受動喫煙によるラット椎間板変性モデルに対する

受動喫煙によるラット椎間板変性モデルに対する 脱分化脂肪細胞

(DFAT)

日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系整形外科学専攻

宮方 啓行 修了年 2016 年 指導教員 德橋 泰明

受動喫煙によるラット椎間板変性モデルに対する 脱分化脂肪細胞

(DFAT)

日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系整形外科学専攻

宮方 啓行 修了年 2016 年 指導教員 德橋 泰明

目 次

概 要 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1

諸 言 1 、 は じ め に ・ ・ ・ ・ ・ ・ 3

2 、 椎 間 板 の 構 造 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 4

3 、 椎 間 板 の 変 性 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 5

4 、 タ バ コ に よ る 影 響 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 6

5 、 受 動 喫 煙 に よ る ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル ・ ・ ・ ・ ・ ・ 7

6 、 椎 間 板 変 性 症 に 対 す る 臨 床 的 治 療 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 7

7 、 椎 間 板 変 性 に 対 す る 再 生 治 療 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 8 8 、 D F A T に つ い て ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1 0 目 的 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1 0 対 象 と 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1 1 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1 5

1 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト に お け る 椎 間 板 組 織 所 見 の 比 較

2 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト に お け る 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン の 定 量 比 較 3 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト に お け る 髄 核 内 軟 骨 関 連 遺 伝 子 発 現 の 比 較

4 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト に お け る 肺 組 織 の 免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 発 現 の 比 較 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1 7 ま と め ・ ・ ・ ・ ・ ・ 2 1 謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 2 2 図 表 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 2 3 引 用 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 3 4 研 究 業 績 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 4 3

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≪ 概 要 ≫

日 本 に お い て 腰 痛 は 、 最 も 多 い 国 民 有 訴 疾 患 で あ る 。 腰 痛 の 原 因 は 多 種 に わ た る が 、 椎 間 板 変 性 は そ の 一 因 と し て 重 要 で あ る 。 椎 間 板 の 変 性 は 、 加 齢 、 遺 伝 的 素 因 、 喫 煙 な ど が 危 険 因 子 と な り 、 髄 核 細 胞 の 減 少 や プ ロ テ オ グ リ カ ン 産 生 低 下 を 特 徴 と す る 不 可 逆 的 変 化 を 示 す 。 以 前 よ り 喫 煙 は 、 腰 痛 や 椎 間 板 変 性 と の 関 連 が 指 摘 さ れ て お り 、 ニ コ チ ン の 静 脈 内 投 与 や 、 受 動 喫 煙 に よ り 椎 間 板 変 性 が 誘 導 で き る こ と が 動 物 モ デ ル で 明 ら か に さ れ て い る 。 変 性 し た 椎 間 板 に 対 す る 根 本 的 な 治 療 は 、 現 在 ま で に 確 立 さ れ て い な い 。 近 年 、 椎 間 板 変 性 に 対 し て 多 血 小 板 血 漿

( P l a t e l e t - r i c h p l a s m a : P R P ) に よ る 増 殖 因 子 治 療 や 、 間 葉 系 幹 細 胞 ( M e s e n c h y m a l s t e m c e l l : M S C ) を 用 い た 細 胞 治 療 な ど の 椎 間 板 再 生 を 目 標 と す る 研 究 が な さ れ て い る 。 脱 分 化 脂 肪 細 胞 ( D e d i f f e r e n t i a t e d f a t c e l l : D F A T ) は 、 成 熟 脂 肪 細 胞 を 天 井 培 養 と い う 方 法 で 体 外 培 養 す る こ と に よ り 得 ら れ 、 高 い 増 殖 能 と M S C と 同 等 の 多 分 化 能 を 有 す る 細 胞 群 で あ る 。 D F A T は 患 者 の 年 齢 や 基 礎 疾 患 に 影 響 さ れ ず 大 量 調 製 で き る た め 、 椎 間 板 変 性 症 に 対 す る 治 療 用 細 胞 と し て 有 用 で あ る 可 能 性 が あ る 。 本 研 究 は 、 喫 煙 に よ っ て 誘 導 さ れ た 椎 間 板 変 性 ラ ッ ト に 対 し 、 D F A T を 静 脈 内 投 与 し 、 そ の 治 療 効 果 を 検 討 し た 。

S p r a g u e D a w l e y ( S D ) ラ ッ ト を D F A T 群 、 P B S 群 、 C o n t r o l 群 の 3 群 （ 各 群 n = 6 ） に 分 け 、 D F A T 群 、 P B S 群 は 受 動 喫 煙 装 置 を 用 い て 8 週 間 の 受 動 喫 煙 を 行 っ た 。 D F A T 群 は 喫 煙 下 に D F A T 1 × 1 0⁶ 個 / 0 . 5 m l を 2 週 間 ご と に 静 脈 内 投 与 し 、 P B S 群 は 喫 煙 下 に P h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) 0 . 5 m l を 2 週 間 ご と に 静 脈 内 投 与 し た 。 C o n t r o l 群 は 非 喫 煙 、 非 投 与 下 で 8 週 間 飼 育 し た 。 実 験 開 始 8 週 間 後 に 、 椎 体 を 摘 出 し 、 尾 椎 は 組 織 切 片 標 本 を 作 成 し H E 染 色 、 E V G 染 色 、 ア リ シ ア ン ブ ル ー 染 色 を 行 い 、 組 織 学 的

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評 価 を 行 っ た 。 腰 椎 椎 間 板 か ら は 髄 核 を 摘 出 し 、 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン 量 を 測 定 す る と 共 に 、軟 骨 関 連 遺 伝 子（ ア グ リ カ ン 、バ ー シ カ ン 、S o x 9 ） の m R N A 発 現 を リ ア ル タ イ ム R T - P C R 法 に て 測 定 し た 。 さ ら に 肺 組 織 か ら t o t a l R N A を 抽 出 し 、免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 H e p a t o c y t e g r o w t h f a c t o r ( H G F ) 、 P r o s t a g l a n d i n E 2 ( P G E 2 ) 、 T u m o r n e c r o s i s f a c t o r - s t i m u l a t e d g e n e - 6

（ T S G - 6 ）、T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - β 1 (T G F - β 1 ） の m R N A 発 現 を リ ア ル タ イ ム R T - P C R 法 を 用 い て 測 定 し た 。

各 群 の 尾 椎 椎 間 板 の 組 織 学 的 検 討 に お い て 、 喫 煙 処 理 を 行 っ た P B S 群 は 、 C o n t r o l 群 に 比 べ 髄 核 組 織 の 細 胞 密 度 の 減 少 が 認 め ら れ た 。 D F A T 群 は P B S 群 と 比 較 し て 椎 間 板 の 変 性 程 度 が 軽 度 で あ っ た 。 髄 核 内 の プ ロ テ オ グ リ カ ン 量 は 、C o n t r o l 群 と 比 較 し て P B S 群 で 5 0 % 以 上 の 低 下 を 認 め た 。 一 方 D F A T 群 は P B S 群 に 比 べ プ ロ テ ロ グ リ カ ン 量 の 減 少 が 抑 制 さ れ る 傾 向 を 認 め た 。 髄 核 内 の ア グ リ カ ン と S o x 9 の 遺 伝 子 発 現 量 は 、 C o n t r o l 群 と 比 較 し て P B S 群 で 有 意 ( p < 0 . 0 5 ) に 減 少 し て い た 。 さ ら に 、 D F A T 群 は P B S 群 と 比 較 し ア グ リ カ ン と S o x 9 の 遺 伝 子 発 現 量 の 減 少 が 有 意 ( p < 0 . 0 5 ) に 抑 制 さ れ た 。 肺 組 織 の 遺 伝 子 発 現 解 析 で は 、 D F A T 群 は P B S 群 と 比 較 し て 、 免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 で あ る H G F と P G E 2 、 T S G - 6 の 発 現 量 が 有 意 ( p < 0 . 0 5 ) に 高 値 で あ っ た 。

こ れ ら の 結 果 よ り 、 受 動 喫 煙 ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル に 対 し D F A T 静 脈 内 投 与 は 椎 間 板 変 性 を 抑 制 す る 作 用 が あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た D F A T の 椎 間 板 変 性 抑 制 メ カ ニ ズ ム と し て 肺 組 織 か ら の 免 疫 制 御 因 子 の 発 現 、 分 泌 が 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 D F A T は 椎 間 板 変 性 症 に 対 す る 細 胞 治 療 ソ ー ス と し て 有 望 で あ る と 考 え ら れ た 。

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≪ 諸 言 ≫ 1 . は じ め に

日 本 人 の 平 均 寿 命 は 男 性 が 8 0 . 2 1 歳 、 女 性 が 8 6 . 6 1 歳 で あ り 、 女 性 は 世 界 で 第 1 位 で あ る （ 厚 生 労 働 省 統 計 デ ー タ ベ ー ス 平 成 2 5 年 簡 易 生 命 表 の 概 況 h t t p : / / w w w . m h l w . g o . j p / t o u k e i / s a i k i n / h w / l i f e / l i f e 1 3 / ）。 ま た 、 6 5 歳 以 上 が 全 人 口 の 2 5 . 1 % を 占 め 、 世 界 で も 有 数 の 長 寿 大 国 で あ る

