あ る１ ）_。 な お 、ほ 場 及 び 畦 畔 に は 栽 培 に 伴 っ て 雑 草 イ ネ が 発 生 す る 場 合 が あ る が 、そ の 生 育 域 は 我 が 国 に お い て は 主 に 農 耕 地 及 び そ の 近 傍 に 限 ら れ て い る 。南 ア ジ ア 及 び 東 南 ア ジ ア の 雑 草 イ ネ の 特 性 と し て 栽 培 種 イ ネ と 野 生 種 イ ネ の 交 雑 の み で な く 、栽 培 種 イ ネ ど う し の 交 雑 で も 生 じ た こ と が 示 さ れ て い る こ と２ ) , ３ )_{、我 が 国 に は 野 生 種 イ ネ（ O. nivara、O. rufipogon} 等 ）が 自 生 し て い な い こ と な ど か ら 、我 が 国 に お け る 雑 草 イ ネ は 栽 培 種 イ ネ に 由 来 す る も の で あ り 、栽 培 種 イ ネ 間 の 交 雑 に よ り 雑 草 性 の 形 質 が 出 て き た も の と 考 え ら れ る 。 （ ２ ） 使 用 等 の 歴 史 （ ２ ） 使 用 等 の 歴 史 （ ２ ） 使 用 等 の 歴 史 （ ２ ） 使 用 等 の 歴 史 及 び及 び及 び 現 状及 び現 状現 状 現 状 ①① ①① 国 内国 内国 内国 内 及 び及 び 国 外 に お け る 栽 培及 び及 び国 外 に お け る 栽 培国 外 に お け る 栽 培国 外 に お け る 栽 培 の 歴 史の 歴 史の 歴 史の 歴 史 O. sativaは 紀 元 前 １ 万 ５ 千 年 か ら １ 万 年 の 間 に 栽 培 化 さ れ た と 考 え ら れ 、 栽 培 の 起 源 は イ ン ド 説 、 中 国 説 、 ア ッ サ ム ・ 雲 南 説 が あ る１ )_{。 日 本 へ は 縄 文 時 代 晩 期 に 中 国 か ら 直 接 な い し は 朝 鮮 半 島 を 経 由 し て} 伝 来 し た と 推 定 さ れ て い る４ )_{。我 が 国 の 農 耕 の 歴 史 と と も に 存 在 し 、現}

在 も 最 も 重 要 な 作 物 と し て 広 く 栽 培 さ れ て い る 。 ②②② ② 主 た る 栽 培 地 域 、 栽 培 方 法 、 流 通 実 態主 た る 栽 培 地 域 、 栽 培 方 法 、 流 通 実 態主 た る 栽 培 地 域 、 栽 培 方 法 、 流 通 実 態主 た る 栽 培 地 域 、 栽 培 方 法 、 流 通 実 態 及 び及 び及 び及 び 用 途用 途用 途 用 途 イ ネ は 非 常 に 広 範 な 地 域 で 栽 培 さ れ て お り 、北 は ロ シ ア と 中 国 国 境 の ア ム ー ル 川 の 河 畔（ 北 緯 53度 ）か ら 南 は ア ル ゼ ン チ ン 中 央 部（ 南 緯 40度 ） に わ た る 種 々 の 気 候 条 件 下 で 栽 培 さ れ て い る４ )_{。栽 培 面 積 は 約 1億 500万} ha、 玄 米 の 総 生 産 量 は 5億 ト ン を 越 え る 。 生 産 量 は ア ジ ア (90 ％ 以 上 )、 中 南 米 、 ア フ リ カ 、 北 米 、 旧 ソ 連 、 ヨ ー ロ ッ パ の 順 と な っ て い る 。 我 が 国 で も 栽 培 地 は 北 緯 44度 に ま で 及 び 、ま た 世 界 で 最 も 生 産 力 が 高 い 生 産 地 域 に な っ て い る 。我 が 国 で は 通 常 、春 に 播 種 し て 秋 に 収 穫 す る 。こ の 期 間 内 で 、 田 植 え 可 能 と な る 最 低 気 温 が 13 ℃ 、 登 熟 が 停 止 す る 最 低 気 温 は 15 ℃ と 見 な さ れ て い る５ )_。 栽 培 方 法 に よ っ て イ ネ は 陸 稲 と 水 稲 に 分 け ら れ る 。陸 稲 は 畑 に 直 接 播 種 し 、畑 状 態 で 栽 培 す る 。水 稲 は 水 田 へ 直 接 播 種 す る 直 播 栽 培 も あ る が 、 苗 を 移 植 す る 栽 培 法 が 一 般 的 で あ る 。 我 が 国 で の コ メ の 流 通 実 態 は 、約 800万 ト ン が 国 内 で 生 産 さ れ 、ほ と ん ど が 国 内 消 費 向 け に 流 通 し て い る 。 輸 入 は 77万 ト ン 程 度 で あ る 。 流 通 量 の 約 92 ％ が 主 に 食 用 と し て 消 費 さ れ 、残 り が 加 工 用 、種 子 用 、飼 料 用 に 使 用 さ れ て い る 。 （ ３ ） 生 理 学 的 （ ３ ） 生 理 学 的 （ ３ ） 生 理 学 的 （ ３ ） 生 理 学 的 及 び及 び及 び及 び 生 態 学 的 特 性生 態 学 的 特 性生 態 学 的 特 性 生 態 学 的 特 性 イイイ イ 基 本 特 性基 本 特 性基 本 特 性 基 本 特 性 本 来 は 多 年 性 で あ る が 栽 培 上 は 一 年 生 作 物 と し て 扱 わ れ る 。部 分 他 殖 性 の 風 媒 花 で あ り 、通 常 の 環 境 で は 開 花 と 同 時 に 高 率 で 自 家 受 粉 が 行 わ れ る 。 イ ネ は 茎 、 葉 、 根 、 穂 の 各 器 官 で 構 成 さ れ て い る 。 根 は 種 子 根 と 冠 根 に 区 別 さ れ る 。冠 根 は 地 上 部 の 節 部 か ら 発 生 す る 。茎 は 地 上 部 の 骨 格 を な す も の で 、と こ ろ ど こ ろ 節 で 区 切 ら れ 、伸 長 し た 節 間 は 中 空 で あ る 。葉 は 葉 身 と 葉 鞘 か ら な る 。穂 は 茎 の 最 上 節 に つ く 。穂 は 総 状 花 序 型 の 分 枝 を 呈 す6 )_。

ロ ロロ ロ 生 息 又 は 生 息 可 能 な 環 境 の 条 件生 息 又 は 生 息 可 能 な 環 境 の 条 件生 息 又 は 生 息 可 能 な 環 境 の 条 件 生 息 又 は 生 息 可 能 な 環 境 の 条 件 イ ネ の 生 育 時 期 別 の 限 界 温 度 、 最 適 温 度 を 表 １ に 示 す 。 イ ネ の 生 育 最 低 温 度 は 10～ 12 ℃ 、通 常 の 栽 培 可 能 温 度 は 20 ℃ 以 上 で 、 開 花 結 実 に は 22 ℃ を 必 要 と す る 。 逆 に 34 ℃ 以 上 で は 高 温 障 害 が 発 生 す る 。 水 稲 は 湛 水 条 件 (水 田 )で 栽 培 す る 。 元 来 が 水 生 植 物 で あ る イ ネ は 要 求 水 量 の 大 き な 植 物 で あ り 、 灌 水 が な く 土 壌 水 分 が 表 層 土 で 10 %以 下 、 下 層 土 で 12 %以 下 で 干 ば つ 害 が 発 生 す る 。 表 １ イ ネ の 生 育 時 期 別 の 限 界 温 度 、 最 適 温 度 （ 単 位 ： ℃ ） 生 育 時 期 限 界 温 度 生 育 時 期 限 界 温 度 低 高 最 適 低 高 最 適 発 芽 出 芽・苗 立 ち 活 着 葉 の 伸 長 分 げ つ 10 12～ 13 16 7～ 12 9～ 16 45 35 35 45 33 20～ 35 25～ 30 25～ 28 31 25～ 31 幼 穂 分 化 幼 穂 形 成 開 花 登 熟 15 15～ 20 22 12～ 18 － 38 35 30 － － 30～ 33 20～ 25 ハ ハハ ハ 捕 食 性 又 は 寄 生 性捕 食 性 又 は 寄 生 性捕 食 性 又 は 寄 生 性 捕 食 性 又 は 寄 生 性 捕 食 性 、 並 び に 寄 生 性 は 認 め ら れ て い な い 。 ニニニ ニ 繁 殖 又 は 増 殖 の 様 式繁 殖 又 は 増 殖 の 様 式繁 殖 又 は 増 殖 の 様 式繁 殖 又 は 増 殖 の 様 式 ①①①① 種 子 の 脱 粒 性 、 散 布 様 式 、 休 眠 性種 子 の 脱 粒 性 、 散 布 様 式 、 休 眠 性種 子 の 脱 粒 性 、 散 布 様 式 、 休 眠 性種 子 の 脱 粒 性 、 散 布 様 式 、 休 眠 性 及 び及 び及 び 寿 命及 び寿 命寿 命寿 命 イ ネ は 種 子 繁 殖 で あ り 、 熱 帯 に 分 布 す る イ ン ド 型 イ ネ は 比 較 的 脱 粒 し や す い が 日 本 で 栽 培 さ れ る 日 本 型 イ ネ で は 、一 般 に 脱 粒 性 は 低 い６ )_。 イ ネ の 休 眠 性 に は 品 種 間 差 が あ り 、 一 般 に 日 本 型 イ ネ 品 種 で は 秋 に 収 穫 し て 室 温 に 保 管 し た 場 合 、 翌 春 に は 休 眠 は 失 わ れ る 。 種 子 の 寿 命 に 関 し て は 、 低 温 ・ 低 湿 条 件 下 で は 長 期 間 の 保 存 が 可 能 で あ り 、 室 温 下 で も 種 子 水 分 を 9.7 %以 下 に す る こ と で 95%以 上 の 発 芽 率 を 5年 間 、 維

