科学研究費助成事業（科学研究費補助金）研究成果報告書

様式Ｃ－１９

科学研究費助成事業（科学研究費補助金）研究成果報告書

平成

24

年

4

月

19

日現在

研究成果の概要（和文）：

Protease-activated receptor (PAR)は、特定のプロテアーゼによって活性化され

るGタンパク共役型

7

回膜貫通型受容体である。最近の研究では、PARは分泌など種々の細胞機能に関わってい るとの報告がある。本研究では、ラット耳下腺を用いてPAR-2の機能をカルシウムイメージング法を用いて検討し た。耳下腺においてPAR-2受容体の発現が強く認められた。PAR-2アゴニストのSLIGRL-NH₂の投与によって

[Ca

²⁺

]

_iの上昇を認めた。これは細胞外のCa²⁺除去によっても消失せず、Gd³⁺投与によっても同様であった。また、

NOのdonorの投与でこの流入は増強した。これらのことから、PAR-2

は細胞内ストアを刺激して[Ca²⁺

]

_iの上昇を引 き起こし、続くCa²⁺濃度の上昇は、non-capacitative calcium entry (NCCE) によるものと示唆された。また、

PAR-2APによる[Ca

²⁺

]

_iの上昇は、一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤のL－NAME投与によって部分的に抑制さ れ、リアノジン受容体抑制剤のテトラカイン存在下やADPリボシルサイクラーゼを抑制しても同様な部分抑制が見 られた。これに対し、calmodulin kinase IIを抑制することによって[Ca²⁺

]

_iの上昇完全に阻害された。その他各種キ ナーゼ阻害剤使用によって[Ca²⁺

]

_i上昇に変化は認められなかった。また、calmodulinを抑制した場合も同様に完 全抑制が見られた。以上から、PAR-2受容体刺激による[Ca²⁺

]

_iの上昇にNOS、リアノジン受容体が関与しているこ とが示唆され、これらの上流にCalmodulinやCAM kinase IIが存在していることが示唆された。

研究成果の概要（英文）：

Protease-activated receptors (PARs) represent a novel class seven transmembrane domain G-protein coupled receptors, which are activated by proteolytic cleavage. Recent studies have reported that PARs are present in a variety of cells and have been prominently implicated in the regulation of a number of vital functions. The issue of whether the stimulation of PARs induces responses in parotid glands was examined;

with special reference to intracellular Ca

²⁺

([Ca

²⁺

]

i

) dynamics during PARs stimulation. In the present study, PAR2 mRNA was expressed strongly in the parotid glands. In parotid acinar cells, PAR2-activating peptide (PAR2-AP), SLIGRL-NH

2

, induced an increase in [Ca

²⁺

]

i

. Both removing of extracellular Ca

²⁺

and using of Ca

²⁺

channel blockers did not inhibit the PAR2-AP-induced [Ca

²⁺

]

i

increase. The response to PAR-2 activation was mainly caused by Ca

²⁺

mobilization from intracellular Ca

²⁺

stores. This peptide induced Ca

²⁺

release and entry were partially inhibited by the nitric oxide synthase (NOS) inhibitor, L-NAME. The NO donor, GEA 3162, but not 8-bromo-cGMP, mimicked the effects of PAR2 in activating non capacitative calcium entry (NCCE). Both KN93 (a CAM kinase II inhibitor) and W7 (a calmodulin inhibitor) completely blocked a Ca

²⁺

release from intracellular Ca

²⁺

store and a Ca

²⁺

influx from extracellular spaces. Tetracaine and DHAB partially blocked these increases.

These results indicate that PAR2-AP activates NCCE pathway. And we proposed that an effect of PAR-2 in parotid gland is dependent on CAMKII and a PAR2-AP activates the ryanodine-like receptors.

