九州大学学術情報リポジトリ

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九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

ラットの外因性高コレステロール血症発症の機作とその改善に関する研究

永尾, 晃治

九州大学農学研究科食糧化学工学専攻

https://doi.org/10.11501/3135075

出版情報：Kyushu University, 1997, 博士（農学）, 課程博士バージョン：

権利関係：

(2)

(3)

の

ラットの外肉性高コレステロール血症発症の機作とその改善に関する研究

ノ1<J喝見治

199 8

(4)

第I章序論

ラットの外!大!性向コレステロール血症発症の機作とその改善に関する研究

-ff次ー

第II藍高コレステロール血症発症の機作

第1節コレステロール代謝関連タンパク質の量、活性および遺伝子発現 4頁第2節トリグリセリド代謝関連酵素の活性および遺伝子発現 1

8

第3節ゴルジ装置のリボタンパク質組成

第III章高コレステロール血症発症に及ぼす食事脂肪の影響第1節コレステロール無添加食摂取時の影響

第2節コレステロール添加食摂取時の影響

3 0

3

6頁 4

3頁

第IV章ベルオキシソームプロリファレーターによる高コレステロール血症の改益第1節コレステロール添加食摂取時の影響 5 0頁第2節核内転写因子の発現に対する影響 6 7頁第V章高コレステロール血症発症に関与する遺伝子の検索 7 5頁

第VI章総括 8 4貞

謝辞 8 8頁

文献

8

₉

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第I章序論

近年、食生活の欧米化に伴って日本人の血清コレステロールレベルが上昇していることは周知の事実であり、それが病態レベルまで達した高コレステロール血症は動脈硬化症の最大の危険凶手である。このことはFramingham

strudy [1 J、 Multiple Risk Factor Intervention Trial [2J、 Lipid Research Clinics Program

[3， ₄Jなどの疫学研究、動物実験、臨床研究により明らかにされている。動脈硬化症は、癌、高血圧と並ぶ3大生活習慣病の一つであり、近年の日本における主要な死亡原凶である虚血性心疾患や脳梗塞などを引き起こすことから、高コレステロール血症のより有効な予防や治療法の確立のための基礎実験に適したモデル動物が必要で、ある。

現在、高コレステロール血症発症機作解明のために、ウサギ、サル、ブタなどのモデル動物が利用されている】特に、遺伝子欠損により病態を発症し、家族性高コ

レステロール血症のモデル動物として用いられているWatanabe _heritable

hyperlipidemic

(WHHL)

rabbitが有名である[5J。しかしこれらはいずれも一例体

が大きいため、食事による予防や治療薬開発におけるスクリーニング等の多検体を要する実験に適していないやこれに対し、ラットは遺伝的に確立した系統が容易に入手でき、価格的にも適当であり、比較的小型で、ありながら分析に十分な量の試料を得ることができるという利点を持つ。すでにラットにおいても高コレステロール

血症を呈する幾つかの系統が確立されており、 RICOラット[6J、 JCR:LA-肥満ラッ

ト[7J、 Zukker fattyラット[8Jおよび、無アルブミン血症ラット[9J等が知られている。しかしこれらの系統の病態発症要因は、内因性のコレステロールによるものであり、食習慣による外因性のコレステロールが引き起こす病態とは発症機作が異なると考えられる。実際、食事コレステロールに対して高応答性を示すヒトや応答性が低いヒトがいる。このような応答性の違いは明らかでないが、消化管からのコレステロールの吸収、血清リボタンパク質態コレステロールの分泌と取り込み、

肝臓でのコレステロールの合成・異化および排灘、などが複雑に関与していると思

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われる。

lrnaiとMatsumuraは、 Sprague-Oawley (SD)ラットから、食事コレステロールに対して速やかに応答し、容易に高コレステロール血症を引き起こす系統を分離し、

Exogenously hypercholesterolemic (ExHC)ラットと命名した[10J。現在までの研究によりこのラットでは、経口投与したC-lC]コレステロールの血中からの消失が抑制される、[ 1251 Jβ-VLOLの肝臓への取り込みが低い、肝臓からのコレステロールエステルに富みトリグリセリドの少ないリボタンパク質粒子の分泌がコレステロール摂食に応答して増加する[11， 12Jことなどが示されているo またSakonoらは、

ExHCラットを過剰のビタミンO2で処理し、その後、高コレステロール食を180日間与えることで動脈硬化モデ、ルを作製できること、このラットを用いたモデ、ルで、

大豆タンパク質の動脈硬化病変形成に対する抑制効果を評価できることを示し、

ExHCラットがコレステロール代謝や動脈硬化に対する食事の影響を検討するのに有用な実験動物となりうることを示した[13J。したがって、このラットの食事コレステロールに対する高応答性の原因を探ることで、ヒトでの外国性コレステロールに対する応答のメカニズムや、ひいては動脈硬化に対する食事の影響を理解するための有益な知見を得ることができると期待される。

このExHCラットの安定した高コレステロール血症の発症には複数の遺伝子が関与していると考えられるが[14J、病態の発症とコレステロール代謝、トリグリセリド代謝およびリボタンパク質代謝に関連する遺伝子の発現などとの関係についての詳細な検討は行われていない。そこで本論文第II章では、まずExHCラットの高コレステロール血症発症の機作について、肝臓における脂質代謝関連タンパク質の遺伝子発現の観点から検討を行っている。まず第1節では、コレステロール代謝関連遺伝子のmRNAの発現と、そのタンパク質としての発現について調べたo 第2節では、

トリグリセリド代謝関連酵素の活性および遺伝子発現について調べたo 第3節では、

血清リボタンパク質の前駆休であるゴルジ装置中のリボタンパク質組成について調べた。第III章では、 ExHCラットにおける高コレステロール血症発症に対する、食事脂肪による改善効果について検討を行った。第IV章では、ベルオキシソームプロリファレーターであり、トリグリセリド低下剤として欧米で広く用いられているジエ

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ンフィブロジルを用いて、 ExHCラットの高コレステロール血症の改善効果とその機構について検討を行った。第V章では、 ExHCラットの病態発症に関連する遺伝子の検索を行い、食事による病態発症の予防および改善のためのターゲットとなる遺伝子の検討を行った。

略号

ACAT，アシルコエンザイムA:コレステロールアシルトランスフエラーゼ;

CoA，コエンザイムA;アポA-IV，アポリボタンパク質A-IV;DDフディフアレンシヤルディスプレー;ODT，ジチオスレイトール;ExHC，外因性高コレステロール血症- FAO，フラビンアデニンジヌクレオチド;HOL，高密度リボタンパク質; HMG-CoA

3-ヒドロキシー3-メチルグ、ルタリルコエンザイムA;HPLC，高速液体クロマトグラフィ-;LOL，低密度リボタンパク質;NAD，ニコチンアミドアデ、ニンジヌクレオチド;NADP，ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸;NF-KB， Nuclear factor KB

PCR，ポリメラーゼチエインリアクション;

RAP>

Random arbitary primed; RT，リバーストランスクリプション; SO， Sprague-Dawley; SSC， Standard saline citrate; TLC，薄層クロマトグラフィ-;VLOL，極低密度リボタンパク質

3

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第II章高コレステロール血症発症の機作

第1 fi↑i コレステロール代謝関連タンパク質の量、活性および遺伝子発現

II- 1 - 1 緒言

ExHCラットの病態発症においては、その系統構築の経緯から複数の遺伝子の関与が考えられ[14J、またコレステロールは正あるいは負の制御因子として肝臓のコレステロール代謝関連タンパク質の遺伝子発現に関わっていることが示されていることから[15J、食事からのコレステロールの摂取に対する遺伝子発現の応答は ExHCラットとSDラットで異なっていることが考えられる。