持 す る こ と が で き る７ )_{。 一 方 、 土 壌 中 に 種 子 が 埋 蔵 さ れ た 場 合 、 赤 米} が 3年 以 上 の 寿 命 が あ る の に 対 し 、一 般 の 白 色 米 の 種 子 で は 一 部 に 翌 年 発 芽 す る も の も あ る が 、 大 部 分 の 種 子 が 発 芽 能 を 失 う６ )_。 ②②②② 栄 養 繁 殖 の 様 式（ ひ こ ば え 、塊 茎 、塊 根 、葡 萄 枝 等 ）並 び に 自 然 条栄 養 繁 殖 の 様 式（ ひ こ ば え 、塊 茎 、塊 根 、葡 萄 枝 等 ）並 び に 自 然 条栄 養 繁 殖 の 様 式（ ひ こ ば え 、塊 茎 、塊 根 、葡 萄 枝 等 ）並 び に 自 然 条栄 養 繁 殖 の 様 式（ ひ こ ば え 、塊 茎 、塊 根 、葡 萄 枝 等 ）並 び に 自 然 条 件 に お い て 植 物 体 を 再 生 し う る 組 織 又 は 器 官 か ら の 出 芽 特 性 件 に お い て 植 物 体 を 再 生 し う る 組 織 又 は 器 官 か ら の 出 芽 特 性件 に お い て 植 物 体 を 再 生 し う る 組 織 又 は 器 官 か ら の 出 芽 特 性 件 に お い て 植 物 体 を 再 生 し う る 組 織 又 は 器 官 か ら の 出 芽 特 性 イ ネ は 一 年 生 の 種 子 繁 殖 植 物 で あ る が 、 適 切 な 水 分 や 温 度 条 件 で は 種 子 収 穫 後 も 栄 養 体 を 維 持 で き る 。 こ れ は 、 “ ひ こ ば え ” と 呼 ば れ る 新 し い 分 け つ が 節 か ら 発 生 し 生 長 す る も の で あ る が 、 我 が 国 の 露 地 栽 培 に お い て は 温 暖 地 域 （ 沖 縄 等 ） 以 外 、 通 常 冬 の 低 温 の た め 枯 死 し 、 越 冬 す る こ と は な い 。 ③ ③ ③ ③ 自 殖 性 、 他 殖 性 の 程 度 、 自 家 不 和 合 性 の 有 無 、 近 縁 野 生 種 と の 交 雑自 殖 性 、 他 殖 性 の 程 度 、 自 家 不 和 合 性 の 有 無 、 近 縁 野 生 種 と の 交 雑自 殖 性 、 他 殖 性 の 程 度 、 自 家 不 和 合 性 の 有 無 、 近 縁 野 生 種 と の 交 雑自 殖 性 、 他 殖 性 の 程 度 、 自 家 不 和 合 性 の 有 無 、 近 縁 野 生 種 と の 交 雑 性 性 性 性 及 び及 び及 び及 び ア ポ ミ ク シ ス を 生 ず る 性 質 を 有 す る 場 合 に は そ の 程 度ア ポ ミ ク シ ス を 生 ず る 性 質 を 有 す る 場 合 に は そ の 程 度ア ポ ミ ク シ ス を 生 ず る 性 質 を 有 す る 場 合 に は そ の 程 度ア ポ ミ ク シ ス を 生 ず る 性 質 を 有 す る 場 合 に は そ の 程 度 イ ネ は 自 殖 性 が 非 常 に 高 い 作 物 で あ る 。他 殖 性 の 程 度 を 示 す 情 報 と し て 、開 花 期 間 の 重 複 す る 糯 品 種 と 粳 品 種 と を 用 い た 花 粉 飛 散 に よ る 交 雑 試 験 の 結 果 、 隔 離 距 離 が 4.5 ｍ の 場 合 は 交 雑 率 が 0.6%以 下 、 10m で は 0.04%以 下 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る８ )_{。 し か し 、 北 海 道 立 農} 業 試 験 場 の デ ー タ で は 、 種 子 親 の 低 温 に よ る 雄 性 不 稔 化 処 理 、 強 風 、 大 面 積 の 花 粉 源 等 の 条 件 が 重 な っ た 特 殊 な 状 況 で は 、 600 m程 度 の 長 距 離 交 雑 も 起 こ り う る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 近 縁 野 生 種 で あ る O.nivara、O.rufipogon等 は 、栽 培 イ ネ と 交 雑 可 能 で あ る 。国 外 で は 、 そ れ ら が 自 生 し て い る 地 域 も あ る が 、我 が 国 に 自 生 し て い る と い う 報 告 は な い 。ま た 、自 家 不 和 合 性 及 び ア ポ ミ ク シ ス に つ い て の 報 告 は な い 。 ④④④④ 花 粉 の 生 産 量 、 稔 性 、 形 状 、 媒 介 方 法 、 飛 散 距 離花 粉 の 生 産 量 、 稔 性 、 形 状 、 媒 介 方 法 、 飛 散 距 離花 粉 の 生 産 量 、 稔 性 、 形 状 、 媒 介 方 法 、 飛 散 距 離花 粉 の 生 産 量 、 稔 性 、 形 状 、 媒 介 方 法 、 飛 散 距 離 及 び及 び及 び及 び 寿 命寿 命寿 命寿 命 イ ネ の 穎 花 は 、 １ 葯 当 た り 1000個 以 上 の 花 粉 が 詰 ま っ た 6本 の 葯 を 持 つ 。 花 粉 の 稔 性 は ほ ぼ 100 %、 形 状 は 球 形 で 、 葯 内 で は 粘 質 で 花 粉

塊 を な し て い る が 、葯 が 開 裂 し 始 め る と 花 粉 表 面 が 乾 き 、粘 着 性 が 失 わ れ 、飛 散 し や す く な る 。基 本 的 に 自 家 受 粉 作 物 で 、受 粉 形 式 は 風 媒 で あ り 、葯 は 開 花 (穎 )直 前 に は 開 裂 す る た め 、花 粉 の 多 く は 自 花 の 雌 蕊 に か か る 。 す な わ ち 、 開 花 前 に 自 花 の 葯 か ら 受 粉 し て し ま う た め 、 他 家 ( 花 ) か ら の 風 媒 に よ る 受 粉 は 栽 培 品 種 に お い て は 極 め て 少 数 (１ %以 下 )で あ る1 0 )_{。 花 粉 の 飛 散 に よ る 交 雑 距 離 と し て は 、 上 記 の 様} に 特 殊 な 条 件 下 で は 600 mま で 交 雑 が 認 め ら れ た 例 も あ る が 、 多 く の 報 告 で は 10 m程 度 と さ れ て い る 。 花 粉 の 寿 命 は 一 般 に 3～ 5分1 1 )_{、 最 大} で 10分 程 度 と さ れ る 。 ホ ホホ ホ 病 原 性病 原 性病 原 性病 原 性 病 原 性 は 認 め ら れ て い な い 。 ヘ ヘヘ ヘ 有 害 物 質 の 産 生 性有 害 物 質 の 産 生 性有 害 物 質 の 産 生 性有 害 物 質 の 産 生 性 レ タ ス を 用 い た プ ラ ン ト ボ ッ ク ス 法 に よ っ て イ ネ の ア レ ロ パ シ ー （ 他 感 物 質 を 産 生 す る こ と に よ る 周 囲 の 野 生 植 物 の 生 育 抑 制 ）能 に つ い て 検 討 し た 藤 井 ら の 報 告 に よ る と 、水 稲 の 中 に は 、ア レ ロ パ シ ー を 示 す も の が 存 在 し て い る 。こ の 性 質 は 品 種 間 差 が 大 き く 、特 に ジ ャ ワ 型 の 在 来 品 種 と 赤 米 に お い て 強 い 活 性 を 示 す も の が あ る が 、概 し て 日 本 の 栽 培 品 種 の ア レ ロ パ シ ー 活 性 は 低 い1 2 )_{。他 感 物 質 の 残 存 期 間 は 長} く て 数 ヶ 月 程 度 と 考 え ら れ て い る 。 ト トト ト そ の 他 の 情 報そ の 他 の 情 報そ の 他 の 情 報 そ の 他 の 情 報 障 害 不 稔 が 発 生 す る と 玄 米 の 蛋 白 質 含 量 が 高 く な る1 3_。