交付決定額

（金額単位：円）

直接経費 間接経費 合 計

2009

年度

1,300,000 390,000 1,690,000

2010

年度

1,200,000 360,000 1,560,000

2011

年度

1,100,000 330,000 1,430,000

年度

年度

総 計

3,600,000 1,080,000 4,680,000

機関番号：31201

研究種目：基盤研究（C）

研究期間：2009～2011 課題番号：21590200

研究課題名（和文）外分泌機転におけるプロテアーゼ活性化型受容体２に着目した形態機能解析 研究課題名（英文）Morphological and f

unctional analysis of protease-activated receptor 2

on intracellular calcium dynamics in rat parotid gland acinar cells

研究代表者

齋野 朝幸（SAINO TOMOYUKI）

岩手医科大学・医学部・准教授

研究者番号：40305991

研究分野：医歯薬学

科研費の分科・細目：基礎医学・解剖学一般（含組織学・発生学）

キーワード：プロテアーゼ活性化型受容体、細胞内カルシウム変動、共焦点レーザー顕微鏡、

耳下腺、カルモジュリンキナーゼ １．研究開始当初の背景

プロテアーゼ活性化型受容体

（PARs;Protease-activated receptors) は、特定 のプロテアーゼにより特異的に活性化する 三量体Ｇ タンパクと共役した７ 回膜貫通 型の受容体で、リガンドが受容体自身に存在 している特異な受容体である。活性化には２ つの方法がある。受容体が活性化されると、

IP

3産生を介して細胞内カルシウムイオン濃 度([Ca²⁺

]

i

)が上昇したり、一酸化窒素合成酵素

(NOS)

を活性化して一酸化窒素(NO)の産生

が引き起こされるとされている。当初、

PARs

は血小板で研究されてきたが、血管平滑筋や 内皮細胞、末梢知覚神経、あるいは肥満細胞 など多くの細胞にも存在する事がわかり、炎 症機転にもPARsが関与すると考えられてい る。ヒトゲノムのおよそ

2

％ がプロテアー ゼをコードすると言われていることからも、

PARsの役割の大きさがうかがい知れる。この

ため、

PARsは創薬の一つのターゲットとなっ

ている。

２．研究の目的

本研究の目的は、炎症機転を考える上で、外 分泌腺とくに耳下腺という機能単位の中で、

PAR-2

刺激を通じて[Ca²⁺

]

i の変動と外分泌 機構を経時的に観察し、解析することである。

先に述べたように、[Ca²⁺

]

i上昇後の外分泌機 構についてはほとんどわかっていない。また、

耳下腺においてPAR-2の果たす役割も同様で ある。[Ca²⁺

]

i上昇後すぐに外分泌が起こると 考えている研究者が多いが、我々の肥満細 胞を使った報告では、[Ca²⁺

]

i上昇に分泌は直 結しないことを国際学会で報告している(未 発表)。本研究の予備実験では、細動脈と耳下 腺に対するPAR-2の反応は全く異なるといっ た結果を得ている。当該研究期間では、まず

PAR-2

刺激による正常外分泌細胞内での変化

を観察し、その実験結果をもとに外分泌腺の 疾患の病態解明に生かしたい。そのため、以 下の点をマイルストーンと定めた。

１ ） 細胞の[Ca²⁺

]

i変動やフリーラディカル

（例：一酸化窒素）の産生をイメージングで きる腺細胞および腺房標本を、耳下腺から作 製する。

２ ） 耳下腺でのCa²⁺シグナリングにおける

PAR-2

の役割を決定する。腺細胞にPAR-2 の

合 成 ア ゴ ニ ス ト （

PAR-2AP

） で あ る

SLIGRL-NH

2を 投与 して細 胞がどのよ うな

[Ca

²⁺

]

i変動を示すか、イメージング法で検討 する。

３ ） さらに、細胞内Ca²⁺シグナリングに関 係する試薬、およびプロテインキナーゼの促 進剤あるいは抑制剤を用いてPAR-2への効果 を評価する。

４ ） PAR-2刺激後の外分泌機構の評価法と して、分光光度計を用いてアミラーゼの定量 を行う。各種試薬使用時にどのように分泌量 が変化するかも評価する。

５ ）さらに

PAR-2

の反応機構がどのように

分泌に影響を及ぼすか生化学的に検討する。

６ ） イメージングに用いた生組織標本を化 学固定し、電子顕微鏡で耳下腺細胞の微細構 造の変化を検討する。

３．研究の方法

１ ）細胞の[Ca²⁺

]