そこでコレステロール代謝関連タンパク質として、コレステロール7α-ヒドロキシラーゼ、 LDLレセプタ一、アポリボタンパク質のmRNA発現に及ぼす食事コレス

テローノレの影響をsoラットとExHCラットで比較した。またそれらのタンパク質の発現量についても検討した。

II-1-2 実験材料および方法

試薬

ヒトβーアクチンcDNAは和光純薬工業(大阪)から購入した。ナイロンメンブレ

ン

(

^Zet

a

_Probem_em_br

a

_ne)はB_ioRad Japan (東京)から購入した。マルチプライム

DNAラベリングシステム、cお1]標識ロバ抗ウサギ抗体(0.5μCi/ml)はアマシャムジャパン(東京)から購入した。[α_32p] deoxycytidine triphosphate

(dCTP， 3，000

Ci/mmol )は1 CN

Biomedicals

(CA， USA)から購入した。[ 4-14Clコレステロール(60 mCi!

mmol)はNEN Research Products (MA， USA)から購入した。放射性コレステロー・

ルはベンゼン:酢酸エチノレ(7:3， v/v)を展開溶媒として用い、 TLCにて純化した

[16J。コレステロールはナカライテスク(京都)から購入した。脂肪酸フリー牛血清アルブ、ミンはMiles Scientific， ICN Immuno Biologicals (IL， USA)から購入した。

実験動物および飼料

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2VÇの雄性ExHCラット(F55-1.1)と6匹の雌性ExHCラット(F55-1.2.3.4.5.6)が

武田薬品工業

(

大阪

^)から1 987年 ^に分与され、

九州大学医学部付属動物実験施設

(福岡)で繁殖、飼育された。 1995年よりセアック吉富(旧成和実験動物研究所、

福岡)で繁殖、飼育された。雄性SDラットはセアック吉富(旧成和実験動物研究所、

福岡^)から購入^した。九州大学農学部食糧化学工学科動物^飼育室 (²2^"'-'2⁵⁰C⁾で、

ラ^ットに市販^の固形飼料 (NM^F、オリ^エンタル酵母^、東京^{) と}脱イオ^ン水^を自由^に摂取させ、 12時間の明暗サイクル(8 : 00点灯、 20 : 00消灯)で予備飼育した。

純化食はAIN76n1に準じて調製した。即ち、重量%で10オリーブ油(ナカライテスク)、 20カゼイン(和光純薬工業)、 15コーンスターチ(日本食品化工、岡

山)、 5セルロース粉末(日本農産工業、東京)、 3.5塩類混合(A IN7

⁶ T

^�

f ^.日本

農

産工業)、 lビタミン混合(A

IN76™.日本農産工業)、 0.3 DL-メチオニン(ナカ

ライテスク)およびショ糖(大日本製糖、東京)で100

[17Jとした。コレステロール食は1%コレステローノレを上記の純化食に添加することで調製したD

無コレステロール食あるいはコレステローノレ食で1週間飼育したのち、ジエチルエーテル麻酔下で大動脈採血により朝10時^から11時^の間^に屠殺^した^。肝臓^を直^ちに摘出後-800Cに冷凍保存した。血液は30分室温放置後氷冷し、 40C、 3，000中mで15 分間遠心し、血清を分離した。コレステロール7αーヒドロキシラーゼ活性の測定には、同様に飼育後、真夜中の1時半から2時半の聞に断頭により屠殺し、直ちに肝臓から調製したミクロソーム画分を用いた。

本実験は九州大学^の実験動物取り扱^い規定^に基づ^いて行われた。

血清および肝臓脂質濃度

血清^のトリ^グリセリド、 ^{コレステロール}、 HDL^{-コレステロール}濃度は市販^の酵素法キット(トリグリセライドG-テストワコー、コレステローノレC-テストワコー、

それぞれ和光純薬工業、 HDL-C2 r第一」、第一化学薬品、東京)にて測定した。

肝臓脂質濃度は、脂質をFolcht.去[18Jにて抽出した後、化学法にてトリグリセリド [19J、コレステロール[20J、リン脂質[21J濃度を測定した。

5

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WLレセプター、コレステロール7α ーヒドロキシラーゼ、アポリボタンパク質

mRNA測定

細胞の総RNAはグアニジンチオシアネート/セシウムクロライドを用いた Chirgwinらの方法[22Jに従って超遠心法により調製した。ノーザンプロッテイン

グ、はThomasの方法[23Jに従って行った。実験に供したcDNAはアマーシャム社のマルチプライムDNAラベリングシステムを用いて[α_32p] dCTP (3，000 CilmmoI)で標識した。ハイブリダイゼーションはアマーシャム社の操作方法に従って行ったD ァポA-IV cDNAは米国ワシントン大学のJ. 1. Gordon博士、アポBcDNAは国立健康・栄養研究所のA.

Matsumoto博士、アポEcDNAはオーストラリアモナシュ大学のG.

Schreibcr博士、 7α-hydro.'\ylasc cDNAは広島大学のM. Noshiro陣士、 LDLレセプター cDNAは米国スタンフォード大学のA. D. Cooper 博士からそれぞれ入手した。

ハイブリダイゼージョン後のメンブレンフィルターは室温で:2x SSC

(0.3M NaCI

O.lM sodium citrate)

- 0.1

(，70 sodiunl dodecyl

sulfate

(SDS)で2回洗浄、ついで650Cで O.:2XSSC (0.03M NaCI，

O.OlM sodium citrate)

^-0.10/0 SDSで4回洗浄後、風乾した。

mRNAシグナルの強さはバイオイメージングアナライザー(BAS-1000，フジ写真フィルム・株、東京)を用いて測定後、 X線フィルムにオートラジオグラフィーを行つ

た(図II-l-1、図11-1-2)。結果は同時にハイブリダイゼーションしたβ-アクチン m時�Aの強さの相対値で表した(データは示さず)。

血清アポリボタンパク質濃度

血清アポA-IVとアポEはロケット免疫電気泳動法[24Jにて測定した。血清アポ

A-IVとアポE濃度は5週齢のSDラットから得た貯蔵血清の希釈サンプルからロケッ

トの高さを比較することで求め、任意の単位として表した。

(11)

ApoA・IV SF lO}lg

.. ___ I

5μE 電量圏直島 SC IOl"g ^.. !

5μg 電車亘旨 EF 10μg彊_ ，

5μg 震璽亘重量富島l

EC 10μg . ^_..

5μg 重量聖塾l

ApoB SF 5μg 轟轟�II

2.5μg z三三三 SC 5μg 檀重重量l

2.5μg 亡ご三

EF 5μg ^E三三�I

2.5μg 亡三三二

EC 5μg ^聾璽璽事 2.5μg --:-:=三三τ

LD L receptor 15μg

7.5μg 15μg 7.5μg

15μg 7.5μg 15μg 7.5μg

ApoE 5μg

2.5μg コμg 2.5μg

コμg 2.5μg

3μg 2.5μg

Fig.II・I・1Slot blot hybri dimuonof hepatic apoAJV，B，E and LDL receptor HERNA SF and SC;SD rats fed cholesterol-free and -containing diets，respective13f

EF and EC;ExHC rats fed cholesterol-free and -containing diets，respect11re ly-

Two different am ount of totalRNAwere blotted for analysis of apo A-IV(lo and 5μg)， LDL receptor (15 and 7.5μg) ， apo B (5 and 2.5μg) and apo E (5 and 2.5μg) mRNA， rcspectively.

7

(12)

Cholesterol 7α-hydroxylase

4.4Kb -

2.3Kb - 2.0Kb -

SF SC EF EC

�

日g.II・I・2 Northern blot hybridization of hepatic cholesterol 7αーhydroxylase mRNA

SF and SC ; SD rats fed cholesterol-frce and -cont出ning diets， respectively.

EF and EC ; ExHC rats fed cholesteroI-free and -containing diets， respectively.

30μg of totaI RNA ，vcrc electroblotted onto nylon membrane.

Cholesterol 7α-hydro.'\ylase mRNA of 3.7 Kb band is indicated by an arrow.

The posi tion of marlωr DNAs with 2.0， 2.3 and 4.4 Kb is shown.