２ ． 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 等 に 関 す る 情 報 ２ ． 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 等 に 関 す る 情 報 ２ ． 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 等 に 関 す る 情 報 ２ ． 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 等 に 関 す る 情 報 （ １ ） 供 与 核 酸 に 関 す る 情 報 （ １ ） 供 与 核 酸 に 関 す る 情 報 （ １ ） 供 与 核 酸 に 関 す る 情 報 （ １ ） 供 与 核 酸 に 関 す る 情 報 イ イイ イ 構 成構 成構 成 及 び構 成及 び及 び及 び 構 成 要 素 の 由 来構 成 要 素 の 由 来構 成 要 素 の 由 来構 成 要 素 の 由 来 本 組 換 え イ ネ（ シ ン ク 能 改 変 イ ネ（ CKX2/Gn1a 改 変 イ ネ 系 統 ）O.sativa L.; NIAS16-OSCas-Gn1a） の 作 出 に 用 い ら れ た 供 与 核 酸 の 発 現 カ セ ッ ト の 構 成 及 び 構 成 要 素 の 由 来 を 表 ２ に 示 し た 。 表 ２ 供 与 核 酸 の サ イ ズ と 機 能 構 成 要 素 サ イ ズ (kb) 由 来 及 び 機 能 発 現 カ セ ッ ト 1 ｶﾘﾌﾗﾜｰﾓｻﾞｲｸｳｲﾙｽ 35S ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ(P35S) 1.6 kb カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 由 来 、 35S プ ロ モ ー タ ー を 2 連 結 し た 配 列 ADH 5'UTR 翻 訳 エ ン ハ ン サ ー 領 域 0.1 kb イ ネ 由 来 、 ア ル コ ー ル で ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 5'UTR 翻 訳 エ ン ハ ン サ ー 領 域 配 列 核 移 行 シ グ ナ ル (NLS) 15 bp SV40 （ シ ミ ア ン ウ イ ル ス ） 由 来 、 核 移 行 シ グ ナ ル 配 列 OsCas9 遺 伝 子 (目 的 遺 伝 子 ) 4.0 kb Streptococcus pyogenes 由 来 、 イ ネ の コ ド ン ユ ー セ ー ジ に 最 適 化 し た Cas9ヌ ク レ ア ー ゼ 遺 伝 子 rbcs ﾀｰﾐﾈｰﾀｰ (Tpea3A) 0.3 kb エ ン ド ウ 由 来 、 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit 遺 伝 子 の タ ー ミ ネ ー タ ー 配 列 。 転 写 終 結 を 規 定 発 現 カ セ ッ ト ２ OsU6-2 プ ロ モ ー タ ー (PosU6-2) 0.3 kb イ ネ 由 来 、RNA ポ リ メ ラ ー ゼ III 依 存 型 U6 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 配 列

Guide RNA (Target 配 列 + Guide RNA common) 0.1 kb サ イ ト カ イ ニ ン オ キ シ ダ ー ゼ /デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ ： OsCKX2（ Gn1a遺 伝 子 座 ） 遺 伝 子 中 の 20bpと 、 Cas9 の 足 場 と な る 80bp の キ メ ラ 分 子 PolyT 25 bp PolyT シ グ ナ ル 配 列 発 現 カ セ ッ ト ３ OsACT3’ UTR 1.0 kb イ ネ 由 来 、 ア ク チ ン 遺 伝 子 3'非 翻 訳 領 域 配 列 ｶﾘﾌﾗﾜｰﾓｻﾞｲｸｳｲﾙｽ 35S ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ(P35S) 0.8 kb カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 由 来 、 35S プ ロ モ ー タ ー HPT 遺 伝 子 (HPTII) 1.1 kb 大 腸 菌 由 来 。 抗 生 物 質 ハ イ グ ロ マ イ シ ン B に 耐 性 を 示 す 。 遺 伝 子 組 換 え イ ネ の 選 抜 マ ー カ ー

Oshsp3’ UTR 0.2 kb イ ネ 由 来 、 ヒ ー ト シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン 3'UTR 配 列 hsp ﾀｰﾐﾈｰﾀｰ

ロ ロロ ロ 核 酸 供 与 体 の 性 状核 酸 供 与 体 の 性 状核 酸 供 与 体 の 性 状 核 酸 供 与 体 の 性 状 ・ イ ネ ： 第 一 章 1． 宿 主 ま た は 宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 に 関 す る 情 報 を 参照。 ・エンド ウ： マ メ 科 の 一 ・ 二 年 草 。 広 く 栽 培 さ れ 、 食 用 と な っ て い る 。 古 代 オ リ エ ン ト 地 方 や 地 中 海 地 方 で 麦 作 農 耕 の 発 祥 と と も に 栽 培 化 さ れ た 豆 で 、 原 種 は 近 東 地 方 に 今 日 で も 野 生 し て い る P. humile Boiss. et Noö. と 推 察 さ れ て い る ・ カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス ： 植 物 に 感 染 す る ウ イ ル ス で 、カ リ モ ウ イ ル ス 科 カ リ モ ウ イ ル ス 属 に 属 す 。 ゲ ノ ム は 環 状 二 本 鎖 DNAで あ る が 、 逆 転 写 酵 素 を 持 ち 増 殖 過 程 で RNAを 介 し て 複 製 す る （ パ ラ レ ト ロ ウ イ ル ス ） 。 ・ 大 腸 菌 ： グ ラ ム 陰 性 の 桿 菌 で 通 性 嫌 気 性 菌 に 属 し 、環 境 中 に 存 在 す る バ ク テ リ ア の 主 要 な 種 の 一 つ で あ る 。こ の 菌 は 腸 内 細 菌 で も あ り 、温 血 動 物 （ 鳥 類 、 哺 乳 類 ） の 消 化 管 内 、 特 に 大 腸 に 生 息 す る 。 ・ Streptococcus pyogenes： 化 膿 レ ン サ 球 菌 は 、 レ ン サ 球 菌 属 に 属 す る グ ラ ム 陽 性 球 菌 で 、顕 微 鏡 下 で は 連 鎖 状 の 配 列 を と る 。鞭 毛 を 持 た な い た め 非 運 動 性 で あ り 、 菌 株 に よ っ て は 莢 膜 を 有 す る も の も あ る 。 芽 胞 は 形 成 し な い 。 通 性 嫌 気 性 菌 で あ る た め 、 酸 素 の 存 在 下 で も 、 酸 素 が 存 在 し な い 環 境 で も 生 育 し う る が 、 や や 嫌 気 性 の 環 境 を 好 む 。 ・ シ ミ ア ン ウ イ ル ス 40（ SV40）： ア カ ゲ ザ ル の 培 養 し た 腎 臓 細 胞 か ら 単 離 さ れ た ポ リ オ ー マ ウ イ ル ス の 一 種 。こ の ウ イ ル ス は 実 験 動 物 で が ん の 原 因 と な る こ と が 示 さ れ て い る が 、ヒ ト に お い て が ん を 引 き 起 こ す と い う 証 拠 は な い 。 ハ ハハ ハ 構 成 要 素 の 機 能構 成 要 素 の 機 能構 成 要 素 の 機 能構 成 要 素 の 機 能 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ は 、 表 ２ に 示 し た 発 現 カ セ ッ ト １ の 働 き に よ り 、 S. pyogenes 由 来 の Cas9 遺 伝 子 及 び Guide RNA(gRNA)が 全 組 織 で 発 現 す る 。 カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス (CaMV） 35S プ ロ モ ー タ ー は 、 カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス に 由 来 す る 全 身 発 現 プ ロ モ ー タ ー で あ る 。ま た 、

発 現 カ セ ッ ト ２ の 働 き に よ り 、OsCKX2（ Gn1a）遺 伝 子 中 の 20bp と 、Cas9 の 足 場 と な る 80bp の キ メ ラ 分 子 （ gRNA） が U6 プ ロ モ ー タ の 制 御 に よ り 発 現 す る こ と で 、特 異 的 DNA 標 的 部 位 へ RNA-DNA 塩 基 対 形 成 を 介 し て Cas9 ／ gRNA 複 合 体 を 誘 導 す る 。 加 え て 、表 ２ に 示 し た 発 現 カ セ ッ ト ３ か ら 大 腸 菌 由 来 HPT 遺 伝 子 を 植 物 体 全 体 で 発 現 す る こ と に よ り 、抗 生 物 質 で あ る ハ イ グ ロ マ イ シ ン B（ 以 下 「 ハ イ グ ロ マ イ シ ン 」 と い う 。 ） に 耐 性 を 示 す 。 ニ ニニ ニ 目 的 遺 伝 子 、発 現 調 節 領 域 、局 在 化 シ グ ナ ル 、選 抜 マ ー カ ー 、そ の 他目 的 遺 伝 子 、発 現 調 節 領 域 、局 在 化 シ グ ナ ル 、選 抜 マ ー カ ー 、そ の 他目 的 遺 伝 子 、発 現 調 節 領 域 、局 在 化 シ グ ナ ル 、選 抜 マ ー カ ー 、そ の 他目 的 遺 伝 子 、発 現 調 節 領 域 、局 在 化 シ グ ナ ル 、選 抜 マ ー カ ー 、そ の 他 の 供 与 核 酸 の 構 成 要 素 と そ れ ぞ れ の 機 能 の 供 与 核 酸 の 構 成 要 素 と そ れ ぞ れ の 機 能の 供 与 核 酸 の 構 成 要 素 と そ れ ぞ れ の 機 能 の 供 与 核 酸 の 構 成 要 素 と そ れ ぞ れ の 機 能 a. a. a. a. 発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト 1111（ 目 的 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ）（ 目 的 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ）（ 目 的 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ） （ 目 的 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ） ｲ) カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 35S プ ロ モ ー タ ー （ P35S） カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 由 来 35S プ ロ モ ー タ ー 。目 的 遺 伝 子 を 構 成 的 に 発 現 さ せ る 。 ﾛ） ADH 5' UTR 翻 訳 エ ン ハ ン サ ー 領 域 イ ネ 由 来 ア ル コ ー ル デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 5' 非 翻 訳 領 域 に 存 在 す る 翻 訳 増 強 配 列 。 ﾊ） 核 移 行 シ グ ナ ル (NLS) SV40（ シ ミ ア ン ウ イ ル ス ） 由 来 、 核 移 行 シ グ ナ ル 配 列 。 Cas9蛋 白 質 を 核 へ 移 行 さ せ る 。 ﾆ） OsCas9 遺 伝 子 (目 的 遺 伝 子 ) Streptococcus pyogenes 由 来 、 イ ネ の コ ド ン ユ ー セ ー ジ に 最 適 化 し た Cas9ヌ ク レ ア ー ゼ 遺 伝 子 。 ﾎ) rbcs タ ー ミ ネ ー タ ー (Tpea3A)