（ 内 閣 府 ホ ー ム ペ ー ジ 平 成 2 5 年 度 高 齢 化 の 状 況 及 び 高 齢 社 会 対 策 の 実 施 状 況 h t t p : / / w w w 8 . c a o . g o . j p / k o u r e i / w h i t e p a p e r / w - 2 0 1 4 / g a i y o u / i n d e x . h t m l ）。 そ の 日 本 に お い て 腰 痛 は 国 民 有 訴 率 の 第 1 位 で あ り 、 ま た 国 民 の 約 8 割 が 一 生 涯 で 腰 痛 を 経 験 す る と さ れ て い る （ 厚 生 労 働 省 統 計 デ ー タ ベ ー ス 平 成 2 2 年 度 国 民 生 活 基 礎 調 査 2 0 1 0 h t t p : / / w w w . m h l w . g o . j p / t o u k e i / s a i k i n / h w / k - t y o s a / k - t y o s a 1 0 / 3 - 1 . h t m l ）。 腰 痛 の 原 因 は 、 外 傷 、 腫 瘍 、 感 染 な ど 多 種 に わ た り 、 椎 間 板 の 変 性 も 原 因 と な る 。 椎 間 板 が 変 性 を 起 こ す と 脊 柱 が 変 形 し 、 全 脊 椎 の ア ラ イ メ ン ト が 崩 れ る 脊 椎 後 側 弯 症 に な る 。 現 在 、 脊 椎 ア ラ イ メ ン ト を 矯 正 す る 手 術 が 行 わ れ 注 目 を 集 め て い る 。 し か し 、 脊 椎 後 側 弯 症 に 対 す る 手 術 は 、 骨 盤 か ら 胸 腰 椎 レ ベ ル ま で の 固 定 術 を 要 し 、 そ れ に 伴 い ス ク リ ュ ー の 緩 み や 脱 転 、 隣 接 椎 間 障 害 、 隣 接 椎 体 骨 折 と い っ た 多 く の 問 題 点 が 存 在 す る 。

椎 間 板 変 性 に 関 す る 因 子 と し て 、 遺 伝 的 要 因 、 力 学 的 負 荷 、 加 齢 、 喫 煙 な ど が 挙 げ ら れ る 。 こ れ ま で に 喫 煙 と 椎 間 板 変 性 の 関 連 に つ い て さ ま ざ ま な 報 告 が さ れ て い る が 、 当 整 形 外 科 教 室 に お い て も ラ ッ ト 喫 煙 モ デ ル を 使 用 し 椎 間 板 の 変 性 が 惹 起 さ れ る こ と を 報 告 し て い る ^{1 - 5 )}。椎 間 板 変 性 に 対 す る 根 治 治 療 は 現 在 の と こ ろ 存 在 せ ず 、 椎 間 板 を 再 生 し た り 変 性 を 抑 制 す る こ と は で き て い な い 。 近 年 、 椎 間 板 変 性 に 対 す る 有 効 な 治 療 法 を 確 立 す る た め 様 々 な 研 究 成 果 が 報 告 さ れ て い る 。 例 え ば 、 多 血 小 板 血 漿 （ P l a t e l e t - r i c h p l a s m a : P R P ） な ど の 成 長 因 子 治 療 ^{6 - 7 )}、 遺 伝 子 治

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療 ^{8 - 9 )}、 間 葉 系 幹 細 胞 （ M e s e n c h y m a l s t e m c e l l : M S C ） な ど を 用 い た 細 胞

治 療 1 0 - 1 1 )、 な ど で あ る 。

今 回 、 我 々 は M a t s u m o t o ら ^{1 2 )}に よ っ て 開 発 さ れ 、 M S C と 同 等 の 多 分 化 能 を 示 す 脱 分 化 脂 肪 細 胞（ D e d i f f e r e n t i a t e d f a t c e l l : D F A T ）を 用 い て 、 喫 煙 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ た 椎 間 板 変 性 を 抑 制 で き る か を 検 討 し た 。 そ し て 椎 間 板 変 性 症 に 対 す る D F A T を 用 い た 細 胞 治 療 の 可 能 性 に つ い て 考 察 し た 。

2 . 椎 間 板 の 構 造

椎 間 板 は 椎 体 と 椎 体 を 連 結 し 脊 柱 の 多 様 な 動 き を 可 能 に し 、 力 学 的 負 荷 を 緩 衝 す る こ と か ら 、 支 持 性 と 可 動 性 の 役 割 を 併 せ 持 っ て い る 。 椎 間 板 は 円 盤 状 の 線 維 軟 骨 組 織 で あ り 、 中 央 に 存 在 す る ゲ ル 状 の 髄 核 と こ れ を 取 り 囲 む 線 維 輪 、 椎 体 と の 境 界 を な す 軟 骨 終 板 か ら 構 成 さ れ て い る 。 構 造 的 特 徴 か ら 椎 間 板 は 、 軟 骨 終 板 を 介 し た 拡 散 に よ っ て 栄 養 補 給 が な さ れ 、 人 体 最 大 の 無 血 管 組 織 で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。

① 髄 核

椎 間 板 体 積 の 4 0 ～ 6 0 % を 占 め 、椎 間 板 の 中 央 や や 後 方 部 に 存 在 し 、肉 眼 的 に は 白 色 ゲ ル 状 の 組 織 で あ る 。 無 構 造 の 基 質 内 に 髄 核 細 胞 が ま ば ら に 存 在 し 、 椎 間 板 の コ ラ ー ゲ ン や グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン の 産 生 に 寄 与 し て い る 。 髄 核 細 胞 は 脊 索 に 由 来 し 、 ヒ ト で は 1 0 歳 ま で に 軟 骨 様 細 胞 に 置 換 さ れ る 。 髄 核 は 、 乾 燥 重 量 の 約 7 0 % が プ ロ テ オ グ リ カ ン で 、 約 1 5 ％ が Ⅱ 型 コ ラ ー ゲ ン で 構 成 さ れ る 。 椎 間 板 に 多 く み ら れ る プ ロ テ オ グ リ カ ン は ア グ リ カ ン で あ り 、 ア グ リ カ ン の コ ア タ ン パ ク に 付 着 し 高 度 に 負 の 電 荷 を 帯 び た 糖 鎖 が グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン で あ る 。 グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン が 中 和 す る 陽 イ オ ン を 引 き 付 け る こ と で 椎 間 板 基 質 内 に 高 イ オ ン つ ま り 膨

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張 圧 を 作 り 出 し て い る 。

② 線 維 輪

線 維 輪 は 、 乾 燥 重 量 の 約 2 5 % が プ ロ テ オ グ リ カ ン で あ り 、 約 5 0 ～ 6 0 % が

Ⅰ 型 コ ラ ー ゲ ン で 構 成 さ れ る 。 線 維 輪 は 外 側 と 内 側 に わ か れ て お り 、 外 層 は Ⅰ 型 コ ラ ー ゲ ン で 、 内 層 に な る に 従 っ て Ⅱ 型 コ ラ ー ゲ ン の 比 率 が 高 く な る 。 外 側 線 維 輪 は 大 部 分 が コ ラ ー ゲ ン を 含 ん だ 緻 密 な 結 合 織 に よ る 厚 い 層 板 を 形 成 し 、 構 成 細 胞 の 大 部 分 は 線 維 芽 細 胞 で あ る 。 線 維 輪 の 各 層 は 椎 体 終 板 と 6 0 ° の 角 度 で お の お の 平 行 に 存 在 し て い る 。 連 続 し た 層 板 に お い て 線 維 は 方 向 を 変 え 、 脊 椎 の 軸 回 旋 に 抵 抗 し 、 屈 曲 ・ 伸 展 ・ 側 屈 を 可 能 に す る 。 内 側 線 維 輪 は 膠 原 線 維 を 伴 っ た 軟 骨 基 質 か ら な る 。 外 側 線 維 輪 と 同 様 に 斜 走 し 、椎 体 終 板 表 面 の 硝 子 軟 骨 よ り 起 始・停 止 す る 。

③ 軟 骨 終 板

厚 さ が 1 ～ 2 m m の 軟 骨 層 で 椎 体 の 上 下 の 皮 質 骨 面 を 覆 う 。 組 織 学 的 に は 椎 体 側 は 硝 子 軟 骨 で 椎 間 板 側 が 線 維 軟 骨 で あ る 。 椎 間 板 は 無 血 管 組 織 で あ る た め 、 軟 骨 終 板 を 介 し て 栄 養 を 椎 間 板 内 に 拡 散 し て い る 。

3 . 椎 間 板 の 変 性

ヒ ト の 椎 間 板 は 人 体 に 存 在 す る 結 合 組 織 の 中 で 最 も 早 く 変 性 変 化 を 起 こ す こ と が 知 ら れ て い る 。 椎 間 板 変 性 の 要 因 と し て 、 加 齢 ^{1 3 )}、 脊 椎 に 加 わ る 反 復 性 の 軸 圧 負 荷 や 振 動 ^{1 4 )}、 遺 伝 的 要 素 1 5 - 1 6 )、 肥 満 ^{1 7 )}、 喫 煙 1 7 - 1 8 )

が 挙 げ ら れ る 。 椎 間 板 変 性 に お い て プ ロ テ オ グ リ カ ン 量 の 低 下 が 最 も 重 大 な 生 化 学 的 変 化 で あ る ^{1 9 )}。 髄 核 細 胞 の 減 少 に よ っ て 起 こ る プ ロ テ オ グ リ カ ン の 産 生 低 下 が 、 椎 間 板 の 水 和 作 用 を 減 弱 さ せ 、 椎 間 板 高 の 低 下 を も た ら し 、 椎 間 板 の 力 学 的 強 度 を 低 下 さ せ る 1 9 - 2 0 )。 ま た 。 椎 間 板 の 変 性