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コレステロール7αーヒドロキシラーゼ活性の測定

ミクロソーム岡分の調製は、肝臓を4倍容の20

mMシステアミン、 4mM塩化マグ、ネ

シ^ウ^ム^を合^む^O^.^lM^リン^酸^カリウ^ム緩^衝液⁽^pH7^.⁴⁾^でホモジ^ナイズ^し^、核^、ミト^コンドリア画分を除去後、超遠心分離(55P-72超遠心機、 RP55T-450ロータ一、目立、

東京: 105，000 ^Xg、

6

0分⁾するこ^とに

^より

行^った

^{。コ}

レ

^{ステロール}

⁷^α ^ー

^ヒ

^ド

^ロキシ

ラー

ゼの活性はCantfortらの方法[25Jに準じて測定した。即ち、 20mMグルコース6-リ

ン酸、 2mM NADPおよび1 IUグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ、 20mMシステアミンおよび4mM塩化マグネシウムを合む0.1 M KCl緩衝液、 pH 7.4の反応液を用い、基質として300μM [4_J4C]コレステロール(0.5μCi/ml、アマシャムジャパン)を

Tween-80 (1.5 ^mg / ^m l ^)を月j

^いて

可溶

^化し

^たも

^の

^を添加

^し、

反応 ^を開始

^し

^た。 3 ⁷

⁰

^C

^の振渥恒温糟で30分間の反応を行い、 20倍容のクロロホルム:メタノール(2:1，v/v)で反応^を停止^し^た^。脂質^は^Folc^h^らの方法 ^[¹⁸^Jで抽出^し^、ベ^ン^ゼ^ン ^: 酢^酸エ^チ^ル⁽ 7:3， V八1)を展開溶媒として用いたTLCにより7α-ヒドロキシコレステロールを分幽後、放射能活性を液体シンチレーシヨンカウンター(Tri-Carb 2250、 Packard Japan、東京)を用いて測定した。

LDLレセプタータンパク質量の測定

ラット

^LDL

レ^セ

^プター

^の

^カ

^ルボ^キ^、^ンル基末端^の

^ア

ミ^ノ酸

¹⁵

残基

⁽

^NH2

^-

Thr-Tyr-Pro

Ser-Arg-Gln-Met-VaトSer二Leu-Glu-Asp-Asp-VaトAla-COOH) [

2

6J

を

合

^む

多抗原性

^ペプ

チ

^ド

^[2

⁷

^Jの合成

^を

イワ^キ硝子

⁽

千葉⁾

^に

依託

^した。

こ^の

^ペ

プ

^チドを

用^いてL

^DL

レセプ

^タ

^ーのポ

^リ

^クロー^ナルの抗血清

^を

日本白色

^ウサギ

か^ら調製^し

^た

^。即^ちペ

^プチ

^ド

² mgとAdjuvant Complete Freund (DIFCO Lab.、 MI、 USA)1 mlを混合し、超音波

破砕機^でエ

^マ

^ルジ

^ョンに

^して

^{、ウサギ}

^の背中

^に

皮内注射^し

^た

^。そ^の

²

週間後から

² 週間おきにペプチド0.5 mgとAdjuvant Incomplete Freund (DIFCO Lab.)

1

mlのエマルジョンを同じウサギの背中に皮下注射し、計5回追加免疫を行った。最後の追加

免疫^の1 週間^後にネンブ^タール麻酔後^、腹部大動脈^より採血^し抗血清^を得^た。

肝臓の膜両分^タン^パク質はC^osgroveらの方法で調製し、可溶化した [28J ^。可溶

9

(14)

化した膜i両分タンパク質(500μg)を7. 5%ポリアクリノレアミドゲル電気泳動によって分画後、 0.8mA/cm2、 1.5時間でエレクトロプロッテイング装置(semi-dry transf er equipment BE-300、 Biocraft、東京)を用いてナイロンメンブレンに転写した。メンブレンを5%脂肪酸フリー牛血清アルブミンでブロッキング後、 LDLレセプター抗血清の200倍希釈溶液でインキュベートした。ついでC25I]標識ロバ抗ウサギ抗体(

0.5μCi / mI)でインキュベートした。他の報告とほぼ一致する[28， 29J、分子

約135，000のバンドをLDLレセプタータンパク質として同定し、バイオイメージングアナライザーを用いてLDLレセプター量を測定した(図II-1-3、図II-1-4)。

統計解析

結果はDuncan's nc\\' multi ple-range test [30Jおよびラットの系統(s)、

食事コレステロール(C)および交互作用(S x C)の影響を二因子分散分析法 [31Jにより解析した。危険率5%以下を有意とした。

II- 1 -

³ _結果体重増加量、摂食-

1週間の飼育期間中の体重増加量、摂食量には系統および食事コレステロールの有無の影響は認められなかった(データは示さず)。

血清、肝臓脂質濃度

表II-l-1にラットをコレステロール添加あるいは無添加の純化食で1週間飼育した時の血清および肝臓の脂質濃度を示した。血清コレステロール濃度は、食事コレステロールを添加したExHCラットでのみ上昇し、 SDラットでは上昇しなかった。血清トリグリセリド、濃度への食事コレステロールの影響は顕著ではなかったが、 SDラッ

トでExHCラットよりも高い値を示した。肝臓の総コレステロールおよび、遊離コレステロール濃度は食事へのコレステローノレ添加により上昇したが、系統による違いは見られなかった。肝臓トリグリセリド濃度は、コレステロール添加の影響を受けなかったが、 SDラットでExHCラットよりも顕著に高い値を示した。肝臓リン脂質

(15)

199000-

120000- 87000-

3000

2000

1000 ω=-偲降、同め晶

ハUAU

1200 ハUAV

AU --i

800 Protein

(μg)

600 400

200

Fig.II・I・3 Intensities of immunoblotting of LD L receptor protein with an increase of blotted proteins

Liver membrane proteins (93， 186， 373， 745 and 1118μg) were electroblotted onto nylonmembrane， and the membrane was treated as described in the

MA TERIAL AND MEfHODS

(the upper panel).

Strength of radioactivities

(PSL

value : photo stimulated luminescence value) was dependent on the amount of membrane proteins applied (the lower panel)， and followed the following

equation: y ⁼0.892x+1.44*10-3x2+2.10*10-7x3-98.4 (r=1.00).

11

(16)

SF SC EF EC 199000-

120000- 87000-

Fig.II・1・4 Immunoblotting of hepatic LDL receptor protein SF and SC : SD rats fed cholesterol-free and -containing diets， respectively.

EF and EC ; ExHC rats fed cholesterol-free and -containing diets， respectively.

500μg of the membrane proteins were electroblotted onto nylon membrane.

(17)

Table 11-1-1 Serum and liver lipids in ExHC and SD rats

Serum lipids (mg/dl) Cholesterol

Triglyceride Hepatic lipids (mg/g)

Total cholesterol Free cholesterol Triglyceride Phospholipid

Groups

SF SC EF EC

133:1::10a 142:1:: 9a 127:t 6a 338:t29b 251:t49a 209:1::17ab 165:t16ab 125:t16b

3.81:t0.36a 20.2:t1.3b 3.24:tO.88a 22.4:t1.7b 1.48:t0.18a 3.09:tO.58b 1.32:tO.03a 3.74:tO.72b 65.7:t4.9a 79.3:1::18.1 a 8.61:1::0.32b 21.2:t0.7b 27.4:1::0.9 25.8:t1.5 26.8土0.4 26.6:t1.2

SF and SC， SD rats fed cholesterol-free and -containing diets， respectively.

EF and EC， ExHC rats fed cholestβrol-free and -containing diets， respectively.

Values are means :t SEM for five rats per group. NS means no significant difference.

Values with different superscript letters show significant difference at Pく0.05.