エ ン ド ウ 由 来 、 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit 遺 伝 子 に 由 来 す る タ ー ミ ネ ー タ ー 配 列 で あ り 、 構 造 遺 伝 子 で あ る OsCas9 遺 伝 子 の 3'末 端 に 接 続 し て 、 転 写 を 終 結 す る 機 能 を 担 う

配 列 で あ る 。 b. b. b. b. 発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト 2222（ 目 的 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ）（ 目 的 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ）（ 目 的 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ） （ 目 的 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ） ｲ)OsU6-2 プ ロ モ ー タ ー (PosU6-2) イ ネ 由 来 、RNA ポ リ メ ラ ー ゼ III 依 存 型 U6 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 配 列 。 目 的 遺 伝 子 を 構 成 的 に 発 現 さ せ る 。

ﾛ） Guide RNA (Target 配 列 + Guide RNA common) OsCKX2/Gn1a 遺 伝 子 （ Gn1a 遺 伝 子 座 ） 中 の 20bp（ OsCKX2/Gn1a 全 長 5583bp の う ち 、xxx-xxxbp）と 、Cas9 の 足 場 と な る 80bp の キ メ ラ 分 子 ﾊ） PolyT PolyT シ グ ナ ル 配 列 c. c. c. c. 発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト発 現 カ セ ッ ト 3333（ 選 抜 マ ー カ ー 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ）（ 選 抜 マ ー カ ー 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ）（ 選 抜 マ ー カ ー 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ） （ 選 抜 マ ー カ ー 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト ） ｲ) カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 35S プ ロ モ ー タ ー （ P35S） カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 由 来 35S プ ロ モ ー タ ー 。目 的 遺 伝 子 を 構 成 的 に 発 現 さ せ る 。 ﾛ) HPT（ Hygromycin phosphotransferase） 遺 伝 子 大 腸 菌 由 来 、抗 生 物 質 ハ イ グ ロ マ イ シ ン に 対 す る 耐 性 を 付 与 す る 。本 カ セ ッ ト を 導 入 し た 遺 伝 子 組 換 え イ ネ の 選 抜 マ ー カ ー と し て 用 い る 。 ﾊ） ヒ ー ト シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン 3'非 翻 訳 領 域 配 列 (Oshsp3’ UTR) イ ネ 由 来 ヒ ー ト シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン 遺 伝 子 3'非 翻 訳 領 域 配 列 は 、mRNA の 安 定 性 や タ ン パ ク 質 の 翻 訳 を 調 節 し て い る 幾 つ か の 認 識 部 位 が 存 在 し て い る 。 ﾆ) ヒ ー ト シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン タ ー ミ ネ ー タ ー （ Oshsp17.3Ter） イ ネ 由 来 ヒ ー ト シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン 遺 伝 子 タ ー ミ ネ ー タ ー 配 列 は 、構 造 遺 伝 子 で あ る HPT の 3'末 端 に 接 続 し て 、転 写 を 終 結 す る 機 能 を 担 う 配 列 で あ る 。

ホ ホホ

ホ Streptococcus pyogenesStreptococcus pyogenesStreptococcus pyogenesStreptococcus pyogenes 由 来由 来由 来 CRISPR由 来 CRISPR-CRISPRCRISPR--Cas9-Cas9Cas9Cas9 シ ス テ ム に つ い てシ ス テ ム に つ い てシ ス テ ム に つ い てシ ス テ ム に つ い て 本 来 、 CRISPR-Cas9（ Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR Associated Proteins 9） シ ス テ ム は 外 来 性 ウ イ ル ス や プ ラ ス ミ ド へ の 獲 得 免 疫 を 与 え る 微 生 物 の 適 応 免 疫 シ ス テ ム と し て 、細 菌 や 古 細 菌 に お い て 発 見 さ れ た も の で あ る 。近 年 、こ の シ ス テ ム の 発 見 に よ り 、植 物 由 来 の あ ら ゆ る 遺 伝 子 に 対 し て 高 い 効 率 で ノ ッ ク ア ウ ト す る こ と が 可 能 と な っ て い る 1 4 )_。 S. pyogenes 由 来 CRISPR-Cas9 シ ス テ ム を 利 用 し た 標 的 ゲ ノ ム 編 集 は 、 1) エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ と 、短 鎖 gRNA と い っ た 2 つ の 要 素 か ら 構 成 さ れ る 。 エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ は 、 S. pyogenes 由 来 の Cas9 ヌ ク レ ア ー ゼ タ ン パ ク 質 で 、2 つ の DNA 切 断 ド メ イ ン（ RuvC1 と HNH 様 ヌ ク レ ア ー ゼ ド メ イ ン ） を 保 有 し 、 こ れ が 二 本 鎖 の DNA を 切 断 し て 二 本 鎖 切 断 （ DSB） を 誘 導 す る 。

2) gRNA は 設 計 さ れ た 単 鎖 キ メ ラ RNA で あ り 、細 菌 性 tracrRNA の 足 場 機 能 と 細 菌 性 crRNA の 特 異 性 を 併 せ 持 っ て い る 。gRNA の 5'末 端 側 の 最 後 の 20 塩 基 は ホ ー ミ ン グ 装 置 と し て 働 き 、プ ロ ト ス ペ ー サ ー 隣 接 モ チ ー フ（ PAM）の 直 前 に 位 置 す る 特 異 的 DNA 標 的 部 位 へ RNA-DNA 塩 基 対 形 成 を 介 し て Cas9／ gRNA 複 合 体 を 動 員 す る 。 3) PAM 配 列 は 、 生 物 系 統 や CRISPR-Cas9 タ ン パ ク 質 の 種 に よ っ て 異 な り 、 S. pyogenes Cas9 に 対 応 す る 配 列 は 5'-NGG で あ る 。 そ の た め 、 現 在 利 用 可 能 な CRISPR-Cas9 シ ス テ ム は 、 い か な る 5'-N20-NGG DNA 配 列 へ も 配 向 し 、精 度 の 高 い 二 本 鎖 切 断（ DSB）を 産 生 す る こ と が 可 能 で あ る 。 4) 二 本 鎖 切 断 は 、そ の 後 非 相 同 性 末 端 結 合 と 相 同 組 換 え 型 修 復 と い う 、 ほ ぼ 全 て の 細 胞 種 や 生 物 種 に 存 在 す る 2 種 の 修 復 機 能 の い ず れ か に よ っ て 修 復 を 受 け る 。

本 組 換 え イ ネ は 、 上 記 S. pyogenes 由 来 CRISPR/Cas9 シ ス テ ム を 利 用 し 、 gRNA と し て OsCKX2/Gn1a 遺 伝 子 1 5 ) _{上 の 20bp （ 第 1 染 色 体 上 腕} 部 :xxxxxxx-xx）の 複 合 体 を 形 成 さ せ る こ と に よ り 、OsCKX2/Gn1a 遺 伝 子 の エ ク ソ ン 領 域 に 対 す る 切 断 ・ 修 復 の 過 程 に お い て 変 異 誘 発 を 促 し た 系 統 で あ る 。 こ の 変 異 誘 発 に よ る ト リ プ レ ッ ド コ ド ン の 読 み 枠 が ず れ る こ と に よ り 、ス ト ッ プ コ ド ン を 創 生 す る こ と で 、OsCKX2/Gn1aが 遺 伝 子 破 壊 （ ノ ッ ク ア ウ ト ）さ れ た 複 数 の 系 統 を 作 出 し た 。こ れ ら の 系 統 に つ い て 、 隔 離 ほ 場 栽 培 で の 形 態 特 性 及 び 収 量 パ フ ォ ー マ ン ス 等 に つ い て 調 査 し て い く 。 ヘ ヘ ヘ

ヘ OsCKX2OsCKX2OsCKX2 /OsCKX2///Gn1aGn1a 遺 伝 子Gn1aGn1a 遺 伝 子遺 伝 子遺 伝 子 に つ い てに つ い てに つ い て に つ い て

