博 士 （ 水 産 学 ） 風 藤 行 紀
学位論文題名
rvIolecular biological studies on ovarian steroid hormone biosynthesis in Japanese eel， Anguilla japonica
（ニホンウナギ卵巣のステロイドホルモン生合成に関する分子生物学的研究）
学位論文内容の要旨
二ホンウナギ（Anguilla japonica）は水産養殖上重要な魚種である。しか し、本 種は 飼育 環境 下で は成熟しない。また、降海時の下リウナギの卵巣卵 の多く は、 卵黄 形成 初期 まで発達しているが、それ以上に成熟段階が進んだ 卵巣を 持つ 個体 は捕 獲さ れていない。そのため、これまでサケ脳下垂体懸濁 物（SPH） 等の ホル モン 投与 による 人為 催熟 が試 みら れており、成熟卵およ び孵化 稚魚 を得 るこ とに 成功している。しかし、その結果は必ずしも安定し ておら ず、 催熟 技術 の改 善が望まれている。これらの問題点を解決し、最適 な催熟 技法 を確 立す るた めには、生殖腺の発達を制御する内分泌因子に関す る詳細な知見が不可欠である。
魚類 の卵 母細 胞の 成長 および最終成熟は卵濾胞組織で合成されるステロイ ドホル モン に制 御さ れて いる。一般に、卵黄形成にはエストラジオ―ル−17 p（邑）が、最終成熟には17a, 20p‐ジヒドロキシ―4‐プレグネン‑3‑オン（
DHP） が、 重要 な役 割を 果た してい ると 考え られ てい る。そのため、多くの 魚種 の 卵 濾 胞 に お い て 邑 お よ びDHPの 合 成 に関 する 研究 がな され おり 、ウ ナギで も、 卵巣 の発 達に 伴うこれらステロイドホルモンの合成能の変化等が 調べら れて いる 。し かし 、これらステ口イドの合成経路に関しては、未だ不 明な点 が多 い。 また 、ス テロイドホルモンの産生量の変化は様々なステロイ ド合成 酵素 の活 性変 化に 依存している。ステロイド合成酵素の活性変化はそ の遺伝 子の 発現 によ って 調節されると考えられている。そのため、卵巣での
ステロイドホルモンの合成機構を理解するためには、それぞれのステロイド 合成酵素遺伝子の発現変化を明らかにする必要がある。しかし、ニホンウナ ギの卵巣においてその発現変化が調べられているのはアロマ夕一ゼ（P450 arom）のみである。本研究は、卵巣の発達に伴うステロイド合成経路の変化 を明らかにするとともに、幾つかのステ口イド合成酵素に関して遺伝子レベ ルでの知見を得ることにより、ニホンウナギ雌のステ口イドホルモン合成を より詳細に理解することを目的に行われた。
先ず、卵黄形成初期（SPH投与前）、卵黄形成中期および核移動期の卵濾 胞をプレグネノロン（Preg）とともに培養し、培養後のステロイド代謝物を 解析した。卵黄形成初期の卵濾胞はPregを他のステロイドに殆ど転換しな かった。卵黄形成中期では、Pregは、幾っかのステロイド代謝物に転換さ れ、中でもアンドロゲンであるアンド口ステンジオン（A）およびデヒドロ エピアンド口ステロン（DHA）が、どの個体においても主要な代謝物として 検出 された 。― 方、 核移 動期で は、Aお よびDHAにか わっ て17a‑ヒドロ キシプロゲステロン（1 7a‑OHP）およびDHPが多量に合成された。以上の 結果、本種の卵濾胞ではSPH投与により各種ステロイド合成酵素が活性化さ れ、卵黄形成中期には主にアンドロゲンが、核移動期には17 0r‑OHPおよび DHPが合成されるステロイド合成経路が誘導されることが明らかとなった。
また、このステ口イド合成経路の変換は、主にC17‑20側鎖切断酵素活性の低 下および20p−水酸基脱水素酵素（20[3‑HSD）活性の上昇に起因していると 考え られた 。P450c17は 、哺 乳類 におい て17a水酸化 酵素 およびG17‑20 側鎖切断酵素のニつの酵素活性有することが知られており、ウナギの卵巣に おい てはア ンド ロゲ ンお よびDHP双方の合成に関与していると考えられ る。 そこで 、ウ ナギP450c17 cDNAの構造解析を行った。ウナギP450c17 cDNAから推定されるアミノ酸配列は他の動物種のものと高い相同性を示し た。 遺伝子 導入 によ ルウ ナギP450c17をCOS‑7細胞中 で発 現させ、その 酵素活性を調べたところ、17a水酸化酵素およびC17‑20側鎖切断酵素の両 酵素活性を示した。次に、成熟に伴うP450c17 mRNA量の変化を調ぺた。