ANOVA

Strain Cholesterol S X C

(S) (C)

Pく0.05 Pく0.05 Pく0.05 Pく0.05 NS NS

げ--1⁴ NS Pく0.05 NS

NS Pく0.05 NS Pく0.05 NS NS

NS NS NS

(18)

濃度は、系統や食事コレステロールの影響を受けなかった。

肝臓mRNA量および血清、肝臓タンパク質発現量

表II-1-2に1%コレステロール添加および無添加の純化食で1週間飼育したラット肝臓のコレステロール7α-ヒドロキシラーゼ、 LDLレセプター、アボタンパク質の

mRNA量およびそれらのタンパク質の肝臓または血清中の発現量を示した。コレステロール添加によりExHCラットのコレステロール7αーヒドロキシラーゼ、mRNA

は増加し、 LDLレセプタ-mRNA貴は低下した。これらの影響はSDラットでは観察されなかった。食事コレステロールの有無に関わらず、コレステロール7αーヒドロキシラーゼmRNA量はExHCラットで高く、 LDLレセプタ-mRNA量はExHCラツトで低かった。食事コレステロールはアポA-IV、 B、 EのmRNA置に影響しなかったが、アポA-IV mRNA量はExHCラットでSDラットと比較して低い値を示した。

肝臓のコレステロール7α-ヒドロキシラーゼ活性は、食事コレステロールにより増加しExHCラットで高い値を示した。肝臓のLDLレセプタータンパク質量は、系統や食事コレステロールの影響を受けなかった。血清アポA-IV濃度は、食事コレステロールによる影響を受けなかったが、 Eオ-ICラットでSDラットよりも低い値を示した。血清アポE濃度は、両系統ラットで食事コレステロールにより低下した。

II-1-4 考察

Hortonらは、コレステロール食を合む同じ食事をSDラットとハムスターに与えたとき、ラットではコレステロール7α-ヒドロキシラーゼのmRNA置と活性が増加し

たが、ハムスターではそのような応答が見られないことを示した[32J。これらの結果から、彼らはハムスターがコレステロールに対して感受性が高く、血清コレステロール濃度上昇が見られるのはコレステロールによる本酵素の誘導が起こらないからであると主張している。本実験では、肝臓におけるコレステロール異化の律速醇素であるコレステロール7α-ヒドロキシラーゼ、のmRNA量および活性が、食事コレステロールによりExHCラットでSDラットにくらべ顕著に増加する事を示した。

しかし、糞中への胆汁酸の排液量に両系統ラットで違いが見られず[33J、また

(19)

Table 11-1-2 Hepatic mRNA abundance， activities of cholesterol 7α-hydroxylase and LDL receptor protein mass，

and serum apolipoprotein abundance in ExHC and SD rats

Groups ANOVA

SF SC EF EC Strain Cholesterol S X C

(S) (C) mRNAs (arbitrary unit)

7α-hydroxylase 100:t26a 127土13a 165:t17a 378:t60b Pく0.05 Pく0.05 P.く0.05 LDL receptor 100:t 8a 100:t 5a 75. 2::t4. 2b 56.9:t2.1 c Pく0.05 NS NS

Apo A-IV 100:t 7a 109:t 8a 72.3:t2.7b 75.7:t4.4b Pく0.05 NS NS

Apo 8 100土15 121:t13 96.2:t12.4 111:t18 NS NS NS

ApoE 100:t 5 114:t 3 98.8土3.4 109:t 6 NS NS NS

Hepatic proteins

7α-hydroxylase (nmol/hr/mg protein) 0.393:t0.051 a 0.660:tO.080b 0.645:tO.036b 1.03:tO.06c P.く0.05 Pく0.05 NS LDL receptor (arbitrary unit) 100:t13 111:t 5 114:t 7 106:t 5

Serum apoproteins (arbitrary unit)

Apo A-IV 100:t 9a 102:t 9a 78.6:t3.6b 72.5:t1.6b ApoE 100土 6a 51.1:t4.9b 100:t14a 55.0:t1.9b

EF and EC， ExHC rats fed cholesterol-free and -containing diets， respectively.

Yalues are means :t SEM for five rats per group. NS means no significant difference.

Values with different superscript letters show significant difference at P く 0.05.

NS NS NS

Pく0.05 NS NS NS Pく0.05 NS

V"'.

(20)

ExHCラットでSDラットよりもコレステロール負荷後の血清コレステロール濃度は高いことから、 ExHCラットの高コレステロール血症発症に本酵素は重要な役割を演じていないと考えられた。従って、 ExHCラットにおける食事コレステロールに対する高感受性は、ハムスターの場合におけるそれとは異なった機構によって制御されていると考えられた。

なお、食事コレステロールに対するコレステロール7αーヒドロキシラーゼ活性の増加は両系統ラットにおいて同程度であるにも関わらず、 mRNAの発現はSDラットの27%に比べExHCラットでは2.7倍もの増加が見られたことから、両系統ラットにおける本遺伝子の転写後および翻訳後の調節機構は異なっていると考えられた。

本実験では、肝臓へのコレステローノレ取り込みに関係するLDLレセプターの mRNA量は、食事コレステロールによりExHCラットでSDラットにくらべ顕著に低

する事を示した。食事コレステロールによるLDLレセプタ-mRNA最のダウンレギユレーションはマウス[34J、ハムスター[32J、ウサギ[35J、サル[36Jで報告されているが、 SDラットではそのような応答は認められていない[32J。本実験でもSDラットではコレステロール負荷に伴うLDLレセプタ-mRNAレベルの低下は認められなかった。上述のコレステロール 7 αーヒドロキシラーゼ、mRNA量の顕著な上昇と考えあわせると、 ExHCラットにおけるコレステロール代謝に関わるタンパク質の遺伝子発現システムは食事コレステロールに対して極めて感受性が高いといえる。しかしながらLDLレセプタ-mRNA量の違いは、このタンパク質量には反映されなかった。従って、 ExHCラットにおけるコレステロール負荷に対する高感受性をLDLレセプタータンパク質の発現量の面から説明することはできない。

Roachらも食事コレステロールによってSDラットでLDLレセプタータンパク質が影響を受けなかったと報告している[37J。しかしこの場合のLDLレセプタータンパク質量とは、リボタンパク質に対するレセプターの親和性の違いや、実際にリボタンパク質の取り込みに関与している細胞膜表面のレセプターの存在量などを

確に反映しないため[38， 39J、肝臓でのリボタンパク質の取り込みの程度を必ずしも意味しない[32J。実際、 ImaizumiらはlTI V1VOや初代培養肝細胞を用いた実験においてβ-VLDLの肝細胞への取り込みはExHCラットでSDラットと比較して低い

16

(21)

ことを示していることからも[11J、 E泣-ICラットの高コレステロール血症発症には、レセプターのリポタンパク質に対する親和性、細胞膜表層と細胞内との聞でのレセプターのリサイクリングの変化などが関与している可能性は残っている。

本実験では、肝臓のアポA-IVmRNAレベルがSDラットに比べExHCラットで低していている事を示した。 LeBoeutらは留歯類や鳥類における肝臓のアポA-IV発現と肝臓トリグリセリドの蓄積と分泌の研究から、アポA-IVはトリグリセリドの VLDLとしてのパッケージングに必要であると示唆している[40J。それゆえに、

本遺伝子の発現低下が肝臓トリグリセリド濃度の低下と相乗的に作用する事で、第 II章第3節に示すように、コレステロールエステルに富むß -VLDLの形成増加 [12Jを介して、 ExHCラットの高コレステロール血症発症に関与している可能性がある。なお本実験では、 VLDLやLDLの構成タンパク質であるアポBやアポEの mRNA量はラットの系統や食事コレステローノレの影響を受けなかった。