i変動やフリーラディカル

（例：一酸化窒素：NO）の産生をイメージン グできる腺細胞および腺房標本を、耳下腺か ら作製する。

２ ）耳下腺でのCa²⁺シグナリングにおける

PAR-2

の役割を決定する。腺細胞にPAR-2AP

を投与して細胞がどのような反応を示すか、

イメージング法で検討する。

３ ） さらに、細胞内シグナリングに関係す る試薬やプロテインキナーゼの促進剤ある いは抑制剤の効果を評価する。

４ ）

PAR-2

刺激後の外分泌機構の評価法とし

て、分光光度計を用いてアミラーゼの定量を 行う。各種試薬使用時にどのように分泌量が 変化するかも評価する。

５ ) さらに

PAR-2

の反応機構がどのように 分泌に影響を及ぼすか生化学的にも検討す る。

６ ） イメージングに用いた生組織標本を化 学固定し、電子顕微鏡で耳下腺細胞の微細構 造の変化を検討する。

４．研究成果

１）耳下腺において

PAR-2

受容体の発現が強 く認められた。

２）PAR-2 アゴニストのSLIGRL-NH₂の投与 によって[Ca²⁺

]

_iの上昇を認めた。

これは細胞外のCa²⁺除去によっても消失せず、

Gd

³⁺投与によっても同様であった。また、

NO

のdonorの投与でこの流入は増強した。これら のことから、PAR-2は細胞内ストアを刺激し て[Ca²⁺

]

_iの上昇を引き起こし、続くCa²⁺濃度 の 上 昇 は 、

non-capacitative calcium entry

(NCCE)

によるものと示唆された。また、

PAR-2APによる[Ca

²⁺

]

_iの上昇は、NOS阻害剤 のL-NAME投与によって部分的に抑制され、

リアノジン受容体抑制剤のテトラカイン存 在下やADPリボシルサイクラーゼを抑制し ても同様な部分抑制が見られた。これに対し、

calmodulin kinase II (CAMK II)を抑制するこ

とによって[Ca²⁺

]

_iの上昇完全に阻害された。

そ の 他 各 種 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 使 用 に よ っ て

[Ca

²⁺

]

_i上昇に変化は認められなかった。また、

calmodulinを抑制した場合も同様に完全抑制

が見られた。以上から、PAR-2受容体刺激に よる[Ca²⁺

]

_iの上昇にNOS、リアノジン受容体 が関与していることが示唆され、これらの上 流にCalmodulinやCAMK IIが存在しているこ とが示唆された。

３）アミラーゼの分泌について検討したとこ ろ、PAR-2刺激によってアミラーゼの分泌が 認められ、この分泌は

CAMKII

の抑制によっ て完全に阻害された。

４）電顕で

PAR-2

刺激反応を確認したところ、

PAR-2AP

によって、白抜きの矢印で示す様に

顆粒の複合融合が認められ、分泌が起こるこ とを認めた。

５．主な発表論文等

（研究代表者、研究分担者及び連携研究者に は下線）

〔雑誌論文〕（計

7

件）

(1) Tamagawa Y, Saino T, Matsuura M, Satoh Y (2009) : The effects of diuretics on intracellular Ca

²⁺

dynamics of arteriole smooth muscles as revealed by laser confocal microscopy. Acta Histochem Cytochem 42(4):121-128.

(2) Wakabayashi T, Kimura Y, Ohba Y, Adachi R, Satoh Y, Shingai R (2009) : In vivo calcium imaging of OFF-responding ASK chemosensory neurons in C. elegans. Biochimica et

Biophysica Acta 1790(8):765-769.

(3) Russa AD, Maesawa C, Satoh Y (2009) : Spontaneous [Ca2+]i oscillations in G1/S phase-synchronized cells. J Electron Microsc (Tokyo) 58(5):321-329.

(4) Zou K, Maeda T, Watanabe A, Liu J, Liu S, Oba R, Satoh Y, Komano H, Michikawa M (2009) : Abeta42-to-Abeta40- and

angiotensin-converting activities in different

domains of angiotensin-converting enzyme. J Biol Chem. 284(46):31914-31920.

(5) Sadzuka Y, Matsuura M, Sonobe T (2009) : The effect of taurine, a novel biochemical modulator, on the antitumor activity of

Doxorubicin. Biol Pharm Bull. 32(9):1584-1587.