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SPH投与前 の卵 巣で はP450c17 mRNAは検出されなかった。催熟により卵 黄 形成が姶まると、P450c17 mRNAが検出されはじめ卵黄形成中期までそ の量は増加し、その後大きな変化を示さなかった。以上の結果、SPH投与に よ りP450c17 mRNAの転 写が 誘導 される こと が示 された 。ま た、 ウナギ P450c17は17a水酸化酵素およびC17‑20側鎖切断酵素のニつの酵素活性を 有しており、卵黄形成中期ではアンドロゲンの、核移動期では17a‑〇HPや DHPの 合 成 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る と 考 え ら れ た 。 20 [3‑HSDは 、17a‑OHPをDHPに直 接転換する酵素である。近年ブ夕精 巣の20 {3‑HSDの―次構造が決定され、可溶性タンパクのーつであるカルボ ニルリダク夕―ゼ（CR）であることが明らかにされた。そのため、魚類の2 0 [3‑HSDもCR様夕ンパクであると考えられている。そこで次に、ウナギ卵 巣 の20 [3‑HSDのタンバクレベルでの性状解析およびCR cDNAの構造解析 を 行い、20 t3‑HSDがCRであるか否かを検討した。203‑HSD活性は、ウナ ギ卵巣において主にミトコンドリアおよびミク口ソ―ム画分に分布してお り、本酵素は細胞膜結合型タンパクであった。20 [3‑HSD活性はSPH投与前 の卵巣で検出され、その後卵巣の発達に伴ない上昇した。ウナギCR cDNA から推定されるアミノ酸配列は、他の動物種のものと高い相同性を示した。
また、その立体構造も高度に保存されていると推測され、ウナギCRは哺乳 類のCRと同様に可溶性夕ンパクであると考えられた。卵巣の発達に伴うCR mRNA量の変化を調べたところ、卵黄形成中期で若干高まったが、その後大 きな変化を示さなかった。更に、CR遺伝子を導入したCOS‑7細胞は、20p． HSD活性を示さなかった。以上の結果、ウナギの卵巣では、SPH投与により 20 [3‑HSD活性が高まることが示された。また、本種の20DーHSDはCR様タ ンパクではないことが示唆され、CRと異なる203‑HSD遺伝子の単離および 構造解析が今後の課題として残された。
最後に、P450aromとともにエストロゲン合成の最終段階を触媒する酵素 である17p‐水酸基脱水素酵素タイブ‐｜（173‑HSDl）のcDNAを単離した。
単 離し たウ ナギ17 t3‑HSD lcDNAを ヒト腎臓由来293細胞（HK293）に導 ―1152−
入した。遺伝子を導入したHK293をA、テストステロン、工ストロン（E1
）および邑と培養した。培養後、ステロイド代謝物を解析したところ、本酵 素は 日 か ら 邑 を 合成 する 還元 反応の みを 触媒 した 。また 、17(3‑HSDl mRNAはSPH投与 前の 個体 の卵 巣では 検出 され なかっ たものの、SPH投与 後は全個体において検出され成熟に伴って大きな変化を示さなかった。以上 の結果、173‑HSDIの基質特異性よルウナギ卵巣においては、巳は主にEi の前駆体であるAからE1を経て合成されることが示された。また、178・ HSDlmRNAの 転写 活性はSPH投与により誘導されるものの、成熟に伴い大 きな変化を示さないことが明らかとなった。これまに知られている卵巣の発 達 に 伴 う 邑 合 成 能 お よ びP450arom mRNA量 の 変 化 と17 {3‑HSDImRNA 量の変化を考え合わせると本種の卵巣における邑産生の制限要因はP450 aromであると考えられた。
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授 助教授
山 内 晧 平 山 崎 文 雄 原 彰 彦 上 田 宏 足 立 伸 次