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過 程 に お い て 細 胞 外 基 質 の 組 成 変 化 が 炎 症 性 メ デ ィ エ ー タ ー を 活 性 化 さ せ 、 M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P )^{2 1 )} や A d i s i n t e g r i n a n d m e t a l l o p r o t e i n a s e w i t h t h r o m b o s p o n d i n m o t i f s ( A D A M T S )^{2 2 )}が ア グ リ カ ン を 分 解 し 、 さ ら な る 椎 間 板 の 変 性 を 引 き 起 こ す 。 椎 間 板 変 性 の 進 行 と と も に 、 周 囲 の 線 維 輪 は 層 状 構 造 の 乱 れ か ら 亀 裂 を 認 め 、 内 部 の 髄 核 は 弾 力 性 が 低 下 し 固 体 化 す る 2 3 - 2 4 )。 そ し て 、 椎 間 板 変 性 の 結 果 、 脊 椎 の 不 安 定 性 や 椎 間 板 の 突 出 ・ 脱 出 が 腰 痛 や 周 囲 の 神 経 組 織 を 圧 迫 刺 激 し 下 肢 痛 を 惹 起 す る ^{2 5 )}。

4 . タ バ コ に よ る 影 響

タ バ コ は 約 4 , 0 0 0 種 類 の 化 学 物 質 を 含 み 、 そ の う ち 約 2 0 0 種 類 の 有 毒 物 質 が 存 在 す る 。 そ れ ら の 有 害 物 質 は 、 心 疾 患 や 多 種 の 癌 、 肺 疾 患 な ど 多 く の 健 康 被 害 を も た ら す 。 ま た タ バ コ は 腰 痛 ^{2 6 )}と の 関 連 も 深 く 、 椎 間 板 変 性 を 引 き 起 こ す こ と が 報 告 さ れ て い る ^{2 7 )}。 そ の 原 因 と な る 代 表 的 な 化 学 物 質 と し て 、 ニ コ チ ン 、 一 酸 化 炭 素 、 タ ー ル な ど が 挙 げ ら れ る 。 ニ コ チ ン は 副 腎 皮 質 を 刺 激 し カ テ コ ラ ミ ン を 遊 離 し 、 交 感 神 経 系 を 刺 激 す る こ と で 末 梢 血 管 の 収 縮 、 血 圧 上 昇 、 心 拍 数 の 増 加 を も た ら す 。 ま た 血 中 リ ポ 蛋 白 の 変 性 を 起 こ し 、 血 管 内 皮 障 害 を 伴 う ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 を 惹 起 す る 。 一 酸 化 炭 素 は 、 酸 素 の 約 2 0 0 倍 以 上 の 親 和 性 で 血 液 中 の ヘ モ グ ロ ビ ン と 結 合 し 、 慢 性 的 な 酸 素 欠 乏 状 態 を 作 り 出 す 。 椎 間 板 は 椎 体 終 板 に 流 入 す る C a p i l l a r y b e d s か ら 血 流 を 維 持 し て い る 。 そ の た め 、 血 管 収 縮 ^{2 8 )}、 動 脈 硬 化 性 血 管 変 化 ^{2 9 )}、 C O ヘ モ グ ロ ビ ン の 増 加 ^{2 8 )}な ど に よ っ て 、 椎 間 板 の 血 流 低 下 や 低 酸 素 、 低 栄 養 が 引 き 起 こ さ れ 、 椎 間 板 は 加 速 度 的 に 変 性 す る 。

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5 . 受 動 喫 煙 に よ る ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル

U e m a t s u ら ^{1 )}は 家 兎 に ニ コ チ ン を 投 与 し 、椎 間 板 の 変 性 を 試 み た 。ヘ ビ ー ス モ ー カ ー の 血 中 ニ コ チ ン 濃 度 に 相 当 す る 量 ( 2 0 0 μ g / m l ) の ニ コ チ ン を 4 週 間 持 続 静 注 し た 結 果 、 コ ラ ー ゲ ン 合 成 能 と プ ロ テ オ グ リ カ ン 合 成 能 を 表 す ³H - p r o l i n e と ^{3 5}S - s u l f a t e の 椎 間 板 細 胞 へ の 取 り 込 み が 有 意 に 低 下 し 、 ニ コ チ ン 毒 性 に よ っ て 椎 間 板 変 性 が 誘 導 で き る こ と が 示 さ れ た 。 O d a ら ^{3 0 )}は 、 受 動 喫 煙 ボ ッ ク ス を 使 用 し 、 ラ ッ ト に 8 週 間 受 動 喫 煙 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 ラ ッ ト の 椎 間 板 が 菲 薄 化 し 、 線 維 輪 ・ 髄 核 と も に 変 性 を 認 め 、 椎 間 板 組 織 内 の I L - 1 β が 増 加 し た と 報 告 し て い る 。 N e m o t o ら ^{4 )} は 、 こ の 受 動 喫 煙 ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル を 使 用 し 、 変 性 し た 椎 間 板 が 禁 煙 に よ っ て 修 復 す る か を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 禁 煙 後 8 週 間 で 髄 核 、 線 維 輪 の 変 性 は 軽 く な る 傾 向 で あ っ た と 報 告 し て い る 。 ま た U e i ら ^{5 )}は 受 動 喫 煙 ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル に お い て T i s s u e i n h i b i t o r o f m e t a l l o p r o t e i n a s e - 1 ( T I M P - 1 ) 遺 伝 子 の 発 現 増 加 が 認 め ら れ 、 喫 煙 に よ る 組 織 障 害 に 対 し て 修 復 反 応 が 働 く 可 能 性 を 報 告 し て い る 。

6 . 椎 間 板 変 性 症 に 対 す る 臨 床 的 治 療

椎 間 板 変 性 に よ る 腰 痛 に 対 す る 治 療 法 と し て 、 保 存 療 法 と 手 術 療 法 に 大 別 さ れ る が 、 ま ず は 保 存 療 法 が 基 本 と な る 。 保 存 療 法 に は 、 運 動 療 法 と 薬 物 治 療 が あ り 、 運 動 療 法 と し て 体 幹 の 筋 力 ト レ ー ニ ン グ や ス ト レ ッ チ な ど が 行 わ れ 、 薬 物 治 療 と し て ア セ ト ア ミ ノ フ ェ ン や N S A I D S 、 三 環 系 抗 う つ 薬 、 オ ピ オ イ ド 、 抗 け い れ ん 薬 な ど が 使 用 さ れ る 。 こ れ ら の 内 服 薬 に て 疼 痛 の コ ン ト ロ ー ル が 得 ら れ な い 場 合 は 、 当 該 椎 間 板 に ブ ロ ッ ク 注 射 が 施 行 さ れ る 。 こ れ ら の 保 存 療 法 に 抵 抗 性 の 場 合 、 椎 体 間 固 定 術 な ど の 手 術 療 法 が 選 択 さ れ る 。 椎 体 間 固 定 術 で は 、 変 性 し た 椎 間 板 を 摘 出 し そ の 部 位 に 骨 移 植 を 行 っ た 後 、 当 該 椎 間 板 を 架 橋 す る よ う に ス ク リ ュ

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ー 固 定 を 行 う 。 い ず れ の 治 療 法 に お い て も 変 性 し た 椎 間 板 を 再 生 さ せ る も の で は な く 、 対 症 療 法 に よ る 疼 痛 コ ン ト ロ ー ル が 目 的 で あ る 。

7 . 椎 間 板 変 性 に 対 す る 再 生 治 療

椎 間 板 の 再 生 を 目 的 と し た 研 究 と し て 、 成 長 因 子 、 遺 伝 子 、 細 胞 な ど を 用 い た 治 療 法 の 開 発 や 臨 床 研 究 が 行 わ れ て い る 。

① 成 長 因 子 治 療

変 性 し た 椎 間 板 の 修 復 、 再 生 に 関 わ る 種 々 の 成 長 因 子 の 存 在 が 明 ら か と な り 、 ま た 椎 間 板 に 直 接 注 射 す る 手 技 が 容 易 な こ と か ら 、 成 長 因 子 治 療 に 関 す る 多 く の 基 礎 研 究 が 行 わ れ て い る 。1 9 9 1 年 に T h o m p s o n ら ^{3 1 )}は 、 T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - β ( T G F - β ) や E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) を 椎 間 板 内 に 注 射 す る こ と で プ ロ テ オ グ リ カ ン の 合 成 を 増 幅 さ せ た と 報 告 し た 。 そ の 後 O s t e o g e n i c p r o t e i n - 1 ( O P - 1 ) ^{3 2 )}、 G r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n f a c t o r - 5 ( G D F - 5 )^{3 3 )}な ど の 成 長 因 子 群 も 、 椎 間 板 細 胞 外 基 質 の 合 成 を 促 進 さ せ る 効 果 が あ る こ と が 明 ら か に な っ て い る 。

最 近 で は 、P R P が 血 小 板 由 来 の 様 々 な 成 長 因 子 を 含 み 、容 易 に 自 己 血 よ り 作 製 で き る こ と か ら 、 注 目 さ れ て い る 。 N a g a e ら ^{3 4 )}は 、 日 本 白 色 家 兎 の 髄 核 を 吸 引 し P R P と ゼ ラ チ ン ハ イ ド ロ ゲ ル を 一 緒 に 髄 核 内 へ 注 射 す る こ と に よ り 、 髄 核 内 の プ ロ テ オ グ リ カ ン と Ⅱ 型 コ ラ ー ゲ ン の 合 成 が 促 進 し 、 髄 核 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス が 抑 制 さ れ た と 報 告 し て い る 。

② 遺 伝 子 治 療

1 9 9 8 年 、 N i s h i d a ら は 、 ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い て 椎 間 板 内 に 導 入 さ れ た 遺 伝 子 が 副 作 用 な く 1 2 週 間 以 上 発 現 が 持 続 す る こ と を 報 告 し た ^{3 5 )}。 そ の 後 、ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い た G D F - 5^{3 6 )}や L i m m i n e r a l i z a t i o n

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p r o t e i n - 1 ( L M P - 1 )^{3 7 )}の 遺 伝 子 導 入 が 、 椎 間 板 変 性 モ デ ル 動 物 の 細 胞 外 基 質 産 生 を 促 進 し 、 機 能 を 維 持 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 ま た 、 よ り 安 全 性 が 高 い マ イ ク ロ バ ブ ル に よ る 超 音 波 コ ン ト ラ ス ト 法 を 用 い て 、 効 率 よ く 椎 間 板 に 遺 伝 子 導 入 が で き る こ と が 報 告 さ れ て い る ^{3 8 )}。 さ ら に 、 S m a l l i n t e r f e r i n g R N A ( s i R N A ) を 用 い た A D A M T S - 5 や C a s p a s e - 3 に 対 す る 遺 伝 子 干 渉 に よ っ て も 、 椎 間 板 変 性 が 治 療 で き る 可 能 性 に つ い て 報 告 が な さ れ て い る 9 , 3 9 ).