(6) Miura M, Saino T, Sato M, Satoh Y (2011) : The role of protease activated receptors in the intracellular calcium dynamics of neurons and satellite cells in the rat superior cervical ganglia.

Bioimages 19:17-27.

(7) Yan J, Akutsu H, Satoh Y (2011) : The morphological and functional observation of the gap junction proteins in the oviduct epithelia in young and adult hamsters. Okajimas Folia Anat Jpn 88(2): 57-64.

(8) Kamada Y, Saino T, Oikawa M, Kurosaka D, Satoh Y (2012) : P2Y purinoceptors induce changes in intracellular calcium in acinar cells of rat lacrimal glands. Histochem Cell Biol.

137(1):97-106.

〔学会発表〕（計

24

件）

(1) 佐藤洋一、齋野朝幸、黒田敬:

カルシウムイ

メージング法入門。 第

34

回組織細胞化学講 習会

2009

年

7

月 徳島

(2) 齋野朝幸、Eileen L. Watson、佐藤洋一：

Calmodulin

あるいはCalmodulin kinase IIの抑 制によってラット耳下腺におけるProtease

activated receptor 2

誘発性のCa²⁺上昇が完全抑 制される。 第

55

回 日本解剖学会 東北・北海 道連合支部学術集会

2009

年

9

月 仙台

(3) 齋野朝幸、ワトソン

アイリーン、佐藤洋一：

細胞内カルシウム動態を指標としたラット耳下腺 におけるProtease-activated receptor 2の機能解 析。第

82

回日本生化学会大会

2009

年

10

月 神戸

(4) Kuroda T, Kashiwa K, Kobayashi S, Satoh Y : Intracellular calcium dynamics of fibroblasts continuously exposed to high concentration of ATP. American Society for Cell Biology 49th Annual Meeting, 2009 December, San Diego

(5) Matsuura M, Kuroda T, Tamagawa Y, Saino T , Satoh Y, Sadzuka Y: Age-associated change in the reactivity of Noradrenaline-induced intracellular calcium dynamics in prostatic smooth muscles. The 49th American Society for

Cell Biology Annual Meeting 2009, Dec, San Diego

(6)

鎌田有紀、齋野朝幸、黒坂大次郎、佐藤洋 一： ラット涙腺腺房細胞に及ぼすATPの効果．

第

115

回日本解剖学会全国学術集会

2010

年

3

月 盛岡

(7)

玉川靖則、松浦誠、齋野 朝幸、佐藤 洋 一：ラット精巣細動脈での各利尿剤の作用特性 の比較． 第

115

回日本解剖学会全国学術集 会

2010

年

3

月 盛岡

(8) Satoh Y: Tissue Bioimaging Examination of Morphological And Functional Heterogeneity In Various Organs.

第

115

回日本解剖学会全国 学術集会

2010

年

3

月 盛岡

(9) 阿久津仁美、人見次郎、佐藤洋一：尿が誘

発する鋤鼻感覚細胞内Ca²⁺上昇パターンの多 様性 第

115

回日本解剖学会全国学術集会

2010

年

3

月 盛岡

(10) 阿久津仁美：尿が誘発する鋤鼻感覚細胞

内Ca²⁺の上昇 平成

22

年度日本農芸化学会東 北支部シンポジウム

2010

年

6

月 盛岡

(11) Satoh Y, Russa D: Microtubule Remodeling Resulting in Inhibition of Store-Operated Calcium Entry during Mitosis. The 3rd

International Symposium on Bioimaging, 2010, January, Okazaki

(12) Satoh Y, Saino T, Akutsu-Yamauchi H, Hamano Y: New era of morphology - Developed by the fluorescent markers and the confocal microscopy. XXI International Symposium on Morphological Sciences, 2010, September, Taormina, Italy

(13)

鎌田有紀、齋野朝幸、黒坂大次郎、佐藤

洋一：ATP受容体刺激による涙腺腺房細胞から の涙液分泌はP2Y受容体が主である． 日本解 剖学会 第

56

回 東北・北海道連合支部学術集 会

2010

年

9

月 旭川

(14) Russa D, Kuroda T, Satoh Y: Spontaneous [Ca

²⁺

]

_i

oscillations in G1/S phase synchronized cells. The 50th American Society for Cell Biology Annual Meeting, 2010, Dec, Philadelphia, USA