S. pyogenes 由 来 CRISPR/Cas9 シ ス テ ム1 4 )_{に よ り 特 異 的 変 異 挿 入 タ ー} ゲ ッ ト と な っ た OsCKX2/Gn1a（ サ イ ト カ イ ニ ン オ キ シ ダ ー ゼ /デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 2遺 伝 子 ）は 、サ イ ト カ イ ニ ン*_{の 分 解 反 応 を 触 媒 す る 酵 素 を コ ー ド} し て い る 。 本 酵 素 は 側 鎖 を 切 断 し 、 ア デ ニ ン と 側 鎖 由 来 ブ テ ナ ー ル 化 合 物 を 生 ず る 。シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ や イ ネ 、ト ウ モ ロ コ シ 等 で の 研 究 か ら 、CKX は 多 重 遺 伝 子 族 を 構 成 し て お り 、 各 遺 伝 子 で 発 現 場 所 や 発 現 様 式 が 異 な る こ と が 明 ら か に な っ て い る 。OsCKX2/Gn1aは イ ネ の 花 の 分 裂 組 織（ 幼 穂 原 基 ） な ど で 発 現 し て お り 、 既 存 品 種 の 「 ハ バ タ キ 」 で は 、 本 遺 伝 子 の 変 異 に よ り 発 現 レ ベ ル が 下 が る こ と で 、 花 芽 の 分 裂 組 織 中 の サ イ ト カ イ ニ ン 分 解 活 性 が 低 く な る た め 、 サ イ ト カ イ ニ ン 含 量 が 局 所 的 に 増 加 し 、 細 胞 分 裂 活 性 を 高 め た こ と か ら 花 の 数 が 増 加 し 、 結 果 的 に イ ネ の 籾 数 が 増 加 し た も の と 考 え ら れ て い る1 5 )_{。 ま た ノ ッ ク ア ウ ト 型 の 変 異 遺 伝 子 が} 中 国 の「 5150」系 統 で 見 つ か っ て い る 。こ の 系 統 の 形 態 学 的 特 性 と し て 、 「 ハ バ タ キ 」 以 上 の 一 穂 籾 数 や 枝 梗 数 の 増 加 が 報 告 さ れ て い る1 5 )_。 * サ イ ト カ イ ニ ン ： 植 物 ホ ル モ ン の 1種 。 細 胞 分 裂 の 促 進 、 腋 芽 の 活 性 化 な ど の 生 理 活 性 を 持 つ 。ア デ ニ ン の 6位 の 窒 素 原 子 に 炭 素 5つ の プ レ ニ ル 基 を も つ 構 造 が 基 本 骨 格 で あ り 、側 鎖 構 造 の 違 い に よ り ト ラ ン ス ゼ ア チ ン 、イ ソ ペ ン テ ル ア デ ニ ン な ど が 知 ら れ て い る 。

( コ ス モ バ イ オ HP よ り ) 図 １ CRISPR/Casシ ス テ ム に よ る 標 的 遺 伝 ⼦ 切 断 に 必 要 な パ ー ツ gRNA の 末 端 20塩 基 が ホ ー ミ ン グ 装 置 と し て 機 能 し 、 Cas9エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ を 適 切 な 標 的 配 列 へ と 動 員 す る 。そ の 後 、Cas9の 2つ の 切 断 ド メ イ ン に よ り PAM配 列 の 3～ 4塩 基 下 流 に 二 本 鎖 切 断 が 作 ら れ る 。 DSBは そ の 後 、 誤 り を 生 じ が ち な 非 相 同 性 末 端 結 合 経 路 ま た は 鋳 型 依 存 性 の 相 同 組 換 え 型 修 復 に よ り 修 復 さ れ る 。 Cas9 Cas9Cas9 Cas9 = Nuclease sgRNA = sgRNA = sgRNA =

sgRNA = GuideRNA(gRNA)と も い う 。 PAM配 列 (NGG)の 手前 20bpと Cas9の 足 場 と な る 80bpの キ メ ラ 分 子

（ ２ ） ベ ク タ ー に 関 す る 情 報 （ ２ ） ベ ク タ ー に 関 す る 情 報 （ ２ ） ベ ク タ ー に 関 す る 情 報 （ ２ ） ベ ク タ ー に 関 す る 情 報 イイイ イ 名 称名 称名 称 及 び名 称及 び及 び及 び 由 来由 来由 来由 来 pZDgRNAGn1a/Cas9ver2/HPT（ 由 来 の 詳 細 は 、 次 項 に 記 載 ） ロ ロロ ロ 特 性特 性特 性特 性 p35S _HPT Oshsp 3’ UTR polyT OsADH 5’ UTR LB

gRNA pOsU6 2×p35S NLS OsCas9 Tpea3A OsACT_{3’ end 17.3 Ter}Oshsp RB 図 ２ 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ 作 出 に 用 い た 形 質 転 換 用 ベ ク タ ー の 発 現 カ セ ッ ト の 構 造 (11.2kb) （ RB : T-DNA領 域 ラ イ ト ボ ー ダ ー 、 LB : T-DNA領 域 レ フ ト ボ ー ダ ー ） polyT : polyTシ グ ナ ル 配 列 (25bp)

gRNA: Guide RNA (Target 配 列 + Guide RNA common)(0.1kb) pOsU6: OsU6-2プ ロ モ ー タ ー (0.3kb)

2×p35S: カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 35S プ ロ モ ー タ ー (1.6 kb) OsADH 5’ UTR : ア ル コ ー ル デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 5'UTR翻 訳 エ ン ハ

ン サ ー 領 域 配 列 (0.1 kb) NLS: 核 移 行 シ グ ナ ル (15bp)

OsCas9 : イ ネ コ ド ン ユ ー セ ー ジ 最 適 化 Cas9 ヌ ク レ ア ー ゼ 遺 伝 子 （ 4.0kb）

Tpea3A : ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit 遺 伝 子 の タ ー ミ ネ ー タ ー 配 列 （ 0.3kb） OsACT3’ UTR : イ ネ ア ク チ ン 遺 伝 子 3'非 翻 訳 領 域 配 列 （ 1.0kb） p35S : カ リ フ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ イ ル ス 35Sプ ロ モ ー タ ー (0.8 kb) HPT : ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 (1.1 kb) Oshsp3’ UTR: イ ネ ヒ ー ト シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン 17.3遺 伝 子 3'非 翻 訳 領 域 配 列 (0.2 kb) Oshsp17.3Ter : イ ネ ヒ ー ト シ ョ ッ ク プ ロ テ イ ン 17.3タ ー ミ ネ ー タ ー 配 列 （ 1.0 kb）

本 ベ ク タ ー の 基 と な っ た pZD202は 、pIG121-Hmベ ク タ ー の NPTII及 び GUS 発 現 カ セ ッ ト 領 域 に 対 し て 、ポ リ リ ン カ ー 領 域 を 置 換 し た ベ ク タ ー で あ る 。 し た が っ て ベ ク タ ー バ ッ ク ボ ー ン 領 域 の 由 来 は pBR322 を 原 体 と し た pBIN19プ ラ ス ミ ド で あ る 。pBIN19は 、DNA複 製 開 始 点 ori配 列 を 持 つ 2 本 鎖 環 状 DNAで あ り 、 微 生 物 に お い て カ ナ マ イ シ ン 耐 性 を 発 現 し 、 ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 及 び 大 腸 菌 に 伝 達 さ れ る 。 ベ ク タ ー を 有 す る ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム の 感 染 に よ り 、 基 本 的 に は 右 側 境 界 配 列 (RB)と 左 側 境 界 配 列 (LB) に 挟 ま れ た 領 域 の DNA（ T-DNA 領 域 ） が 宿 主 植 物 の 染 色 体 に 伝 達 さ れ る 。 T-DNA領 域 外 に は 植 物 で 機 能 す る 発 現 カ セ ッ ト は 存 在 し な い 。植 物 に 移 入 さ れ た 核 酸 は 交 配 に よ っ て の み 伝 達 さ れ る 。宿 主 で あ る 細 菌 に 哺 乳 動 物 等 に 対 す る 病 原 性 を 付 与 す る こ と は 知 ら れ て い な い 。 （ ３ ） 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 方 法 （ ３ ） 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 方 法 （ ３ ） 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 方 法 （ ３ ） 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 調 製 方 法 イイイ イ 宿 主 内 に 移 入 さ れ た 核 酸 全 体 の 構 成宿 主 内 に 移 入 さ れ た 核 酸 全 体 の 構 成宿 主 内 に 移 入 さ れ た 核 酸 全 体 の 構 成 宿 主 内 に 移 入 さ れ た 核 酸 全 体 の 構 成 バ イ ナ リ ー ベ ク タ ー の 構 成 要 素 は 表 ２ に 記 載 し た 。 ま た 、 ベ ク タ ー 内 で の 供 与 核 酸 の 構 成 要 素 の 位 置 は 図 ２ に 示 し た 。 ロ ロロ ロ 宿 主 内 に 移 入 さ れ た 核 酸 の 移 入 方 法宿 主 内 に 移 入 さ れ た 核 酸 の 移 入 方 法宿 主 内 に 移 入 さ れ た 核 酸 の 移 入 方 法 宿 主 内 に 移 入 さ れ た 核 酸 の 移 入 方 法 ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 に よ っ た 。 ハ ハハ ハ 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 育 成 の 経 過遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 育 成 の 経 過遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 育 成 の 経 過 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 育 成 の 経 過 プ ラ ス ミ ド を 保 持 し た ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム を イ ネ 種 子 胚 盤 由 来 の カ ル ス に 感 染 さ せ 、 ハ イ グ ロ マ イ シ ン （ 40μ g/ml） を 含 む 選 抜 培 地 で 耐 性 遺 伝 子 が 移 入 さ れ た 細 胞 を 選 抜 し 、 再 分 化 さ せ る こ と に よ り 、 遺 伝 子 組 換 え イ ネ 再 分 化 当 代 （ T0） を 得 た 。 こ の T0個 体 群 を 閉 鎖 系 温 室 で 栽 培 、 自 殖 種 子 （ T1 系 統 群 ） を 得 た 。 こ れ ら の 種 子 か ら 発 芽 、 成 長 し た 個 体 を 栽 培 し 、 自 殖 後 代 の 種 子 （ T2系 統 群 ） を 得 た 。 得 ら れ た T1あ る い は そ れ 以 降 の 後 代 に つ い て は 、 そ れ ぞ れ の 系 統 の 種