③ 細 胞 治 療

M S C は 高 い 増 殖 能 と 多 分 化 能 を 特 徴 と す る 体 性 幹 細 胞 の 一 種 で あ る ^{4 0 )}。 骨 髄 、 脂 肪 組 織 の 間 質 や 臍 帯 、 羊 膜 な ど の 胎 児 付 属 組 織 に 存 在 し 、 プ ラ ス チ ッ ク デ ィ シ ュ へ の 接 着 性 を 利 用 し て 培 養 増 殖 さ せ る こ と が で き る ^{4 1 )}。 M S C は 微 小 環 境 や あ る 一 定 の サ イ ト カ イ ン の 存 在 下 で 骨 芽 細 胞 、軟 骨 細 胞 、 脂 肪 細 胞 な ど 主 に 中 胚 葉 系 列 細 胞 へ の 分 化 能 を 示 す 。ま た 、M S C は 種 々 の 刺 激 に 反 応 し て 様 々 な 液 性 因 子 を 分 泌 し 、 パ ラ ク ラ イ ン 作 用 を 介 し て 創 傷 治 癒 、 血 管 新 生 、 免 疫 制 御 、 抗 炎 症 作 用 な ど を 示 す ^{4 2 )}。 線 維 輪 の 穿 刺 や 髄 核 の 吸 引 、 酵 素 処 理 な ど に よ り 誘 導 し た 椎 間 板 変 性 モ デ ル 動 物 に 対 し て M S C を 移 植 す る こ と に よ り 、 椎 間 板 高 の 回 復 や 椎 間 板 細 胞 外 基 質 の 合 成 上 昇 、 移 植 さ れ た M S C の 椎 間 板 様 形 質 変 化 な ど が 認 め ら れ る こ と が 報 告 さ れ て い る ^{4 3 )}。 ま た 現 時 点 に お い て 結 果 の 報 告 は 少 な い が 、 椎 間 板 変 性 症 に 対 す る M S C 細 胞 治 療 の 臨 床 研 究 も 行 わ れ て お り 、 例 え ば 、O r o z c o

ら ^{4 4 )}は 椎 間 板 変 性 を 有 す る 腰 痛 患 者 に 対 し 、 自 家 骨 髄 M S C を 髄 核 領 域 に

注 射 す る こ と で 腰 痛 の 改 善 と M R I で の 椎 間 板 内 水 分 量 の 増 加 を 得 た と 報 告 し て い る 。M S C は 髄 核 細 胞 に 比 べ 増 殖 活 性 が 高 く 、骨 髄 穿 刺 な ど に よ り 患 者 自 身 か ら 調 製 で き る た め 、 椎 間 板 変 性 に 対 す る 細 胞 治 療 の 細 胞 源 と し て 期 待 さ れ て い る 。 一 方 、 高 齢 者 や 骨 粗 鬆 症 と い っ た 変 性 性 疾 患 を も

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っ た 患 者 で は 、 体 内 の M S C の 数 が 少 な く 、 移 植 に 必 要 な 細 胞 数 を 確 保 で

き な い と い っ た 問 題 点 も 指 摘 さ れ て い る 。

8 . 脱 分 化 脂 肪 細 胞 ( D F A T )

M a t s u m o t o ら ^{1 2 )}は 成 熟 脂 肪 細 胞 を 天 井 培 養 す る こ と で 、 体 外 で 脱 分 化 を 起 こ し 得 ら れ た 線 維 芽 細 胞 様 の 形 態 を し た 細 胞 群 ( D F A T ) が 、 高 い 増 殖 能 と M S C と 同 等 の 多 分 化 能 を 有 す る こ と を 明 ら か に し た 。 D F A T は 、 組 織 採 取 量 が 少 量 ( 1 g 以 下 ) で 調 製 可 能 で あ り 、 ド ナ ー の 年 齢 や 基 礎 疾 患 に 影 響 さ れ ず 高 純 度 の 細 胞 が 得 ら れ る 。 ま た 遺 伝 子 操 作 や ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 使 用 し な い こ と か ら 、 安 全 か つ 簡 便 な 方 法 で 短 期 間 に 大 量 調 製 が 可 能 で あ る 。 D F A T は M S C と 同 様 に 血 管 新 生 や 創 傷 治 癒 に 関 与 す る 種 々 の サ イ ト カ イ ン を 分 泌 し 、そ の 分 泌 パ タ ー ン は 骨 髄 M S C や A d i p o s e - d e r i v e d s t e m c e l l ( A S C ) に 類 似 し て い る ^{4 5 )}。 I n v i v o 実 験 に お い て も 、 ラ ッ ト 急 性 心 筋

梗 塞 ^{4 6 )}、 ラ ッ ト 脊 髄 損 傷 4 7 - 4 8 )、 マ ウ ス 膀 胱 凍 結 傷 害 ^{4 9 )}、 ラ ッ ト 尿 道 括 約

筋 障 害 ^{5 0 )}、 ラ ッ ト 皮 膚 欠 損 ^{5 1 )}、 ウ サ ギ 骨 欠 損 ^{4 5 )}、 ラ ッ ト 免 疫 複 合 体 性 腎 炎 モ デ ル ^{5 2 )}な ど に お い て 、 D F A T 移 植 に よ る 治 療 効 果 が 報 告 さ れ て い る 。

≪ 目 的 ≫

成 熟 脂 肪 細 胞 か ら 人 工 的 に 誘 導 さ れ る D F A T は 、 M S C に 類 似 し た 多 能 性 を 示 し 、 ま た 患 者 の 年 齢 や 基 礎 疾 患 に 影 響 さ れ ず 調 製 で き る た め 、 高 齢 者 に 好 発 す る 椎 間 板 変 性 症 に 対 し て も 椎 間 板 再 生 を 含 む 治 療 効 果 が 期 待 で き る 。 一 方 、 椎 間 板 変 性 に 対 す る D F A T 細 胞 移 植 の 効 果 に つ い て は 、 今 ま で 明 ら か に さ れ て い な い 。 本 研 究 の 目 的 は 、 自 動 喫 煙 装 置 に よ り 椎 間 板 の 変 性 を 誘 導 し た ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル に 対 し て D F A T を 静 脈 内 投 与 す る こ と で 、 椎 間 板 変 性 の 抑 制 効 果 が 認 め ら れ る か を 明 ら か に す る こ と で あ る 。

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≪ 対 象 と 方 法 ≫ 1 . 実 験 動 物

動 物 実 験 は 日 本 大 学 動 物 実 験 委 員 会 の 承 認 （ 承 認 番 号 ： 第 A P 1 3 M 0 3 0 ） を 得 て 施 行 し た 。 生 後 8 週 齢 の 雄 性 S p r a g u e D a w l e y ( S D ) ラ ッ ト は 日 本 ク レ ア 株 式 会 社 よ り 購 入 し 、 日 本 大 学 医 学 部 動 物 実 験 指 針 に 従 っ て 飼 育 し 実 験 を 行 っ た 。

2 . ラ ッ ト D F A T

S D ラ ッ ト 由 来 の D F A T は 既 報 ^{1 2 )}に 従 っ て 作 製 し 、 凍 結 保 存 し た 細 胞 ^{5 0 )} を 解 凍 、 培 養 し 実 験 に 使 用 し た 。 増 殖 培 地 は 、 1 0 % ウ シ 胎 児 血 清 ( F e t a l b o v i n e s e r u m : F B S ) 含 有 D u l b e c c o ’ s m o d i f i e d E a g l e ’ s m e d i u m ( D M E M , I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A ) を 用 い 、 3 － 4 日 毎 に 培 地 交 換 を 行 っ た 。 第 5 継 代 以 内 の 細 胞 を 実 験 に 使 用 し た 。 D F A T 調 製 方 法 の 概 略 を 図 1 に 示 す 。

3 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル の 作 製

受 動 喫 煙 に よ る ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル は 既 報 ^{3 0 )}に 従 っ て 作 製 し た 。 概 略 を 以 下 に 示 す 。 自 動 受 動 喫 煙 装 置 は ア ク リ ル 樹 脂 製 の チ ャ ン バ ー と 、 そ の チ ャ ン バ ー 内 に タ バ コ 煙 を 送 風 で き る 自 動 喫 煙 装 置 か ら 構 成 さ れ る ( 図 2 ) 。 装 置 は 5 分 間 の 喫 煙 送 風 と 5 分 間 の 室 内 換 気 を 行 い 、 1 時 間 の イ ン タ ー バ ル を お き 、 1 日 に 2 0 回 繰 り 返 し 施 行 す る よ う 設 定 し た