(15) Saino T, Watson EL, SatohY : Functional

analysis of protease-activated receptor 2 on

intracellular calcium ion dynamics in rat parotid

gland acinar cells. The 50th American Society for

Cell Biology Annual Meeting, 2010, Dec,

Philadelphia, USA

(16) Kamada Y, Saino T, Kurosaka D, Satoh Y:

Effect of ATP on intracellular calcium dynamics in rat lacrimal gland. The 50th American Society for Cell Biology Annual Meeting, 2010, Dec, Philadelphia, USA

(17) 佐藤洋一、東尾浩典、齋野朝幸

：細胞外

ATPはマスト細胞で、開口放出を伴わない細胞

内カルシウム濃度上昇を引き起こす。 第

88

回 日本生理学会大会、116回日本解剖学会総会・

全国学術集会合同大会

2011

年

3

月 横浜

(18) 齋野朝幸、Eileen L. Watson、佐藤洋一

： ラット耳下腺における細胞内カルシウム動態を 指標としたProtease-activated receptor 2機能の 解析。 第

88

回日本生理学会大会、116回日本 解剖学会総会・全国学術集会合同大会

2011

年

3

月 横浜

(19)

阿久津仁美、人見次郎、佐藤洋一：雄ラット 鋤鼻感覚細胞を刺激する雌ラット尿中生理活性 物質の分離精製。 第

88

回日本生理学会大会、

116

回日本解剖学会総会・全国学術集会合同 大会

2011

年

3

月 横浜

(20)

鎌田有紀、齋野朝幸、黒坂大次郎、佐藤

洋一：

ATP受容体刺激による涙腺腺房細胞の

細胞内Ca²⁺濃度上昇はP2Y受容体が主である。

日本解剖学会 第

57

回 東北・北海道連合支部 学術集会

2011

年

9

月 盛岡

(21)

玉川靖則、齋野朝幸、松浦誠、佐藤洋一：

利尿剤である spironolactone のラット精巣細動 脈における細胞内Ca²⁺濃度([Ca²⁺

]

_i

)上昇機構の

検討。日本解剖学会 第

57

回 東北・北海道連 合支部学術集会

2011

年

9

月 盛岡

(22) 齋野朝幸、枡一毅、松浦

誠、佐藤 洋一：

血管細動脈の多様性：カルシウムイメージング 法による検証。第

37

回日本微小循環学会総会

2012

年

3

月 盛岡

(22)

玉川 靖則、齋野 朝幸、松浦 誠、佐藤 洋一：ラット精巣細動脈におけるスピロノラ クトン誘発性Ca2+上昇メカニズムの研究。

第

37

回日本微小循環学会総会

2012

年

3

月 盛岡

(23) 齋野朝幸、Watson Eileen、佐藤洋一

：ラッ ト耳下腺における細胞内カルシウム動態を指標 としたプロテアーゼ活性化型受容体

2

の機能解 析。 第

117

回日本解剖学会総会・全国学術集 会

2012

年

3

月 甲府

(24) 阿久津仁美、人見次郎、佐藤洋一：雄ラット

鋤鼻感覚細胞を活性化させる雌ラット尿中生理 活性物質の分離精製。第

117

回日本解剖学会 総会・全国学術集会

2012

年

3

月 甲府

〔図書〕（計

1

件）

佐藤洋一，齋野朝幸，阿久津仁美 (2011) ： カ ルシウムイメージング技術の基礎。日本組織細 胞化学会編 組織細胞化学 2011 p175-185.

〔産業財産権〕

○

出願状況（計 0 件）

○

取得状況（計 0 件）

〔その他〕

ホームページ等

６．研究組織

(1)研究代表者

齋野 朝幸（SAINO TOMOYUKI）

岩手医科大学・医学部・准教授 研究者番号：40305991

(2)研究分担者

阿久津 仁美（AKUTSU HITOMI）

岩手医科大学・医学部・ポストドクター 研究者番号：30398482

松浦 誠（MATSUURA MAKOTO）

岩手医科大学・薬学部・講師 研究者番号：00405846

佐藤 洋一（SATOH YOH-ICHI）

岩手医科大学・医学部・教授 研究者番号：40118253

(3)連携研究者