II-1-5 小括

ExHCラットとSDラットで肝臓のコレステロール代謝関連タンパク質の量、活性

と遺伝子発現に及ぼす食事コレステロールの影響について検討した。食事コレステロールに応答してExHCラットのコレステロール7αーヒドロキシラーゼmRNA量は

増加し、 LDLレセプタ-mRNA最は低下した。肝臓のコレステロール7αーヒドロキ

シラーゼ活性は、食事コレステロールにより増加しExHCラットで高い値を示した。

肝臓のLDLレセプタータンパク質量は系統や食事の影響を受けなかった。従って、

ExHCラットにおける食事コレステロールに対する高応答性をこれらコレステロール代謝関連タンパク質の量や活性に関連づけて説明することはできなかった。

アポB、 EmRNA量は系統や食事コレステロールの影響を受けなかった。アポA- IVmRNA量は食事コレステロールの影響を受けなかったが、 ExHCラットでSDラッ

トよりも低かった。肝臓のトリグリセリド濃度もExHCラットで低かった。血清アポA-IV濃度は、食事コレステロールによる影響を受けなかったが、 ExHCラットで SDラットよりも低い値を示した。血清アポE濃度は、両系統ラットで、食事コレステ

ロールによりイ広;下した。

17

(22)

第2節トリグリセリド代謝関連酵素の活性および遺伝子発現

II-2- 1

治者百

Sakonoらは、コレステロール負荷ExHCラットはコレステロールに富みトリグリセリドが少ない、 β-VLDL様のリボタンパク質を肝臓から分泌するする事を報告した[12J。前節にも示した通り、 ExHCラットにおいて肝臓でのトリグリセリド濃度はSDラットに比べて顕著に低い値を示した。コレステロールに富みトリグリセリドが少ないβ-VLDLのln VIVQでの血中からの消失は、通常のVLDLと比較して遅い

ことが知られている事から[41 J、 ExHCラットでの高コレステロール血症の原因には、肝臓で生成するβ-VLDL様のリボタンパク質の構造が関係している可能性がある。 ExHCラットの肝臓におけるトリグリセリド低下のメカニズムを探るため、

本節では肝臓トリグリセリド濃度に影響を与えると考えられる肝臓脂肪酸合成系、

ß-酸化系、トリグリセリド、合成系酵素活性とその遺伝子発現について検討した。

II-2 -2 実験材料および方法

試薬

トリトンX-100 、 L-リンゴ酸、 DTT、 5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DTNB) はナカライテスクから、アセチノレCoA、マロニノレCoA、パルミトイノレCoA、 L-カルニチン、 CoA、 FAD、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリンはSigma Chemical Co.

(MO，

USA)から、 NADP、 NADPH、 NAD及びグノレコース6 -リン酸はオリエンタル酵母工業から、 6-ホスホグルコネイトデヒドロゲナーゼ、はBoehringer

Mannheim GmbH (Germany)から購入した。 18SリボソームRNA cDNAは American Type Culture Collection (MD， USA)からH薄入した。

第II章第1節と同様の食事でExHCおよびSDラットを1%コレステロール添加及び、

無添加の純化食で1週間飼育した。大動脈採血により午前10時から1 1時の間に屠殺を行い、血清と肝臓を採取した。

18

(23)

細胞画分の調製

肝臓を氷冷下で6倍容の 0. 25M煎糖と1mMEDTAを合む10mMトリス塩酸緩衝液(

pH7.4)でホモジナイズ後、 700Xgで10分間遠心した上清を、さらに10，000X gで10 分間遠心分離することにより、ミトコンドリア画分を沈殿させた。その上清を 125，000 X gで60分間遠心分離し、上清の細胞質画分及び沈殿したミクロソーム画分

を得た。各回分のタンパク最はLowry法で定量した[42J。

Fatty acid synthase活科:の測定

脂肪酸合成酵素活性はKeI1eyらの方法で測定した[43J。即ち、最終濃度0. 05mM アセチノレCoA、 O.3mM NADPHおよび0.2mM EDTAを合む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に細胞質問分(タンパク量約0. 7mg)を添加し、

NADPHの減少を30

OC、 340nmで1.5分間追跡し(ブランク)、その後マロニノレCoA(最終濃度0.2mM) を加えて混合し、さらに 5分間追跡した(総量1mL)。マロニノレCoA添加時に得られた吸光度の減少からブランクの吸光度の減少を差し引くことにより、次のように NADPHの減少速度を求め、酵素活性を計算した。活性( nmol/rrtin/mgprotein) ⁼

{

(反応時の吸光度の減少ーブランクの吸光度の減少)/6，220} X 109 X (反応液量 ml / 1000) X (1 /測定時間min)X (1 /タンパク量 mg)。なお、 6.220はNADPH のモル吸光係数である。

Glucose 6-phospha te dehydroxylase活性の測定

グ戸ルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、 Kelleyらの方法で測定した[44J。

即ち、最終濃度3.3mMグ、ルコース6-リン酸、

1.6mM NADP、 0.5U 6-ホスホグ、ルコネ

イトデヒドロゲナーゼ、および、30mM塩化マグネシウムを合む160mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)に細胞質画分(タンパク量約0.35mg)を添加し、生成したNADPHの増加を300C、 340nmで 3分間吸光度を追跡し(総量1mL)、得られた吸光度の増加から次のように NADPHの生成速度を求め、酵素活性を計算した。活性( nmol!min/mg

protein)

=

(吸光度の増加/6，220)X 109

X

(反応液量 mL

/

1000) X (1 /測定時間

19

(24)

min) x (1 / タンパク量mg) x (1/ 2)。なお、全体を2で割つであるのはグルコース6-リン酸1分子からNADP+2分子が転換されるためである。

Malic enzyme活性の測定

リンゴ酸酵素活性は、 Ochoaらの方法で測定した[45J。即ち、最終濃度

1.2mML-リンゴ酸、 4mM塩化マンガン、 1.2mMNADPを合む64mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.4)に細胞質画分(タンパク量約0.56mg)を添加し(総量

1mL)、 270C、 340nmで2分間吸光度を追跡し、得られた吸光度の増加lから次のようにNADPHの生成速度を求め、酵素活性を計算した。活性(nmol!mÌn/mg proteÌn )

= (吸光度の増加/ 6，220)X 109 x (反応液量mL/ 1000) x (1 /反応時間min)

x (] / タンノミク民mg)。

Phospha tida te phosphohydrolase活性の測定

ホスファチジン酸ホスホヒドラーゼ活性は、 Waltonらの方法で測定した[46J。

即ち、最終濃度J.OmMホスファチジン酸と1.0mMホスファチジルコリン(0.9%塩化ナトリウムを用いて超音波処理により混合させたもの)および、 1.25mM EDTAを合む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.0)に3.25mM塩化マグネシウム添加もしくは無添加の条件で、ミクロソーム(タンパク量約O.l2mg)を添加し370C、 15分間インキュベートした(総容量0.2mL)。反応液に0.8mLの発色液(0.13%ラウリル硫酸ナトリウム、 1.25%アスコルビン酸、 0.32%モリブデン酸アンモニウム四水和物及び

O.375M硫酸の水溶液)を加え、 450Cで20分間インキュベートすることにより反応生成物である無機リンを発色させ、 820nmで吸光度を測定した。ホスファチジン酸とホスファチジ、ルコリンが入っていない反応によりミクロソームからのリンの産生阜、

ミクロソームが入っていない反応によりホスファチジン酸とホスファチジルコリンからのリンの産生量を測定した。それらをブランクとして差し引くことにより次のように反応生成物である無機リン量を求めた。無機リン産生量(μg) =反応によるリン産生量一(ミクロソームからのリンの産生量+ホスファチジン酸とホスファチ

ンルコリンからのリンの産生量)。求めた無機リン産生量から次のように酵素活性

20

(25)

を計算した。 PAP活性(nmol!min/mgproteÌn) =無機リン産生量X 103 X ( 1 /

30.97) x (] /15min) x (1 /タンパク量 mg)。なお、リンの原子量を30.97とした。

Camitine palmitoyJ transferase活性の測定

カルニチンパルミトイルトランスフエラーゼ活性は、 Marl刊rellらの方法で測定した[47J。即ち、最終濃度0.0375mMパルミトイノレCoA、 0.25mMDTNB、 1.25mM EDTAおよび0.1%トリトンX-I00を合む58mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)にミトコ