（ E n g i n e e r i n g S y s t e m C o . , N a g a n o , J a p a n ）。 酸 素 分 圧 連 続 測 定 装 置 （ M T 技 研 社 , T o k y o , J a p a n ） に て ボ ッ ク ス 内 は 酸 素 濃 度 が 2 0 % 、 1 5 0 m m H g を 基 準 と な る よ う に 設 定 し た 。 明 暗 サ イ ク ル は 1 2 時 間 に 設 定 し た 。 タ バ コ は 両 切 り シ ョ ー ト ピ ー ス （ J T , I n c . , T o k y o , J a p a n ） を 使 用 し た 。 S D ラ ッ ト を 上 記 の 自 動 受 動 喫 煙 装 置 内 で 8 週 間 飼 育 し 椎 間 板 変 性 を 誘 導 し た 。

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4 . 実 験 プ ロ ト コ ー ル

実 験 プ ロ ト コ ー ル を 図 3 に 示 す 。1 8 頭 の S D ラ ッ ト を ラ ン ダ ム に 、D F A T 群 、 P B S 群 、 C o n t r o l 群 の 3 群 に 群 分 け し た （ 各 群 n = 6 ）。 D F A T 群 は 8 週 間 の 喫 煙 下 で 0 週 、 2 週 、 4 週 、 6 週 の 時 点 で 0 . 5 m l リ ン 酸 化 緩 衝 液 ( P h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e : P B S ) に ラ ッ ト D F A T ( 1 × 1 0⁶ 個 ) を 溶 解 し 、 尾 静 脈 か ら 静 脈 内 投 与 し た 。D F A T 移 植 細 胞 数 は 、M a r u y a m a ら ^{5 2 )}の 既 報 に 従 い 、 静 脈 内 投 与 し て も 肺 塞 栓 な ど の 副 次 作 用 を 起 こ さ ず 、 全 身 性 の 免 疫 制 御 作 用 が 期 待 で き る 細 胞 数 と し て 1 × 1 0⁶ 個 / 頭 を 採 用 し た 。

P B S 群 は 、 8 週 間 の 喫 煙 下 で 0 週 、 2 週 、 4 週 、 6 週 の 時 点 で P B S 0 . 5 m l を 尾 静 脈 よ り 投 与 し た 。 C o n t r o l 群 は 非 喫 煙 下 、 非 投 与 で D F A T 群 、 P B S 群 と 同 様 に 8 週 間 飼 育 し た 。

実 験 終 了 時 、 イ ソ フ ル ラ ン （ 4 . 0 % ） 吸 入 麻 酔 下 に 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ( 1 0 0 m g / k g ) を 腹 腔 内 投 与 し 、 ラ ッ ト を 安 楽 死 さ せ た 。 そ の 後 、 背 部 脊 椎 直 上 よ り 縦 切 開 を 加 え 脊 椎 を 露 出 さ せ 、 脊 椎 周 囲 の 靱 帯 ・ 筋 な ど の 軟 部 組 織 を 切 除 し 、 腰 椎 と 尾 椎 の 組 織 を 摘 出 し た 。 腰 椎 よ り 椎 間 板 を 単 離 後 、 椎 間 板 に 尖 刀 を 用 い て 割 を 入 れ 中 心 部 の 髄 核 の み を 摘 出 し 、 直 ち に - 8 0 ℃ で 凍 結 保 存 し 、 プ ロ テ オ グ リ カ ン 測 定 お よ び 遺 伝 子 発 現 解 析 に 用 い た 。 尾 椎 組 織 ( C o 6 ～ 9 ) は 1 0 ％ 緩 衝 ホ ル マ リ ン で 固 定 し 、 組 織 学 的 評 価 に 用 い た 。 ま た 安 楽 死 さ せ た ラ ッ ト は 胸 骨 正 中 切 開 後 、 肺 組 織 を 摘 出 し 、 直 ち に - 8 0 ℃ で 凍 結 保 存 し 、 遺 伝 子 発 現 解 析 に 用 い た 。

5 . 組 織 学 的 検 討

1 0 % ホ ル マ リ ン で 固 定 し た 尾 椎 組 織 は K C X（ 塩 酸 と D E T A の 混 合 液 ）に て 脱 灰 し 、 パ ラ フ ィ ン 包 埋 後 に 3 μ m 厚 で 薄 切 し た 。 脱 パ ラ フ ィ ン 後 に 薄 切 標 本 を H e m a t o x y l i n a n d E o s i n ( H E ) 染 色 、 E l a s t i c a v a n G i e s o n ( E V G ) 染 色 、 ア リ シ ア ン ブ ル ー 染 色 を 行 っ た 。 作 製 し た 標 本 は 、 正 立 顕 微 鏡

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O l y m p u s B X 5 1 ( O l y m p u s , T o k y o , J a p a n ) で 観 察 し 、 顕 微 鏡 デ ジ タ ル カ メ ラ D P 2 0 - 5 ( O l y m p u s ) を 用 い て 写 真 撮 影 を 行 っ た 。

6 . プ ロ テ オ グ リ カ ン の 定 量

各 群 6 頭 の 腰 椎 椎 間 板 よ り 髄 核 を 摘 出 し 、6 頭 分 を 合 わ せ て 1 . 5 m l t u b e 内 に 入 れ 、 - 8 0 ℃ で 凍 結 保 存 し た 。 保 存 し た 髄 核 は 、 凍 結 乾 燥 し 乾 燥 重 量 を 測 定 し た 。そ の 後 、0 . 5 m l の 0 . 1 ％ プ ロ ナ ー ゼ 液 ( M e r c k K G a A , D a r m s t a d t , G e r m a n y ）を 加 え 、6 0 ℃ で 3 時 間 消 化 し た 。得 ら れ た 試 料 原 液 を P B S で 5 0 0 倍 希 釈 し P r o t e o g l y c a n D e t e c t i o n K i t （ A S B - 8 0 0 0 , L o t . M A 2 0 1 1 G , A s t a r t e B i o l o g i c s L L C , B o t h e l l , W A ） を 使 用 し 、 使 用 マ ニ ュ ア ル に 従 い プ ロ テ オ グ リ カ ン （ P G ） 量 を 測 定 し た 。 測 定 波 長 は 5 3 0 n m と し 、 測 定 キ ッ ト 中 の C h o n d r o i t i n s u l f a t e （ C S ）を 標 準 と し て 作 成 し た 検 量 線 に 基 づ い て 、 検 体 中 の P G 量 を 乾 燥 重 量 当 た り の C S 相 当 量 と し て 算 出 し た 。 検 体 中 の P G 量 （ C S 相 当 量 ） は 以 下 の 式 よ り 算 出 し た 。

測 定 用 試 料 原 液 中 の P G 量 （ m g ） ＝

測 定 値 （ μ g / m L ） × 希 釈 倍 率 × 消 化 液 量 （ 0 . 5 0 0 m L ） ／ 1 0 0 0

検 体 乾 燥 重 量 あ た り の P G 量 （ m g / m g d r y w t . ） ＝

測 定 用 試 料 原 液 中 の P G 量 （ m g ） ／ 乾 燥 重 量 （ m g d r y w t . ）

7 . m R N A の 定 量

髄 核 及 び 肺 組 織 の m R N A 発 現 変 化 は 、 T a q M a n g e n e e x p r e s s i o n a s s a y s ( A p p l i e d B i o n s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) を 用 い た リ ア ル タ イ ム 逆 転 写 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 ( R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n : R T - P C R ) 法 に て 解 析 し た 。 各 群 6 頭 の 腰 椎 椎 間 板 よ り 髄 核 を 摘

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出 し 、T R I Z O L（ I n v i t r o g e n ）中 で 撹 拌 し 、t o t a l R N A を 抽 出 し た 。T o t a l R N A を D N a s e Ⅰ 処 理 後 、R a n d o m h e x a m e r を 6 5 ℃ 5 分 間 反 応 さ せ 、S u p e r S c r i p t

Ⅲ を 5 5 ℃ 6 0 分 、 7 0 ℃ 1 5 分 間 反 応 さ せ 、 c D N A を 合 成 し た 。 c D N A を 1 0 n g 使 用 し 、 T a q M a n U n i v e r s a l M a s t e r M i x Ⅱ ( A p p l i e d B i o n s y s t e m s ) と 目 的 遺 伝 子 の p r i m e r / p r o b e を 加 え 、 2 0 μ l で P C R 反 応 を 行 っ た 。 P C R 反 応 は 7 3 0 0 R e a l T i m e P C R S y s t e m ( A p p l i e d B i o n s y s t e m s ) を 用 い て 、 初 期 活 性 化 を 9 5 ℃ 2 分 、 変 性 工 程 を 9 6 ℃ 3 0 秒 、 ア ニ ー リ ン グ と D N A の 伸 長 反 応 工 程 を 6 0 ℃ 3 0 秒 、7 2 ℃ 1 分 を 1 サ イ ク ル と し 3 0 サ イ ク ル 施 行 し た 。解 析 遺 伝 子 と し て 以 下 の p r i m e r / p r o b e を 使 用 し た 。S o x 9 ( R n 0 1 7 5 1 0 6 9 _ m H ) 、 a g g r e c a n ( R n 0 0 5 7 3 4 2 4 _ m 1 ) 、v e r s i c a n ( R n 0 1 4 9 3 7 5 5 _ m 1 ) 、H G F ( H e p a t o c y t e g r o w t h f a c t o r : R n 0 1 4 4 2 4 7 3 _ m 1 ) 、 P G E 2 ( P r o s t a g l a n d i n E 2 : R n 0 1 4 3 5 5 3 5 _ g 1 ) 、 T S G - 6 ( T u m o r n e c r o s i s f a c t o r - s t i m u l a t e d g e n e - 6 : R n 0 1 7 5 3 8 7 1 _ m 1 ) 、 T G F β 1 ( T r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - β 1 : R n 0 0 5 7 2 0 1 0 _ m 1 ) 。 G A P D H （ G l y c e r a l d e h y d e 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e : R n 0 1 7 7 5 7 6 3 _ g 1 ） を 内 在 性 コ ン ト ロ ー ル 遺 伝 子 と し た 。 全 て の サ ン プ ル は t r i p l i c a t e に て 測 定 し た 。 遺 伝 子 発 現 の 比 較 は 、 G A P D H 発 現 量 に 対 す る 相 対 的 定 量 解 析 法 ( c o m p a r a t i v e C t 法 ) に よ っ て 行 っ た 。