を 行 っ て い る た め 、 ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム が 残 存 し て い る こ と は な い 。 具 体 的 に は 、 後 代 種 子 か ら 発 芽 し た 植 物 体 を 種 子 ご と 乳 鉢 で す り 潰 し 、 滅 菌 水 を 1ml 加 え け ん 濁 し た 後 、 上 澄 み 100ul を カ ナ マ イ シ ン 、 ハ イ グ ロ マ イ シ ン 、 ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル を 含 む LB 培 地 に 塗 布 し た 。 28 度 で 3 日 間 培 養 後 、 ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 由 来 の コ ロ ニ ー の 有 無 を 調 査 し 、 残 存 性 が な い こ と を 確 認 し て い る 。 本 隔 離 ほ 場 栽 培 で は 、 こ れ ら ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム が 残 存 し て い な い こ と を 確 認 し た 系 統 の T2世 代 以 降 の 種 子 を 使 用 す る 。 ニ ニニ ニ 第 一 種 使 用 等 を 行 う 系 統 に つ い て第 一 種 使 用 等 を 行 う 系 統 に つ い て第 一 種 使 用 等 を 行 う 系 統 に つ い て第 一 種 使 用 等 を 行 う 系 統 に つ い て 本 申 請 は 、 上 記 の 手 順 に よ っ て Oryza sativa L.に 属 す る 複 数 の 品 種 を 原 品 種 に 用 い て 得 ら れ た ゲ ノ ム 編 集 系 統 後 代 を 隔 離 ほ 場 で 栽 培 し 、 以 下 の よ う な 項 目 に つ い て 解 析 す る こ と を 目 的 と し て い る 。 １ ． 隔 離 ほ 場 に 展 開 し た 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ 後 代 に お け る CRISPR/Cas9シ ス テ ム に よ り 創 生 さ れ た 変 異 挿 入 配 列 に 関 す る 調 査 。 ２ ．隔 離 ほ 場 に 展 開 し た 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ 系 統 後 代 の 草 丈 、稈 長 、有 効 分 げ つ 数 等 の 生 育 調 査 。 ３ ． 収 穫 後 の 乾 物 重 量 、 一 穂 籾 数 、 種 子 稔 実 率 、 千 粒 重 等 の 収 量 性 調 査 。 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ 系 統 後 代 で は 、 最 大 40程 度 の 系 統 選 抜 を 目 的 と し た 栽 培 を 計 画 し て い る 。 栽 培 個 体 に つ い て は 系 統 ・ 世 代 が 判 別 で き る 管 理 を 行 う 。 以 降 記 載 す る (4)～ (6)の 情 報 は 、 本 申 請 で 使 用 す る 全 て の 系 統 の も の で は な く 、先 行 し て 得 ら れ た「 北 陸 193号 」を 原 品 種 と し た 一 部 の 系 統 に つ い て 示 し て い る 。 特 に （ ６ ） に つ い て は 、 こ の う ち OsCKX2/Gn1a遺 伝 子 の 開 始 コ ド ン か ら xxx塩 基 目 に「 X」の x塩 基 ○ ○ 変 異 の 導 入 に よ る フ レ ー ム シ フ ト に よ り ス ト ッ プ コ ド ン が 導 入 さ れ 、 OsCKX2/Gn1a全 長 565ア ミ ノ 酸 残 基 の う ち xxx番 目 の ア ミ ノ 酸 残 基 ま で と 、読 み 枠 が ず れ た こ と に よ り

変 化 し た xxxア ミ ノ 酸 残 基 の 合 計 xxx番 目 の ア ミ ノ 酸 残 基 ま で と な る こ と で 、OsCKX2/Gn1aの 機 能 が 破 壊 さ れ た と 推 定 さ れ る 系 統 で あ る「15-23-20a」 を 用 い るが 、以 下 の 理 由 か ら 、生 物 多 様 性 影 響 を 生 じ さ せ る お そ れ が な い と 評 価 す る こ と は 可 能 で あ る と 考 え ら れ る 。 ・ 交 雑 可 能 な 野 生 植 物 が 我 が 国 に は 存 在 し な い こ と 。 ・本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ の 栽 培 が 管 理 さ れ た 極 め て 限 ら れ た 水 田 で 行 わ れ 、 隔 離 距 離 の 確 保 や 持 ち 出 し を 防 止 す る 施 設・措 置 な ど に よ り 、本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ 系 統 後 代 の 、 隔 離 ほ 場 か ら の 散 逸 防 止 策 を 講 じ て い る こ と 。 ・ OsCKX2/Gn1a に つ い て 、「 15-23-20a」 系 統 と 異 な っ た 変 異 （ 欠 失 、 挿 入 等 ）が 導 入 さ れ た 場 合 で も 、OsCKX2/Gn1a 遺 伝 子 の 機 能 が 失 わ れ て い る 「 15-23-20a」 系 統 よ り も 顕 著 な 影 響 を 生 じ る こ と は 想 定 さ れ な い こ と 。 （ ４ ） （ ４ ） （ ４ ） （ ４ ）細 胞 内 に 移 入 し た 核 酸 の 存 在 状 態細 胞 内 に 移 入 し た 核 酸 の 存 在 状 態細 胞 内 に 移 入 し た 核 酸 の 存 在 状 態細 胞 内 に 移 入 し た 核 酸 の 存 在 状 態 及 び及 び及 び及 び 当当当当 該該該該核 酸 に よ核 酸 に核 酸 に核 酸 によよよる 形 質 発 現 のる 形 質 発 現 のる 形 質 発 現 のる 形 質 発 現 の 安 定安 定安 定安 定性性 性性 イイ .イイ... 移 入 さ れ た 核 酸 の移 入 さ れ た 核 酸 の移 入 さ れ た 核 酸 の 複移 入 さ れ た 核 酸 の複複複製 物 が製 物製 物製 物ががが存 在 す る 場存 在 す る 場存 在 す る 場存 在 す る 場 所所所所 ゲ ノ ム DNA を 用 い た PCR 解 析 に よ り 、移 入 し た 核 酸 は 染 色 体 上 に 挿 入 さ れ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。図 3 は HPT 配 列 を 利 用 し た PCR 増 幅 に よ り 導 入 遺 伝 子 の 有 無 を 確 認 し た 結 果 で あ る 。導 入 遺 伝 子 が オ ル ガ ネ ラ ゲ ノ ム 上 に 挿 入 さ れ て い る 場 合 に は 自 殖 後 代（ T1世 代 等 ）の す べ て の 個 体 が 導 入 遺 伝 子 を 持 つ は ず で あ る が 、図 3 に 示 す 様 に 、自 殖 後 代 で 導 入 遺 伝 子 を 持 つ 個 体 と も た な い 個 体 が 分 離 し て 出 現 し た こ と か ら 、移 入 し た 核 酸 が 宿 主 の 染 色 体 上 に 存 在 し て い る と 判 断 さ れ た 。 加 え て 、サ ザ ン ブ ロ ッ ト ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 解 析 の 結 果 、系 統 ご と に 異 な る サ イ ズ の 移 入 核 酸 の バ ン ド が 検 出 さ れ て お り ( 図 ４ ) 、 こ れ は 、 核 酸 が 移 入 さ れ た 宿 主 ゲ ノ ム の 位 置 が 系 統 ご と に 異 な る こ と か ら 、 核 酸 の 移 入 部 位 で の 、プ ロ ー ブ 部 位 の 外 側 に 存 在 す る 制 限 酵 素 認 識 部 位 ま で の 距 離 が 様 々 で あ る こ と を 反 映 し た も の で あ る 。こ れ は 、ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 に よ り 移 入 さ れ た T-DNA が 宿 主 染 色 体 の 任 意 の 位 置 に 移