ンドリア(タンパク量約0.52mg)を添加し、 270C、 412nmで5分間吸光度を追跡し (ブランク)、その後しカルニチン(最終濃度1.25mM)を添加し、 CoAの生成を5

分間追跡した(総容量lmL)0 L-カルニチン添加時に得られた吸光度の増加からブランクの吸光度の増加を差し引くことにより、次のようにCoAの生成速度を求め、

醇素活性を計算した。活性(nmollmin/mgprotei n)二{ (反応時の吸光度の増加

ブランクの吸光度の増加) / 13，600

} x

109 X (反応液量ml / 1000)

x

(1 /反応時間 min)

x

(1 /タンパク量mg)。なお、 13，600はCoAのモル吸光係数である。

PeroxisomaJ ß-oxida tion活性の測定

ベルオキシソームのß-酸化活性は、 Lazarowの方法で測定した[48J。ミトコン

ドリアの脂肪酸酸化系の初発酵素であるアシルーCoA脱水素酵素は、シアンなどの電子伝達系阻害剤によって酵素活性が阻害されるが、ベルオキシソームの系はこれらによって影響を受けない。よってこのベルオキシソーム系のシアン非感受性を利用して、シアン存在下においてß-酸化活性の測定を行う。即ち、最終濃度O.2mM

NAD、 1mM DTT、 75μg/mL牛血清アルブ、ミン、 100μg/mLトリトンX-100、 O.lmM CoA、 O.OlmM FADおよびlmMシアン化カリウムを合む47mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.0)にミトコンドリア(タンパク量約0.26mg)を添加し、 370C、 340 nmで3分

間吸光度を追跡した(ブランク)。その後、 1mMパルミトイノレCoA(最終濃度

O.OlmM)を混合し、 NADHの生成を5分間追跡した(総容量lmL)。パルミトイル CoA添加時に得られた吸光度の増加からブランクの吸光度の増加を差し引くことに

より、次のようにNADHの生成速度を求め、酵素活性を計算した。活性(nmol!min/

11

(26)

mg protein)二{ (反応時の吸光度の増加ーブランクの吸光度の増加)/6，220} _X109

x (反応液電m₁/ 1000) _x (1 /測定時間min)_x (1 /タンパク最mg)。なお、

6，220はNADHのモル吸光係数である。

肝臓mRNA発邸主iの測定

第II章第1節と同様の方法により測定した。

リンゴ、酸酵素cDNA [49J、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼcDNA [50J、

脂肪酸合成醇素cDNA [51Jは帝塚山学園大の入谷信子教授から入手した。

統計解析

第II�第1節とIrij段に行った。

II-2-3 結果

肝臓におけるトリグリセリド代謝関連酵素活性

表II-2-1に1%コレステロール添加および無添加の純化食で1週間飼育したラット肝臓のトリグリセリド代謝関連酵素の活性を示した。脂肪酸合成酵素の活性は、食事コレステロールによる影響を受けなかったがSDラットに比べExHCラットにおいて低い値を示したD 一方、脂肪酸合成系にNADPHを供給するグルコース6-リン酸デ

ヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸酵素活性には、系統および食事による影響は見られなかった。トリグリセリド合成系の律速酵素と考えられるホスファチジン酸ホスホヒドラーゼ活性は、 Mg2+依存性ではSDラットに比べExHCラットにおいて低い値を不し、 Mg2+非依存性ではSDラットに比べEオ-ICラットにおいて高い値を示した。

Mg2+{:衣存性、非依存性ともに、食事コレステロールによる影響は受けなかった。ミ

トコンドリアでのβ-酸化の指標となるカルニチンパルミトイルトランスフエラーゼ活性は、食事コレステロールによる影響を受けなかったがSDラットに比べExHCラットにおいて高い値を示した。ベルオキシソームのβ-酸化活性は、食事コレステロー

ルによる影響を受けなかったがSDラットに比べExHCラットにおいて低い値を示した。

(27)

Table 11-2-1 Activities of enzymes related to triglyceride metabolism in ExHC and SD rats

Groups ANOVA

SF SC EF EC Strain Cholesterol S X C

Fatty acid synthase Malic enzyme

Glucose 6-phosphate dehydrogenase Phosphatidate phosphohydrolase

恥192+ーdependent

35.4:i:2.3 ac 87.6:i: 7.8 105:t8 18.0:i:Ü.5

nmol/min/mg protein 37.8:i:2.9a 27.3:i:1.1 b 83.2:t6.1 80.3:i:6.0 90. 9:i: 10.0 85.7:i:10.5 17.4:i:0.6 15.3:i:1.3

29.5土2.1bc 81.6:i: 1 0.1 87. 7:i: 18.4 15.7:i:1.1

(S)

Pく0.05 NS NS

Pく0.05 Mg2+ - independent 5.36:i:Ü.17ab 4.88:i:Ü.13a 5.63:i:Ü.27ab 6.02:i:Ü.41 b Pく0.05 Camitine palmitoyl transferase 1.73:i:0.19a 1.42土0.13a 2.36:i:0.17b 2.52:i:0.21 b Pく0.05 Peroxisomal ß-oxidation 10.3:i:Ü.6a 9.40:t1.39a 4.32:i:0.60b 3.92:i:0.75b Pく0.05

SF and SC， SD rats fed cholesterol-free and -containing die臼， respectively.

EF and EC， ExHC rats fed cholesterol-free and -containing diets， respectively.

Values are means :i: SEM for five rats per group. NS means no significant difference.

(C)

NS NS NS NS NS NS

NS NS NS NS NS NS NS NS

げ?1l

(28)

肝臓におけるトリグリセリド代謝関連酵素mRNAの発現

肝臓におけるトリグリセリド代謝関連遺伝子の発現は、ノーザンハイブリダイゼーシヨン法により測定した(図II-2-1)。リンゴ、酸酵素mRNAは肝臓において2種類の異性体が報告されており[52J、 2.7kbと4.5kbの2つのバンドが検出された。これ

ら2種の異性体は非翻訳領域の長さの違うだけで、最終的に合成される酵素タンパ

ク質としては同じものであることが報告されていることから[52J、両方のバンドがリンゴ酸酵素の転写段階での発現量を示していると考えられた。グ、ルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ、mRNAおよび脂肪酸合成酵素mRNAは、それぞれ2.3kb、

9.1kbの位置にバンドが検出された。また内部標準として用いた18SリボソームRNA 霊は系統および食事による影響を受けなかった。表II-2-2に肝臓のトリグリセリド代謝関連遺伝子の発現を示した。肝臓における脂肪酸合成酵素mRNAの発現量は、食

コレステロールによる影響を受けなかったがSDラットに比べExHCラットにおいて低い値を示した。同様に肝臓におけるグルコース6- リン酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ、酸酵素のmRNAの発現量は、食事コレステロールによる影響を受けなかったがSDラットに比べExHCラットにおいて低い値を示した。

II-

2

-4 考察

本実験においても第11章第1節と同様に、 SDラットに比べExHCラットにおいて肝臓および血清中のトリグリセリド濃度が低いことが確認された(データは示さず)。食事による血清トリグリセリド濃度低下作用としては、食事脂肪として魚油を与えた場合、肝臓での脂肪酸合成の抑制およびß-酸化の充進によりトリグリセリ

ド合成が減少し、肝臓コレステロール濃度は低下しないが、 VLDLトリグリセリドの血中への放出が抑制されることが知られている[53， 5 4 J。いずれにせよ、本実験におけるExHCラットの血清トリグリセリド濃度の低下は、肝臓トリグリセリドの合成抑制および濃度低下に起因するものであると考えられる。そこで、肝臓のト

リグリセリド濃度に影響を与える脂肪酸合成系、トリグリセリド合成系および脂肪酸βー酸化系の酵素の活性と遺伝子の発現に及ぼすラットの系統と食事コレステロー

(29)

Glucose 6・phosphate dehydrogenase

SF SC EF EC

2.3 kb-

Fatty acid synthase

SF SC EF EC

9.5 kb-

Malic enzyme

4.5 kb- 2.7 kb-

SF SC EF EC

18s ribosomal RNA

SF SC EF EC

2.2 kb-

田園轟覇

Fig. 11-2・1 Northern hybridization of mRNAs related to triglyceride metabolism SF and SC;SD rats fed cholesterol-free and -containing diets，respectively-

EF and EC;ExHC rats fed chol esterol-free and-containing diets，respectively-

25

(30)

Table 11-2-2 Abundance of hepatic mRNAs in ExHC and SD rats

Groups

SF SC EF EC

arbitrary unit

Fatty acid synthase 100:t23 114:t56 41.3:t9.3 31.1:t5.0

Malic enzyme 100:t9a 89. 5:t 19. 7a 49.2:t4.8b 52.2:t9.7b Glucose 6-phosphate dehydrogenase 100:t10a 76.2::t23.0ac 43.9:t5.8bc 33.1:t5.7b

EF and EC， ExHC rats fed cholesterol-free and -containing die包， respectively.