8 . 統 計 処 理

統 計 解 析 は P R I S M 5 ( G r a p h P a d s o f t w a r e , L a J o l l a , C A ) を 用 い て 行 っ た 。 群 間 比 較 に は U n p a i r e d S t u d e n t ’ s t - t e s t を 使 用 し 、 P < 0 . 0 5 を 統 計 学 的 有 意 差 あ り と 判 定 し た 。

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≪ 結 果 ≫

1 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト に お け る 椎 間 板 組 織 所 見 の 比 較

D F A T 群 、P B S 群 、C o n t r o l 群 か ら 椎 間 板 を 摘 出 し 組 織 学 的 検 討 を 行 っ た 。 H E 染 色 像 を 図 4 に 示 す 。 非 喫 煙 C o n t r o l 群 で は 、 軟 骨 細 胞 と 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス か ら 構 成 さ れ る 正 常 の 髄 核 組 織 が 認 め ら れ 、 周 囲 の 線 維 輪 で は エ オ ジ ン 好 性 で 一 定 の 層 状 配 列 を 認 め た 。 椎 間 板 と 椎 体 の 境 界 部 に は 軟 骨 終 板 が 認 め ら れ た 。8 週 間 の 受 動 喫 煙 を 行 っ た P B S 群 で は 、髄 核 組 織 の 明 ら か な 破 壊 は 認 め ら れ な か っ た が 、 細 胞 密 度 の 減 少 が 認 め ら れ た 。 一 方 、 線 維 輪 及 び 軟 骨 終 板 に は 明 ら か な 異 常 は 認 め ら れ な か っ た 。 受 動 喫 煙 を 行 い D F A T を 移 植 し た D F A T 群 で は 、 髄 核 組 織 構 造 は 保 た れ て お り 細 胞 密 度 の 減 少 も P B S 群 に 比 べ 軽 度 で あ っ た 。P B S 群 と 同 様 に 線 維 輪 や 軟 骨 終 板 に は 異 常 所 見 は 認 め ら れ な か っ た 。

結 合 組 織 性 酸 性 ム コ 多 糖 類 を 青 色 に 染 め る ア リ シ ア ン ブ ル ー 染 色 で は 、 髄 核 組 織 及 び 軟 骨 終 板 が 青 色 に 染 色 さ れ た （ 図 5 ）。 C o n t r o l 群 で は 、 髄 核 組 織 が 均 一 に ア リ シ ア ン ブ ル ー 強 陽 性 を 示 し た 。P B S 群 で は 、髄 核 組 織 の 特 に 中 心 部 に お い て ア リ シ ア ン ブ ル ー 陰 性 と な る 領 域 が 認 め ら れ た 。 D F A T 群 で は 、 P B S 群 に 比 べ 髄 核 組 織 の ア リ シ ア ン ブ ル ー 陰 性 領 域 が 少 な い 傾 向 が 認 め ら れ た 。軟 骨 終 板 の ア リ シ ア ン ブ ル ー 染 色 像 は 、3 群 間 に 明 ら か な 差 を 認 め な か っ た 。

弾 性 線 維 を 紫 黒 色 、 膠 原 線 維 を 赤 色 に 染 め る E V G 染 色 で は 、 髄 核 組 織 内 部 お よ び 軟 骨 終 板 が 紫 黒 色 、線 維 輪 が 赤 色 に 染 色 さ れ た（ 図 6 ）。C o n t r o l 群 で は 、 髄 核 組 織 中 に 紫 黒 色 で 染 色 さ れ る 弾 性 線 維 が 豊 富 に 認 め ら れ た 。 こ れ に 対 し P B S 群 で は 、 髄 核 組 織 辺 縁 を 中 心 に 弾 性 線 維 が 低 下 し て い る 所 見 が 認 め ら れ た 。 D F A T 群 で は P B S 群 に 比 べ 髄 核 組 織 中 の 弾 性 線 維 の 低 下 が 軽 度 で あ っ た 。線 維 輪 や 軟 骨 終 板 の E V G 染 色 で は 、3 群 間 で 明 ら か な 組 織 学 的 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。

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以 上 の 結 果 か ら 、8 週 間 の 受 動 喫 煙 に よ り 髄 核 組 織 中 の 細 胞 密 度 の 低 下 と 結 合 組 織 性 酸 性 ム コ 多 糖 類 及 び 弾 性 線 維 の 蓄 積 低 下 を 主 徴 と す る 椎 間 板 変 性 が 起 こ り 、 D F A T の 全 身 投 与 は こ れ ら の 組 織 学 的 変 化 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

2 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト に お け る 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン の 定 量 比 較

次 に D F A T 群 、 P B S 群 、 C o n t r o l 群 の 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン を 定 量 比 較 し た 。 8 週 間 の 受 動 喫 煙 を 行 っ た P B S 群 の 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン 量 ( 0 . 2 5 4 m g / m g d r y w t ) は 、 非 喫 煙 C o n t r o l 群 ( 0 . 5 8 1 m g / m g d r y w t ) に 比 べ 5 2 . 2 % の 減 弱 を 認 め た（ 図 7 ）。D F A T 群 の 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン 量 は 、 0 . 3 7 3 m g / m g d r y w t で あ り 、 C o n t r o l 群 に 対 す る 減 弱 率 は 3 5 . 9 % と P B S 群 に 比 べ 低 率 で あ っ た 。以 上 の 結 果 か ら 、8 週 間 の 受 動 喫 煙 に よ り 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン の 減 少 が 認 め ら れ 、 D F A T の 全 身 投 与 は 喫 煙 に よ る 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン 量 の 減 少 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

3 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト に お け る 髄 核 内 軟 骨 関 連 遺 伝 子 発 現 の 比 較

次 に D F A T 群 、 P B S 群 、 C o n t r o l 群 の 髄 核 内 軟 骨 関 連 遺 伝 子 の m R N A 発 現 を リ ア ル タ イ ム R T - P C R 法 に て 定 量 比 較 し た 。 実 験 経 過 中 に D F A T 群 の 1 頭 が 死 亡 し た た め 、 D F A T 群 ( N = 5 ) 、 P B S 群 ( N = 6 ) 、 C o n t r o l 群 ( N = 6 ) で 群 間 解 析 を 行 っ た 。軟 骨 初 期 分 化 マ ー カ ー で あ る S o x 9 の m R N A 発 現 は C o n t r o l 群 に 比 べ 、 P B S 群 で 有 意 に 低 下 し た ( P < 0 . 0 5 ) （ 図 8 ）。 D F A T 群 で は 、 喫 煙 に よ る S o x 9 発 現 低 下 が 抑 制 さ れ る 傾 向 が あ り 、 P B S 群 に 比 べ 有 意 に 高 値 を 示 し た ( P < 0 . 0 5 ) 。 軟 骨 特 異 的 プ ロ テ オ グ リ カ ン で あ る ア グ リ カ ン 及 び バ ー シ カ ン の 遺 伝 子 発 現 解 析 結 果 を 図 9 、 1 0 に 示 す 。 ア グ リ カ ン の m R N A 発 現 は C o n t r o l 群 に 比 べ 、P B S 群 で 有 意 に 低 下 し た ( P < 0 . 0 5 )（ 図 9 ）。D F A T 群 で は 、 喫 煙 に よ る ア グ リ カ ン の 発 現 低 下 が 抑 制 さ れ る 傾 向 が あ り 、 P B S

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群 に 比 べ 有 意 に 高 値 を 示 し た ( P < 0 . 0 1 ) 。 バ ー シ カ ン の m R N A 発 現 も 同 様 の 傾 向 が 認 め ら れ た が 、 各 群 間 に 統 計 学 的 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た （ 図 1 0 ）。 以 上 の 結 果 か ら 、 8 週 間 の 受 動 喫 煙 に よ り 髄 核 内 軟 骨 関 連 遺 伝 子 の 発 現 減 少 が 認 め ら れ 、 D F A T の 全 身 投 与 は こ の 減 少 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

4 . 受 動 喫 煙 ラ ッ ト に お け る 肺 組 織 の 免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 発 現 の 比 較 次 に D F A T 群 、P B S 群 の 肺 組 織 に お け る 免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 の m R N A 発 現 を リ ア ル タ イ ム R T - P C R 法 に て 定 量 比 較 し た 。 免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 と し て H G F 、P G E 2 、T S G - 6 、T G F β 1 を 選 択 し 測 定 し た 。D F A T 群 は P B S 群 に 比 較 し 、 H G F 、P G E 2 、T S G - 6 が 有 意 に 高 値 で あ っ た ( P < 0 . 0 5 )（ 図 1 1 ）。T G F β 1 も D F A T 群 は P B S 群 に 比 較 し て 高 い 傾 向 が 認 め ら れ た が 、 統 計 学 的 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 D F A T 移 植 に よ り 肺 組 織 に お け る 免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 の 発 現 が 亢 進 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