図 ３ 先 行 系 統（ 15-23-20a）の T1世 代 の 種 子 21 粒 か ら 発 芽 し た 個 体 に お け る 、 HPT 遺 伝 子 の 移 入 の 有 無 。 矢 印 の 位 置 の バ ン ド が PCR 法 で 増 幅 し た 導 入 遺 伝 子 で あ り 、 No.2,8 及 び 12 は HPT 遺 伝 子 を 持 た な い 。 増 幅 箇 所：導 入 発 現 カ セ ッ ト の HPT 遺 伝 子 領 域（ HPT 遺 伝 子 全 長 1.1kb の う ち 約 0.5kb） M:サ イ ズ マ ー カ ー 、 NC ： 原 品 種 （ ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル ） 以 上 か ら 、移 入 さ れ た 核 酸 の 複 製 物 は 宿 主 染 色 体 ゲ ノ ム 上 に あ る と 推 察 さ れ る 。 ま た 、 以 上 の 結 果 よ り 、 今 後 得 ら れ る 系 統 に つ い て も 、移 入 さ れ た 核 酸 の 複 製 物 は 宿 主 染 色 体 ゲ ノ ム に の み 存 在 す る こ と が 推 察 さ れ る 。 ロ ロロ ロ ..移 入 さ れ た 核 酸 の..移 入 さ れ た 核 酸 の移 入 さ れ た 核 酸 の 複移 入 さ れ た 核 酸 の複複複製 物 の コ ピ製 物 の製 物 の製 物 のコ ピコ ピコ ピーーーー 数数数数及 び 複 数 世 代及 び及 び及 び複 数 世 代複 数 世 代複 数 世 代に お け る 伝に お け る 伝 達に お け る 伝に お け る 伝達達達のの 安 定のの安 定安 定安 定性性性性 先 行 し て 得 ら れ た 一 部 の 系 統 の サ ザ ン ブ ロ ッ ト ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン（ 図 ４ ）か ら 、こ れ ら の 系 統 に つ い て は 、ハ プ ロ イ ド 当 た り １ ～ ４ コ ピ ー で あ る と 推 察 さ れ る 。一 般 的 に ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 法 で 宿 主 ゲ ノ ム 上 に 移 入 さ れ る 核 酸 の コ ピ ー 数 は １ コ ピ ー か ら 数 十 コ ピ ー と な る も の ま で あ る 。コ ピ ー 数 が ジ ー ン サ イ レ ン シ ン グ 等 の 効 果 に よ り 、発 現 量 等 に 影 響 を 与 え る こ と は 知 ら れ て い る た め 、仮 に コ ピ ー 数 が 増 加 し て も 発 現 量 は 頭 打 ち に な る こ と が 想 定 さ れ る 。目 的 遺 伝 子 の 発 現 量 と 、そ れ に 伴 う 表 現 形 質 が 重 要 で あ る こ と か ら 、全 系 統 の コ ピ ー 数 自 体 の デ ー タ が な く て も 生 物 多 様 性 へ の 影 響 が な い と 判 断 す る こ と は 可 能 で あ る と 考 え ら れ る 。 NC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 15-23-20a (T₁) HPT 約0.5kb

図 ４ サ ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 を 用 い た 移 入 核 酸 の 検 出 に よ る 、移 入 コ ピ ー 数 の 推 定（ DNA プ ロ ー ブ 配 列 に は 、OsCas9（ 4kb）中 の 1kb の 断 片 を 用 い た ） な お 、 別 途供 試 系 統 の 初 期 世 代 間 で の バ ン ド パ タ ー ンを 調 べ た と こ ろ 、 バ ン ド の分 離 が 認 め ら れ る も の あ っ た が 、 そ れ ぞ れ の バ ン ド の 分 子 量 は 親 の バ ン ド サ イ ズ と 一 致 し て お り 、新 た な バ ン ド は 出 現 し て い な い 。こ の こ と か ら 、移 入 し た 核 酸 は 各 世 代 で 染 色 体 上 に 安 定 に 保 持 さ れ て い る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、導 入 し た OsCas9 発 現 カ セ ッ ト が 分 離 し た 個 体 の 場 合（ レ ー ン 4、 8） 、 発 現 カ セ ッ ト を 示 す バ ン ド は 認 め ら れ な い 。 隔 離 ほ 場 栽 培 試 験 に お い て は 、 導 入 発 現 カ セ ッ ト が 分 離 し た 後 代 系 統 を 使 用 す る 予 定 で あ る 。 ハ ハハ ハ .... 個個個個体体体体 間間間間及 び 世 代 間 で及 び及 び及 び世 代 間 で世 代 間 で世 代 間 での 発 現 のの 発 現 のの 発 現 のの 発 現 の 安 定安 定安 定安 定性性性性 目 的 遺 伝 子 の 発 現 安 定 性 に つ い て 、NIAS16-OSCas-Gn1aの T0及 び T1世 代 の 緑 葉 に お け る ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 を 行 う こ と で 、 同 一 系 統 の 世 代 間 、 個 体 間 で 安 定 し て 発 現 し て い る こ と が 確 認 さ れ た （ 図 5） 。 ま た 、 サ ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 の 結 果 、 導 入 し た OsCas9 発 現 カ セ ッ ト の 分 離 が 確 認 さ れ た 個 体 の 場 合 （ レ ー ン 2、 7） 、 OsCas9 遺 伝 子 の 発 現 は 認 め ら れ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10.0− 4.0− 8.0− 3.0− (kb) プローブ：OsCas9遺伝子断片 制限酵素：SacI 1:15-23-74a 2:15-23-71b 3:15-23-65a（導入発現カセット残存個体） 4:15-23-65a（導入発現カセット分離個体） 5:15-23-58a 6:15-23-55a 7:15-23-20a（導入発現カセット残存個体） 8:15-23-20a（導入発現カセット分離個体） 9:原品種(非組換え体)

図 ５ ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 に よ る 、本 遺 伝 子 導 入 系 統 の 個 体 間 及 び 世 代 間 で の 転 写 レ ベ ル に お け る 発 現 の 有 無 （ RNAプ ロ ー ブ 配 列 に は 、 OsCas9（ 4kb） 中 の 1kbの 断 片 を 用 い た ） ニ ニ ニ ニ .. .. ウウウウイ ル ス の 感 染イ ル ス のイ ル ス のイ ル ス の感 染感 染感 染そ の 他 の 経そ の 他 の 経そ の 他 の 経そ の 他 の 経 路路路路を 経 由 し て 移 入 さ れ た 核 酸を 経 由 し て 移 入 さ れ た 核 酸 がを 経 由 し て 移 入 さ れ た 核 酸を 経 由 し て 移 入 さ れ た 核 酸ががが野 生 動野 生野 生野 生動動動植植植植 物 等 に 伝 物 等 に 伝 物 等 に 伝 物 等 に 伝 達達達達さ れ る お そ れ のさ れ る お そ れ のさ れ る お そ れ のさ れ る お そ れ の あああある 場 合 は 、 当る 場 合 は 、 当る 場 合 は 、 当る 場 合 は 、 当 該該該該伝伝 達伝伝達達達性 の 有 無 及 び性 の 有 無性 の 有 無性 の 有 無及 び及 び及 び 程 度程 度程 度 程 度 我 が 国 に 交 雑 可 能 な 近 縁 野 生 種 が 自 生 し て い な い こ と か ら 、 該 当 し な い 。 （ （ （ （ ５５５５）遺 伝 子 組 換 え の 生 物 等 の）遺 伝 子 組 換 え の 生 物 等 の）遺 伝 子 組 換 え の 生 物 等 の）遺 伝 子 組 換 え の 生 物 等 の 検検検検出 及 び 識 別出 及 び出 及 び出 及 び識 別識 別識 別の 方 法 並 び に そ れ ら の 感の 方 法 並 び に そ れ ら のの 方 法 並 び に そ れ ら のの 方 法 並 び に そ れ ら の感感感度 及 び度 及 び 度 及 び度 及 び 信 頼 信 頼信 頼 信 頼性性性性 供 与 核 酸 の 配 列 に 基 づ い て 設 計 し た プ ラ イ マ ー 対 を 用 い 、PCR を 行 う こ と で 、移 入 遺 伝 子 を 特 異 的 に 検 出 す る こ と が 可 能 で あ り 、そ の 感 度 に つ い て は 、 約 50ng の 全 DNAを 鋳 型 と し て 供 す れ ば 、検 出 可 能 で あ る 。ま た 、サ ザ ン ブ ロ ッ ト ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ る 特 異 的 な 検 出 、識 別 が 可 能 で あ り 、 そ の 検 出 感 度 に つ い て は 、 約 １ μ g の 全 DNAを 用 い れ ば 検 出 可 能 で あ る 。 加 え て 、移 入 遺 伝 子 の 働 き に よ っ て 生 じ た 、タ ー ゲ ッ ト 遺 伝 子 に 挿 入 さ れ た 変 異 は 、仮 に 移 入 遺 伝 子 が 分 離 世 代 で 抜 け 落 ち た と し て も 、挿 入 変 異 部 位 の シ ー ケ ン ス 解 析 に よ り そ の 有 無 を 検 出 可 能 で あ る 。 1 2 3 4 5 6 7 8 OsCas9 4.0 kb－ プローブ：OsCas9 RNAプローブ 1:原品種(非組換え体) 2:15-23-65a（T1導入発現カセット分離個体） 3:15-23-65a（T1導入発現カセット残存個体） 4:15-23-65a（T0導入当代） 5:15-23-20a（T0導入当代） 6:15-23-20a（T1導入発現カセット残存個体） 7:15-23-20a（T1導入発現カセット分離個体） 8:原品種(非組換え体)