Values are means :t SEM for five rats per group. NS means no significant difference.

ANOVA

Strain Cholesterol S X C

(S) (C)

Pく0.05 NS NS Pく0.05 NS NS

ぞ可、〉}

Pく0.05 NS NS

(31)

ノレの最多響について検討した。

脂肪酸合成酵素mRNA発現量は、食事コレステロールの影響を受けなかったが、

SDラットに比べExHCラットで低い値を示した。また本酵素活性も食事コレステローノレの影響を受けなかったが、 SDラットに比べExHCラットで低い値を示した。一方、

脂肪酸合成系にNADPHを供給するグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸酵素mRNA発現量は、食事コレステロールの影響を受けなかったがSDラットに比べExHCラットで低い値を示した。しかしそれらの酵素活性は、系統および食事の影響を受けなかった。 SD[52Jおよび、Wistarラット[55Jにおいては、両酵素とも活性とmRNA量の聞には高い相関があることが報告されていることから、

ExHCラットにおけるこれら酵素タンパク質量はSDラットと比較して減少していると予想される。本実験では、食事脂肪としてオレイン酸に富むオリーブ油を用いた。

飽和脂肪酸に富む油脂を脂肪源としてExHC、 SDラットを 2週間飼育した場合では、

リンゴ酸酵素とグ、ルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、いずれもExHCラットでSDラットよりも顕著に低かった(データは示さず)。ただし飽和脂肪酸食ではこれら酵素の活性は、本実験における不飽和脂肪酸食の場合と比較して高いので、酵素活性の高さも何らかの関係があるのかもしれない。これらのことから本実験でグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリンゴ酸酵素の活性とmRNA量の聞にホ関が見られなかったのは、酵素活性が酵素タンパクの量以外の要因によって影響を受けた可能性が考えられる。いずれにしても本実験では、 ExHCラットの脂肪酸合成に関与している酵素の遺伝子発現はSDラットと比較して低いことが示された。従って、 ExHCラットでは肝臓のトリグリセリド濃度の低下に脂肪酸合成系が関与していることが推察された。

トリグリセリド合成系の律速酵素と考えられるホスファチジン酸ホスホヒドラーゼ活'性は食事コレステロールの影響を受けなかったが、 Mi+依存性のそれはSDラッ

トに比べExHCラットにおいて低い値を示し、 Mg2+非依存性のそれはSDラットに比べExHCラットにおいて高い値を示した。 Mg2+非依存性のホスファチジン酸ホスホ

ヒドラーゼは細胞内情報伝達系にジグリセリドを供給する酵素と考えられており [56J、肝臓トリグリセリド濃度への本酵素の寄与は少ないと見なされている。従つ

27

(32)

て、 ExHCラットの.トリグリセリド合成系はSDラットと比べて低下していると考えられた。

。-酸化系として、ミトコンドリアでのβ-酸化の指標となるカノレニチンパルミトイノレトランスフエラーゼ活性とベルオキシソームのβー酸化活性を測定した。カルニチンパルミトイルトランスフエラーゼ活性は、食事コレステロールの影響は受けなかったがSDラットに比べExHCラットで高い値を示した。ベルオキシソームのβ-酸化活性に系統による影響が見られたが、ベルオキシソームのβー酸化は極めて長鎖の脂肪酸(C20以上)に基質特異性を示す事と本実験の食事脂肪として用いたオリーブ油にはそれらはほとんど合まれない事から、本実験における肝臓トリグリセリド濃度の変化への関与は少ないと考えられた。

以上のことから、 ExHCラットは脂肪酸合成能、トリグリセリド合成能が低く、

かつ脂肪酸のß-酸化系への利用が充進し、そのために肝臓のトリグリセリド濃度が低下していると考えられた。 ExHCラットではNADPH供給系酵素の遺伝子の発現と脂肪酸合成酵素の遺伝子発現能がSDラットと比較して低いことが明らかとなった。

トリグリセリド合成の律速酵素であるホスファチジン酸ホスホヒドラーゼ、ミトコンドリアでのβ-酸化の律速酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフエラーゼ、

の遺伝子発現の程度についても今後検討していく必要がある。

II-2-5 小括

ExHCラットとSDラットで肝臓のトリグリセリド代謝関連酵素の活性発現と遺伝子発現に及ぼす食事コレステロールの影響について検討した。脂肪酸合成酵素の活性はSDラットに比べExHCラットにおいて低い値を示した。グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリンゴ酸酵素活性には、系統および食事による影響は見られなかった。ホスファチジン酸ホスホヒドラーゼ活性は、

Mg2+依存性ではSDラットに

比べExHCラットにおいて低い値を示し、 Mg2+非依存性ではSDラットに比べExHC ラットにおいて高い値を示した。カルニチンパノレミトイルトランスフエラーゼ活性は、 SDラットに比べExHCラットにおいて高い値を示した。ベルオキシソームのβ

酸化活性は、 SDラットに比べExHCラットにおいて低い値を示した。肝臓における

(33)

脂肪酸合成酵素、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸酵素の mRNAの発現量は、 SDラットに比べExHCラットにおいて低い値を示した。

29

(34)

第3節ゴルジ装置のリボタンパク質組成

II- 3 - 1

_緒言

肝臓におけるリボタンパク質合成は、肝細胞の滑面小胞体からの脂質成分と粗面小胞体からのアボタンパク質が両小胞体接合部で会合する事により行われ、そのム成調節は細胞内のコレステロール量やトリグリセリド量によっても影響を受けることが知られている[57J。合成されたリボタンパク質はゴ、ルジ装置に移動し、ゴルジ装置で形成された分泌小胞で糖を負荷された後、細胞外へ分泌されるため、ゴルジ装置中には血流中へ分泌される寸前の新生リボタンパク質が存在すると考えられる。第II章第2節で示したように、 ExHCラットの肝臓ではトリグリセリド合成能が低いことから、相対的にコレステロールエステルに富むリボタンパク質が分泌されている可能性がある。そこで、両系統ラットにおける1%コレステロール摂食後のゴ、

ルジ装置中のリボタンパク質の脂質組成を検討した。

II- 3 -2 実験材料および方法

試薬

デキストランT-500はファルマシアジャパン(東京)、ダウエックス1X8は室町化学工業(東京)から購入した。 N-アセチルグルコサミンはナカライテスクから、

UDP-D-ガラクトースはSigma Chemical Co.から、 UDP-D-ガラクトースー[l�C]はアマ

シャムジャパンから購入した。 5αーコレスタンはナカライテスクから、 Silicone OV-17 (3%、 Gas chrom Q、 60/80 mesh)はガスクロ工業(東京)から購入した。

第II章第1節と同様の1%コレステロールを合む純化食で、 SDおよび、ExHCラットを1週間飼育した。朝日時から11時の聞に大動脈採血により屠殺を行い、血清と肝臓を採取した。

ゴルジ装置からの新生リボタンパク質の調製

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Swiftらおよび、Hamiltonらの)i法により、肝臓からゴ、ルジ装置を調製した