≪ 考 察 ≫

腰 痛 は 外 傷 や 腫 瘍 、 感 染 、 腰 部 脊 柱 管 狭 窄 症 、 腰 椎 椎 間 板 ヘ ル ニ ア 、 腰 椎 椎 間 板 変 性 症 な ど 多 く の 病 態 か ら 引 き 起 こ さ れ る 。 な か で も 、 椎 間 板 変 性 症 は 、 単 独 で 腰 痛 の 原 因 に な る ば か り か 椎 間 板 が 変 性 を 起 こ す こ と で 、 脊 柱 の 変 形 や 不 安 定 性 か ら 脊 椎 後 側 弯 症 、 脊 柱 管 狭 窄 症 を 惹 起 す る 。 こ れ に よ り 、 腰 痛 だ け で な く 下 肢 痛 を 認 め る ま で に 至 る 。 喫 煙 と 椎 間 板 変 性 は 以 前 よ り 関 連 が あ り さ ま ざ ま な 報 告 が さ れ て い る 5 3 - 5 4 )。

今 回 、 ラ ッ ト に 受 動 喫 煙 さ れ る こ と に よ っ て 、 髄 核 細 胞 の 減 少 と 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン の 減 少 が 認 め ら れ た 。 こ の 所 見 は 、 本 モ デ ル を 用 い た 以 前 の 報 告 に 一 致 す る ^{3 0 )}。 タ バ コ に 含 有 さ れ る 化 学 物 質 に は 、 椎 間 板 の 細 胞 増 殖 率 を 低 下 さ せ 、 プ ロ テ オ グ リ カ ン や コ ラ ー ゲ ン の 生 合 成 活 性

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を 抑 制 す る 作 用 が あ る ^{5 5 )}。ま た 、タ バ コ は 椎 間 板 細 胞 に 作 用 し て M M P s や A D A M T S を 活 性 化 し 、 T I M P を 抑 制 す る こ と で プ ロ テ オ グ リ カ ン 産 生 を 低 下 さ せ る ^{2 7 )}。 さ ら に 、 軟 骨 終 板 に お け る 血 管 網 の 構 造 変 化 を 起 こ し 、 椎 間 板 内 へ の 血 流 低 下 か ら 低 栄 養 、 低 酸 素 状 態 を 起 こ す と さ れ る 5 6 - 5 7 )。 こ の よ う に タ バ コ は 、 椎 間 板 へ の 直 接 的 な 組 織 障 害 や 血 流 障 害 に よ っ て 、 変 性 を 惹 起 す る と さ れ る ^{5 8 )}。 わ れ わ れ の 実 験 結 果 か ら も ８ 週 間 の 受 動 喫 煙 に よ り ラ ッ ト 髄 核 細 胞 密 度 の 低 下 と プ ロ テ オ グ リ カ ン の 減 少 が 認 め ら れ て お り 、 椎 間 板 の 変 性 は 上 述 し た よ う な メ カ ニ ズ ム に 起 因 す る と 考 え ら れ た 。

今 回 の 実 験 結 果 で は 、 D F A T 静 脈 内 投 与 に よ っ て 喫 煙 に よ る 椎 間 板 変 性 の 抑 制 と プ ロ テ オ グ リ カ ン 減 少 が 抑 制 さ れ た 。 喫 煙 に よ る 椎 間 板 変 性 に 対 し 、 D F A T が 治 療 効 果 を 示 す こ と は い ま ま で に 報 告 さ れ て お ら ず 、 新 規 性 の 高 い 研 究 成 果 で あ る と 考 え ら れ る 。 種 々 の 動 物 モ デ ル に 対 し M S C 移 植 が 髄 核 細 胞 の 変 性 を 抑 制 し 、 髄 核 内 プ ロ テ オ グ リ カ ン を 増 加 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る ^{5 9 )}。 M S C に 類 似 し た 形 質 と 多 能 性 を 有 す る D F A T も 、 M S C と 同 様 の 髄 核 変 性 抑 制 作 用 を 有 す る こ と が 示 唆 さ れ る 。今 ま で に 報 告 さ れ て い る M S C の 治 療 効 果 の 多 く は 、 椎 間 板 に 直 接 移 植 す る 方 法 で 得 ら れ た 研 究 成 果 で あ る ^{4 3 )}。 今 回 の 検 討 で は 、 D F A T を 静 脈 か ら 全 身 投 与 す る こ と に よ り 、 治 療 効 果 が 認 め ら れ た 。 椎 間 板 変 性 症 は 加 齢 に 伴 い 全 身 性 に 椎 間 板 が 変 性 す る 変 性 性 疾 患 で あ る こ と か ら 、 全 身 投 与 に よ る 治 療 効 果 が 確 認 さ れ た こ と は 、 細 胞 を 用 い た 治 療 戦 略 を 確 立 す る 上 で 意 義 が 大 き い と 考 え ら れ る 。 椎 間 板 変 性 症 に 対 し 細 胞 治 療 を 行 う 場 合 、 病 変 部 位 へ の 局 所 投 与 ま た は 全 身 投 与 の ど ち ら が よ り 効 果 が 高 い か 明 確 に な っ て い な い 。M S C と 髄 核 細 胞 の 共 培 養 に よ り M S C が 髄 核 細 胞 へ 分 化 す る と の 報

告 ^{6 0 )}や 、 変 性 し た 椎 間 板 組 織 に M S C を 移 植 す る こ と に よ り M S C が 髄 核 細

胞 様 の 形 質 を 獲 得 す る と い っ た 報 告 6 1 - 6 2 )が あ る 。 M S C が 髄 核 細 胞 と 直 接

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接 触 す る こ と に よ り 髄 核 細 胞 様 の 形 質 を 獲 得 す る と い っ た 観 点 で は 、 変 性 椎 間 板 へ の 局 所 投 与 が 望 ま し い と 考 え ら れ る 。 一 方 、 椎 間 板 は 非 常 に 血 流 に 乏 し い 組 織 で あ る こ と か ら 、 椎 間 板 へ の 局 所 投 与 に よ り 移 植 細 胞 の 長 期 生 着 が 得 ら れ る と は 考 え に く い 。 移 植 細 胞 の 長 期 生 存 、 生 着 を 考 え た 場 合 、 全 身 投 与 の ほ う が 有 利 で あ る と 考 え ら れ る 。 実 際 、 静 脈 内 投 与 し た M S C の 大 部 分 が 肺 に ト ラ ッ プ さ れ 、 一 定 期 間 生 存 し た 後 に 一 部 の 細 胞 は 傷 害 組 織 に 移 行 す る こ と が 報 告 さ れ て い る ^{6 3 )}。 今 後 、 移 植 細 胞 の デ リ バ リ ー 法 の 違 い に よ り 治 療 効 果 に ど の よ う な 違 い が 起 こ る か 検 討 す る 必 要 が あ る 。

今 回 、 喫 煙 に よ り 髄 核 細 胞 の 軟 骨 関 連 遺 伝 子 の 発 現 が 低 下 し 、 D F A T 投 与 に よ り そ の 発 現 低 下 が 抑 制 さ れ る と い う 結 果 が 得 ら れ た 。 変 性 椎 間 板 内 へ の M S C 移 植 に よ っ て 軟 骨 関 連 遺 伝 子 の 発 現 が 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い る ^{6 4 )}が 、 全 身 投 与 に よ り 同 様 の 効 果 が 得 ら れ る こ と は 検 索 し た 限 り で は 報 告 が な い 。近 年 、M S C を 静 脈 内 投 与 す る こ と に よ り 造 血 幹 細 胞 移 植 後 の G V H D 、 全 身 性 エ リ テ マ ト ー デ ス 、 心 筋 梗 塞 、 急 性 肺 障 害 な ど 多 く の 疾 患 に 対 し 治 療 効 果 が あ る こ と が 明 ら か に さ れ 、急 性 G V H D 、心 筋 梗 塞 、 肝 硬 変 な ど を 対 象 疾 患 と し た M S C 全 身 投 与 に よ る 細 胞 治 療 の 臨 床 研 究 も 開 始 さ れ て い る ^{6 5 )}。 こ の よ う な 、 M S C 全 身 投 与 に よ る 免 疫 抑 制 作 用 や 抗 炎 症 作 用 は 肺 に ト ラ ッ プ さ れ た M S C と そ の 周 囲 組 織 と の 相 互 作 用 に よ り 発 現 さ れ る 種 々 の 液 性 因 子 が 全 身 性 に 作 用 す る 結 果 で あ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 こ の よ う な 液 性 因 子 と し て 現 在 ま で に T S G - 6 , I n t e r l e u k i n - 1 r e c e p t o r a n t a g o n i s t ( I L - 1 R A ) , P G E , I n d o l e a m i n e 2 , 3 - d i o x y g e n a s e , N i t o r i c o x i d e ( N O ) , T G F - β 1 , S t r o m a l c e l l d e r i v e d f a c t o r ( S D F - 1 ) , k e r a t i n o c y t e g r o w t h f a c t o r , a n g i o p o i e t i n - 1 , L L - 3 7 な ど が 報 告 さ れ て い る 6 6 - 6 7 )。 今 回 、 D F A T 全 身 投 与 に よ る 肺 組 織 の 遺 伝 子 発 現 変 化 を 解 析 し た 結 果 H G F 、 P G E 2 、 T S G - 6 と い っ た 免 疫 制 御 や 抗 炎 症 に