（ （ （ （ ６６６６） 宿 主 又 は 宿 主 の 属） 宿 主 又 は 宿 主 の 属） 宿 主 又 は 宿 主 の 属） 宿 主 又 は 宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 と のす る 分 類 学 上 の 種 と のす る 分 類 学 上 の 種 と の 相 違す る 分 類 学 上 の 種 と の相 違相 違相 違 イ イイ イ . . 移 入 さ れ た 核 酸 の. . 移 入 さ れ た 核 酸 の移 入 さ れ た 核 酸 の移 入 さ れ た 核 酸 の 複複複複製 物 の 発 現 に よ製 物 の 発 現 に製 物 の 発 現 に製 物 の 発 現 によよより 付 与 さ れ た 生 理 学 的 又 は 生 態 学り 付 与 さ れ た 生 理 学 的 又 は 生 態 学り 付 与 さ れ た 生 理 学 的 又 は 生 態 学り 付 与 さ れ た 生 理 学 的 又 は 生 態 学 的 特 性 の 的 特 性 の 的 特 性 の 的 特 性 の 具具具具体 的 な 内体 的 な 内体 的 な 内体 的 な 内 容容容容 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ は 、宿 主 と 異 な り 、選 抜 マ ー カ ー 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト の 移 入 に よ り 、抗 生 物 質 ハ イ グ ロ マ イ シ ン に 対 す る 耐 性 が 付 与 さ れ て い る 。 ま た 、 gRNA発 現 カ セ ッ ト の 移 入 に よ り 、 gRNAが 構 成 的 に 転 写 発 現 し て い る が 、 そ の 産 物 は 特 異 的 DNA 標 的 部 位 へ RNA-DNA 塩 基 対 形 成 を 介 し て Cas9／ gRNA複 合 体 を 誘 導 さ せ る も の で あ り 、 ア ミ ノ 酸 へ の 翻 訳 は さ れ な い 。そ の た め 生 理 学 的 ま た は 生 態 学 的 特 性 は 伴 わ な い と 考 え ら れ る 。 加 え て 、 S. pyogenes由 来 OsCas9 遺 伝 子 発 現 カ セ ッ ト の 導 入 に よ り 、 原 品 種 が 保 有 し な い OsCas9 遺 伝 子 の 転 写 レ ベ ル で の 発 現 が 認 め ら れ て い る 。 一 方 で 、 CRISPR/Cas9シ ス テ ム の 働 き に よ り 、 特 異 的 タ ー ゲ ッ ト で あ る OsCKX2/Gn1a 遺 伝 子 へ の 2 本 鎖 切 断 に 伴 う 修 復 過 程 で の 変 異 挿 入 に よ り OsCKX2/Gn1aの 機 能 が 欠 損 す る 、 ま た は 機 能 が 低 下 す る こ と で 、 花 芽 の 分 裂 組 織 中 の サ イ ト カ イ ニ ン 分 解 活 性 が 低 く な る た め 、サ イ ト カ イ ニ ン 含 量 が 局 所 的 に 増 加 し 、細 胞 分 裂 活 性 を 高 め る こ と か ら 花 の 数 が 増 加 し 、 結 果 的 に イ ネ の 一 穂 籾 数 や 枝 梗 数 の 増 加 が 期 待 で き る1 5 )_{。 な お 、} 「 15-23-20a」系 統 の よ う に 、1塩 基 挿 入 の 変 異 が 生 じ た 場 合 に は 、フ レ ー ム シ フ ト が 起 こ り 、機 能 欠 損 と な る こ と が 期 待 さ れ る 。ま た 、低 頻 度 で は あ る が 塩 基 の 置 換 に よ り 、ア ミ ノ 酸 配 列 が 変 化 し た 場 合 に は 、機 能 低 下 と な る こ と も 期 待 さ れ る 。 な お 、既 存 品 種 で あ る「 ハ バ タ キ 」に お い て は 、転 写 レ ベ ル で の 発 現 低 下 を も た ら す変 異 に よ っ て 、OsCKX2/Gn1aの 活 性 が 低 下 し て お り 、中 国 の 「 5150」 系 統 で は 構 造 遺 伝 子 上 の変 異 に よ っ て 、OsCKX2/Gn1aの 機 能 が 欠 損 し て い る 。

ま た 、 CRISPR/Cas9シ ス テ ム の 働 き に よ る 標 的 座 位 （ 標 的 配 列 ） 以 外 の 変 異 挿 入（ オ フ タ ー ゲ ッ ト ）に つ い て 、そ の 特 異 性 を 決 定 す る 20bpの gRNA配 列 の デ ザ イ ン に お い て 、イ ネ ゲ ノ ム 上 で 特 異 性 を 示 す ス コ ア の 高 い 配 列（ オ フ タ ー ゲ ッ ト へ の 変 異 挿 入 が 起 こ り づ ら い 配 列 ）を CRISPR-P ソ フ ト （ http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR ）1 6 )_{で 選 定 し た 。 そ} の 結 果 、選 定 配 列 に 対 し オ フ タ ー ゲ ッ ト の 候 補 と し て 挙 げ ら れ た 配 列 は 存 在 す る も の の 、 そ れ ら の 配 列 の う ち オ フ タ ー ゲ ッ ト ス コ ア が 1.0（ ミ ス マ ッ チ が １ 塩 基 も 無 い 場 合 の ス コ ア は 100） を 超 え る も の は 、 構 造 遺 伝 子 の ア ミ ノ 酸 配 列 に 影 響 を お よ ぼ さ な い イ ン タ ー ジ ェ ニ ッ ク 領 域 や イ ン ト ロ ン 配 列 上 に 変 異 挿 入 を も た ら す 領 域 で あ る こ と を 確 認 し て い る 。 加 え て 後 述 の 通 り 、 申 請 系 統 の 生 理 学 的 又 は 生 態 学 的 特 性 に お い て 、 一 穂 籾 数 や 枝 梗 数 の 増 加 以 外 の 変 化 は 、 こ れ ま で に 認 め ら れ て い な い 。 ロ ロロ ロ . . . . 生 理 学 的 又 は 生 態 学生 理 学 的 又 は 生 態 学生 理 学 的 又 は 生 態 学生 理 学 的 又 は 生 態 学 的 特 性 に つ い て 、的 特 性 に つ い て 、的 特 性 に つ い て 、宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 と の的 特 性 に つ い て 、宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 と の宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 と の宿 主 の 属 す る 分 類 学 上 の 種 と の 間 間 間 間のののの 相 違相 違相 違相 違の 有 無 及 び 相 違 が あの 有 無 及 びの 有 無 及 びの 有 無 及 び相 違 が あ相 違 が あ相 違 が ある 場 合 は そ の 程 度る 場 合 は そ の 程 度る 場 合 は そ の 程 度る 場 合 は そ の 程 度 １１１１ ））） 形 態 及 び 生 育）形 態 及 び 生 育形 態 及 び 生 育形 態 及 び 生 育 のののの 特 性特 性特 性 特 性 先 行 し て 得 ら れ た 系 統 に つ い て 、 温 室 に お け る 観 察 で は 、 登 熟 後 期 の 草 丈 (表 3)、 稈 長 (表 4)、 穂 長 (表 5)、 有 効 分 げ つ 数 （ 表 6） に 示 す よ う に 、特 筆 す べ き 形 態 学 的 差 異 は 認 め ら れ な か っ た 。一 方 、表 7お よ び 9に 示 す と お り 、温 室 で 生 育 さ せ た 本 遺 伝 子 組 換 え イ ネ の 一 穂 当 た り の 1次 枝 梗 数 、 籾 数 は 、 宿 主 の そ れ よ り も 有 意 に 多 い 。 表 3 草 丈 （ 登 熟 後 期 ） 草 丈 (cm) 宿 主 119.2±5.5 NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a 118.4±4.7 宿 主（ 非 組 換 え 体 ）8個 体 、NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a系 統（ 8個 体 ） の 草 丈 の 平 均 値 。 Student t-検 定 の 結 果 、 組 換 え イ ネ 系 統 の 草 丈 は 、 宿 主 の そ れ に 対 し 有 意 な 差 は 認 め ら れ な い （ P=0.43） 。

表 4 稈 長 （ 登 熟 後 期 ） 稈 長 (cm) 宿 主 79.8±4.3 NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a 80.3±5.6 宿 主（ 非 組 換 え 体 ）8個 体 、NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a系 統（ 8個 体 ） の 稈 長 の 平 均 値 。 Student t-検 定 の 結 果 、 組 換 え イ ネ 系 統 の 稈 長 は 、 宿 主 の そ れ に 対 し 有 意 な 差 は 認 め ら れ な い （ P=0.17） ） 。 表 5 穂 長 （ 登 熟 後 期 ） 穂 長 (cm) 宿 主 19.8±1.5 NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a 20.2±2.2 宿 主（ 非 組 換 え 体 ）8個 体 、NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a系 統（ 8個 体 ） の 穂 長 の 平 均 値 。 Student t-検 定 の 結 果 、 組 換 え イ ネ 系 統 の 穂 長 は 、 宿 主 の そ れ に 対 し 有 意 な 差 は 認 め ら れ な い （ P=0.35） 。 表 6 有 効 分 げ つ 数 （ 登 熟 後 期 ） 有 効 分 げ つ 数 (本 ) 宿 主 14.2±5.3 NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a 13.4±7.1 宿 主（ 非 組 換 え 体 ）8個 体 、NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a系 統（ 8個 体 ） の 有 効 分 げ つ 数 の 平 均 値 。 Student t-検 定 の 結 果 、 組 換 え イ ネ 系 統 の 有 効 分 げ つ 数 は 、宿 主 の そ れ よ り も 有 意 な 差 は 認 め ら れ な い（ P=0.67）。 表 7 1次 枝 梗 数 （ 3穂 平 均 ） 1次 枝 梗 数 (本 ) 宿 主 xxxx±xxx NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a xxxx±xxx＊ ＊ 宿 主（ 非 組 換 え 体 ）5個 体 、NIAS16-OSCas-Gn1a 15-23-20a系 統（ 5個 体 ） の 1次 枝 梗 数 の 平 均 値 。 Student t-検 定 の 結 果 、 組 換 え イ ネ 系 統 の 1次 枝 梗 数 は 、 宿 主 の そ れ よ り も 有 意 に 多 い （ **: 有 意 水 準 1 ％ 、 P= 0.821710E-04） 。