[58， 59J。肝臓を19あたり2.0mLの0.25M煎糖、 1.0%デキストランT-500、 0.01M 塚化マグネシウムを合む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.3)(ホモジナイズバッファー) に、ウルトラディスパーサー(ULTRA-TURRAX、 lanke&kunkel GmbH&

CoKG、 IKA-Werk、 German)を用いて氷冷中でホモジナイズした。ホモジネイトを600Xgで5分間遠心しベレットを得た。また、その上清を14，000X gで30分間遠心分離しベレツトを得た。それぞれのベレツトの上3分のlを3mLのホモジナイズバッファーで懸濁して合わせ(約10mL)、 22.5mLの1.25M煎糖溶液に重層した。それらを超遠心分離(55P-72、 SRP28SAロータ一、日立、 75，000X g、 30分)する事により、

煎糖溶液層上に集まる白色のゴルジ画分を採取した。この画分を]0倍量のホモジナイズバッファーに懸濁し、 3，000X gで、20分間遠心分離した。このゴルジベレツトを 154mM塩化ナトリウムを合む15mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)に懸濁した。ゴ、ル

ジ懸濁液をテフロンホモジナイザーで2回緩やかに押し演すことによって、ゴルジ装直中の新生リボタンパク質を遊離させた。それらをd=1.006 g

/

mLで超遠心分離 (Optima TL Ultracentrifuge、 100.2ロータ一、ベックマン・株、東京: 40.000rpm、

16hr)することにより、リボタンパク質を回収した。

UDP-ガラクトース: N-アセチ/レグルコサミンガラクトシルトランスフエラーゼの活性測定

ゴルジ装置の標識酵素であるUDP-ガラクトース: N-アセチルグ、ルコサミンガラクトシルトランスフエラーゼの活性は、 Mo汀eらの方法[60Jに従い、 UDP-D-ガラク

トースからN-アセチルグ、ルコサミンに転位されるガラクトースの量を測定して求めた。インキュベーション系は2μmoIトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、 5μmoI 2-メルカプトエタノール、

1μmoI塩化マグネシウム、 0.5μmoI塩化マンガン、0.45μmoI N-アセチ

ルグルコサミンおよび、32.2町nolUDP-D-[U_14C]ガラクトース(26，000dpm)とゴルジ画分(タンパク景O.4mg)を合み、総容量を200μLとした。反応は370Cで15分間インキュベートした。反応終了後、直ちに氷水で冷却し、反応液を約1mLの陰イオン交換樹脂(ダウエックス1X8、 100-200メッシユ)を詰めたカラム(0.8X 4cm)に注入し

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た。生成したN-アセチルラクトサミンと加水分解により生じたガラクトースを

O.4mLの水で3回洗浄することで溶出させた。溶出液は直接計測用パイアルに入れ、

シンチレーター(アクアゾ〉ル2、 Packard

Ins.、 USA)10mLを加え、液体シンチレー

シヨンカウンター(Tri-Carb 2250、 PackardJ apan、東京)で測定した。ゴ、ルジ画分のタンパク質量はBradford法[61Jで測定した。

リボタンパク質中の脂質濃度

リボタンパク質qlの脂質濃度は、脂質をFolch法[18Jにて抽出した後、化学法にてトリグリセリド[19J、リン脂質[21J濃度を測定した。コレステロールについては、石油エーテル:ジ、エチルエーテノレ/酢酸(82:_{18: 1，}"八)を展開溶媒として用い、

TLCにて遊離型とエステル型コレステロールに分離後[62J、別々に抽出、ケン化、

トリメチルシリル化を行い、 5αーコレスタンを内部標準としてガスクロマトグラフィーにて定量した(カラム: OV-17、キャリアガス:窒素、カラム温度: 2600C、

インジェクタ・ディテクタ組度: 3000C、ガスクロマトグラフ:島津GC-4CM)。

統計解析

結果はStudent's {-test [63Jにより解析した。

II- 3 - 3

結果

ゴルジ装置の標識酵素であるUDP-ガラクトース: N-アセチルグ、ルコサミンガラクトシルトランスフエラーゼの活性は、文献値[64Jと同様にホモジネイトに比ベゴ

ルジ画分で約72倍の活性(ホモジネイト0.204

nmol/hr/mg proteinに対しゴルジ画分 14.5 nmol!hr/mg protein)を示した。

表11-3-1に1%コレステロール食で1週間飼育したSDおよび、ExHCラットの、ゴルジ装置中の新生リボタンパク質の脂質組成を示した。その結果dく1.006画分に回収された新生リボタンパク質中の各脂質の割合には両系統ラットにおいて違いが見られた。

遊離型コレステロールおよびリン脂質の割合は、群聞で差が見られなかった。コレステロールエステルとタンパク質の割合は、 SDラットに比べExHCラットで高く、

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Table 11-3-1 Composition of Golgi lipoprotein (dく1.006) from ExHC and SD rats

SC EC

wt%

Free cholesterol 1.1 O::tO. 71 O.937::tO.371

Phospholi pid 2. 69::tO.35 3. 18::tO.66

Protein 1 O.4:!:Ü. 8 16.4:!:Ü.7*

Esterified cholesterol 7.76::tO.95 24.4::t1.4*

Triglyceride 78.1::t1.4 55.1::t1.8*

Esterified cholesterol / Triglyceride 0.1 OO::tO. 014 O.447::tO.038*

SC and EC ; SD and ExHC rats fed 1 % cholesterol diets， respectively.

Values are means ::t SE恥1 for five rats per group.

Statistical significance (P<ü.05) between two groups is indicated by an asterisk.

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逆にトリグリセリドの割合は、 SDラットに比べExHCラットで低い値をノ示した。従って、エステル型コレステロール/トリグリセリド比はExHCラットで、顕著に高かった。

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4

考察

第II章第2節にぶしたように、 ExHCラットではSDラットと比較してトリグリセリ

ド合成系の低下と脂肪酸の酸化系の充進に基づく肝臓トリグリセリド濃度の低ドがあり、リボタンパク質合成の際、トリグリセリド利用の低下が生じている可能性を指摘した。そのため相対的にコレステロールエステルに富むβ-VLDL様のリボタンパク質形成が増加し、そのことがExHCラットの高コレステロール血症発症に関与する可能性があることを示してきた。そこで本節では、肝臓でのリボタンパク質ム成の段階で、実際にそのような粒子が形成されているかを検討するため、分泌直則のリボタンパク質粒子が存在するゴルジ装置中の新生リボタンパク質の脂質組成を調べた。その結果、新生dく1.006g

/

mlリボタンパク質中の各脂質の割合にはExHC とSDラットにおいて違いが見られ、特にトリグリセリドに対するコレステロールエステルの比がSDラットに比べExHCラットで顕著に高い値を示した。これは現在ま

での結果とも整合性があり、 ExHCラットでコレステローノレエステルに富むβ

-VLDL様リボタンパク質の形成増加が起こっていることが確認された。 β-VLDL粒

子の血中での異化速度はトリグリセリドに富むV L D L粒子と比較して遅いことから[41J、 ExHCラットにおけるコレステロール摂取に基づく高コレステロール血症は、肝臓における異常なリボタンパク質の合成が関わっていることが推察された。

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5 小f6

1%コレステロール食で1週間飼育したSDおよびExHCラットの、ゴ、ルジ装置中の新生リボタンパク質の脂質組成を検討した。 dく1.006 g/rnlリボタンパク質中の各脂質の割合には両系統ラットにおいて違いが見られ、コレステロールエステルとタンパク質の割合は、 SDラットに比べExHCラットで高く、逆にトリグリセリドの割合は、 SDラットに比ベExHCラットで低い値を示した。コレステロールエステル/トリグリセリド比を比較すると、 SDラットに比べExHCラットで顕著に高い値を示した。

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これらの結果は、コレステロール摂取ExHCラットでは血中での異化が遅いβ

VLDL様の粒子が生成していることを示唆している。

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