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関 与 す る 遺 伝 子 の 発 現 が 有 意 に 増 加 し て い た 。H G F は 血 管 内 皮 細 胞 に 存 在 す る そ の 特 異 的 受 容 体 c - m e t を 介 し て 、 強 力 な 血 管 新 生 効 果 を 有 す る 。 さ ら に 、 細 胞 の 運 動 性 や 増 殖 を 制 御 し 、 軟 骨 細 胞 に 対 し て プ ロ テ オ グ リ カ ン の 合 成 を 調 製 す る 役 割 を 持 つ ^{6 8 )}。 P G E 2 は 、 I L - 2 、 I N F - γ 、 T N F - α 、 I L - 1 、 ロ イ コ ト リ エ ン な ど の 種 々 の 炎 症 性 メ デ ィ エ ー タ ー の 産 生 を 抑 制 す る こ と に よ り 抗 炎 症 作 用 ・ 免 疫 制 御 作 用 を 示 す 。 ま た 細 胞 内 の c A M P を 上 昇 さ せ る こ と で 、 V a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) の 生 成 を 誘 導 し 、 血 管 新 生 を 増 強 さ せ る こ と が 知 ら れ て い る 。 さ ら に 、 P G E 2 は 髄 核 細 胞 に 発 現 す る E - p r o s t a n o i d ( E P ) 受 容 体 を 介 し て W n t -- c a t e n i n 経 路 を 活 性 化 し 、 そ の 標 的 遺 伝 子 の 発 現 調 節 に 関 与 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る ^{6 9 )}。静 脈 内 投 与 し た D F A T が 血 流 の 乏 し い 椎 間 板 組 織 に 効 率 よ く 移 行 す る と は 考 え に く く 、 D F A T 静 脈 内 投 与 に よ る 髄 核 の 軟 骨 関 連 遺 伝 子 の 発 現 増 加 は 、 肺 組 織 か ら 分 泌 さ れ た こ れ ら の 免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 の エ ン ド ク ラ イ ン 効 果 に 起 因 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る 。 ま た 、 H G F や P G E 2 の 血 管 新 生 作 用 が 、 椎 体 終 板 に 存 在 す る 毛 細 血 管 網 ( C a p i l l a r y b e d s ) の 血 流 障 害 を 改 善 し 、 椎 間 板 へ の 血 流 を 維 持 し た こ と で 椎 間 板 変 性 を 抑 制 し た 可 能 性 も 考 え ら れ る 。 近 年 、 M S C か ら 分 泌 さ れ る T S G - 6 が 、 急 性 心 筋 梗 塞 、 急 性 肺 障 害 、 脊 髄 損 傷 な ど 種 々 の 病 態 に 対 す る M S C の 治 療 効 果 に 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と が 明 ら か に さ れ て い る ^{6 5 )}。 ま た 最 近 、 D F A T 静 脈 内 投 与 に よ る 免 疫 複 合 体 性 腎 炎 の 進 行 抑 制 効 果 に も 、T S G - 6 が 関 与 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る ^{5 2 )}。 ど の 液 性 因 子 が 主 体 と な っ て 髄 核 変 性 を 抑 制 す る か に つ い て は 今 後 の 検 討 課 題 で あ る 。 ま た 、 今 回 の 研 究 は 、 8 週 間 の 受 動 喫 煙 を 施 行 し な が ら D F A T を 静 脈 内 投 与 し て お り 、 椎 間 板 変 性 過 程 に お け る 細 胞 移 植 の 効 果 を 検 討 し た モ デ ル で あ る 。 し た が っ て 本 研 究 で は 、 す で に 椎 間 板 変 性 を 起 こ し て い る 患 者 に 対 し て 効 果 が あ る か に つ い て は 明 ら か に な っ て い な い 。 今 後 、 椎 間 板 変 性 が 完 成 し た モ デ ル に 対 す

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る 治 療 効 果 に つ い て も 検 討 す る 必 要 が あ る 。 今 回 の 研 究 結 果 か ら 、 D F A T の 静 脈 内 投 与 は 、レ ン ト ゲ ン に て 椎 間 板 高 が 保 た れ て い る が 、M R I に て 椎 間 板 の 輝 度 変 化 が あ り 椎 体 終 板 の 変 化 を 伴 っ て い る よ う な 初 期 の 椎 間 板 変 性 症 や 、 椎 間 板 変 性 は 認 め ら れ る が 脊 柱 変 形 を 起 こ し て い な い 進 行 過 程 に あ る 症 例 な ど が よ い 適 応 と な る と 考 え ら れ る 。

高 齢 者 に 好 発 す る 椎 間 板 変 性 症 に 対 し て 細 胞 治 療 を 行 う 場 合 、 年 齢 や 基 礎 疾 患 に 影 響 さ れ ず 調 製 で き る 細 胞 源 が 望 ま れ る 。 骨 髄 M S C や A S C は 患 者 年 齢 や 基 礎 疾 患 に 影 響 を う け 、 必 要 な 細 胞 数 を 得 ら れ な い 症 例 が 存 在 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 こ れ に 対 し て D F A T は 高 齢 者 で も 豊 富 に 存 在 す る 皮 下 の 成 熟 脂 肪 細 胞 か ら 調 製 す る た め 、 患 者 の 年 齢 や 全 身 状 態 に 左 右 さ れ ず 大 量 調 製 が 可 能 で あ る 。 こ の よ う な 理 由 に よ り 、 D F A T は 椎 間 板 変 性 症 に 対 す る 細 胞 治 療 用 細 胞 と し て 有 望 で あ る と 考 え ら れ た 。

≪ ま と め ≫

受 動 喫 煙 ラ ッ ト 椎 間 板 変 性 モ デ ル に 対 し て D F A T を 静 脈 内 投 与 し 、 椎 間 板 変 性 の 抑 制 効 果 が 認 め ら れ る か 検 討 し た 。8 週 間 の 受 動 喫 煙 に よ り 髄 核 組 織 中 の 細 胞 密 度 の 減 少 と プ ロ テ オ グ リ カ ン 低 下 を 主 徴 と す る 椎 間 板 変 性 が 惹 起 さ れ た 。 D F A T の 全 身 投 与 は 、 受 動 喫 煙 に よ る 髄 核 組 織 の 変 性 や プ ロ テ オ グ リ カ ン 量 の 減 少 を 抑 制 し 、 軟 骨 関 連 遺 伝 子 の 発 現 低 下 を 抑 制 し た 。 ま た D F A T の 全 身 投 与 に よ り 肺 組 織 の 免 疫 制 御 関 連 遺 伝 子 の 発 現 増 加 が 認 め ら れ た 。 椎 間 板 変 性 症 に 対 す る D F A T を 用 い た 細 胞 治 療 の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

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謝 辞

本 稿 を 終 え る に あ た り 、 御 指 導 、 御 校 閲 を 賜 っ た 日 本 大 学 医 学 部 整 形 外 科 学 講 座 德 橋 泰 明 教 授 に 心 よ り 厚 く 御 礼 申 し 上 げ る と と も に 、 ま た 研 究 に 際 し 適 切 な 御 指 導 を 頂 い た 日 本 大 学 医 学 部 機 能 形 態 学 系 細 胞 再 生 ・ 移 植 医 学 分 野 松 本 太 郎 教 授 、 ス タ ッ フ の 方 々 に 心 よ り 深 謝 い た し ま す 。

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図 1 ． 脱 分 化 脂 肪 細 胞 （ D F A T ） 調 製 方 法

皮 下 脂 肪 組 織 1 ～ ２ g を コ ラ ゲ ナ ー ゼ 処 理 し 、 低 速 度 遠 心 分 離 す る こ と で 単 離 さ れ る 成 熟 脂 肪 細 胞 を 2 0 ％ F B S 含 有 D M E M 培 地 で 満 た し た フ ラ ス コ 内 で 天 井 培 養 を 行 う 。 成 熟 脂 肪 細 胞 は フ ラ ス コ 天 井 面 で 脱 分 化 し 、 分 裂 し D F A T が 産 生 さ れ る 。 1 週 間 後 に フ ラ ス コ を 反 転 さ せ 付 着 培 養 を 行 う こ と に よ り D F A T を 増 殖 さ せ る こ と が で き る 。

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図 2 ． 受 動 喫 煙 ボ ッ ク ス

受 動 喫 煙 ボ ッ ク ス は ア ク リ ル 樹 脂 製 の チ ャ ン バ ー と 、 そ の チ ャ ン バ ー 内 に タ バ コ 煙 を 送 風 で き る 自 動 喫 煙 装 置 か ら 構 成 さ れ る 。 自 動 喫 煙 装 置 は 5 分 間 の 喫 煙 送 風 と 5 分 間 の 室 内 換 気 を 行 い 、1 時 間 の イ ン タ ー バ ル を お き 、1 日 に 2 0 回 繰 り 返 し 施 行 す る よ う 設 定 し た 。( A : 受 動 喫 煙 ボ ッ ク ス の 写 真 B : 模 式 図 )

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図 3 ． 実 験 プ ロ ト コ ー ル

オ ス S D ラ ッ ト 8 週 齢 を 使 用 し 、 D F A T 群 、 P B S 群 、 C o n t r o l 群 、 各 群 6 頭 と 設 定 し た 。8 週 間 の 喫 煙 下 で 0 週 、2 週 、4 週 、6 週 に 、D F A T 群 は D F A T 1 × 1 0⁶ 個 / 0 . 5 m l を 、 P B S 群 に は P B S 0 . 5 m l を 尾 静 脈 か ら 静 脈 内 投 与 し た 。 C o n t r o l 群 は 非 喫 煙 下 、 非 投 与 で 8 週 間 飼 育 し た 。 8 週 間 の 飼 育 後 （ 1 6 週 齢 ） に 安 楽 死 さ せ 椎 間 板 と 肺 を 摘 出 し 、 評 価 を 行 っ た 。