学 位 論 文題 名
:N/Iolecular biological studies on ovarlanSteroidhormone biOSyntheSiSinJapaneSeeel， 4鏐 ぎ 勿ff励 ッ 砂 〇 刀 ； Cロ
（ ニ ホ ンウ ナ ギ 卵巣 の ス テロ イ ド ホル モ ン 生 合成に関 する分子 生物学 的研究）
二 ホ ン ウ ナ ギ （Anguilla japonfca） は 水 産 養 殖 上 重 要 な 魚 種 で あ る 。 し か し 、 本種 は 飼 育 環 境 下 で は 成 熟 し な い 。 ま た 、 降 海 時 の 下 ル ウ ナ ギ の 卵 巣 卵 の 多 く は 、 卵 黄 形 成 初 期 ま で 発 達 し て い る が 、 そ れ 以 上 に 成 熟 段 階 が 進 ん だ 卵 巣 を 持 つ 個 体 は 捕 獲 さ れ て い な い 。 そ の た め 、 こ れ ま で サ ケ 脳 下 垂 体 懸 濁 物 （SPH） 等 の ホ ル モ ン 投 与 に よ る 人 為 催 熟 が 試 み ら れ て き た が 、 そ の 結 果 は 必 ず し も 安 定 し て お ら ず 、 催 熟 技 術 の 改 善 が 望 ま れ て い る 。 最 適 な 催 熟 技 法 を 確 立 す る た め に は 、 生 殖 腺 の 発 達 を 制 御 す る 内 分 泌 因 子 に 関 す る 詳 細 な 知 見 が 不 可 欠 で あ る 。 ー 般 に 、 卵 母 細 胞 の 成 長 お よ び 最 終 成 熟 は 卵 濾 胞 組 織 で 合 成 さ れ る ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン に 制 御 さ れ て い る が 、 ウ ナ ギ で も 、E2が 卵 黄 形 成 に 、 17Q，20pー ジ ヒ ド ロ キ シ −4− プレ グ ネ ン −3ー オ ン（DHP） が 卵 母細 胞 の 最終 成 熟 に関 与 し て い る と 考 え ら れ て い る 。 本 研 究 は 、 二 ホ ン ウ ナ ギ 雌 の 成 熟 過 程 に お け る ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 生 合 成 に 関 し て 遺 伝 子 レ ベ ル で 詳 細 に 調 べ る こ と を 目 的 と し て 行 わ れ た 。 先 ず 、 卵 黄 形 成 初 期 （SPH投 与 前 ） 、 卵 黄 形 成 中 期 お よ び 核 移 動 期 の 卵 濾 胞 を プ レ グ ネ ノ ロ ン （Preg） と と も に 培 養 し 、 培 養 後 の ス テ ロ イ ド 代 謝 物 を 解 析 し た 。 そ の 結 果 、 SPH投 与 前 の 卵 黄 形 成 初 期 の 卵 濾 胞 はPregを 他 の ス テ ロ イ ド に 殆 ど 転 換 し な い の に 対 し 、SPH投 与 後 は 各 種 ス テ ロ イ ド 合 成 酵 素 が 活 性 化 さ れ 、 卵 黄 形 成 中 期 に は 主 に ア ン ド ロ ゲ ン が 、 核 移 動 期 に は17aー ヒ ド ロ キ シ プ ロ ゲ ス テ ロ ン （17QーOHP） お よ びDHPが 合 成 さ れ る ス テ 口 イ ド 合 成 経 路 が 誘 導 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、 こ の ス テ ロ イ ド 合 成 経 路 の 変 換 は 、 主 にC17・20側 鎖 切 断 酵 素 活 性 の 低 下 お よ び20pー 水 酸 基 脱 水 素 酵 素 （206ーHSD） 活 性 の 上 昇 に 起 因 し て い る と 考 え ら れ た 。
P450c17は 、 哺 乳 類 に お い て17Q水 酸 化 酵 素 お よ びC17・20側 鎖 切 断 酵 素 の ニ つ の
酵素 活性有 する こと が知 られて いる 。そ こで 、ウナ ギP450c17 cDNAを単 離し た。単 離し たP450c17 cDNAを用いてタンノヾクを発現させ、その酵素活性を調ぺたところ、
17a水 酸 化 酵 素 お よ びC17‑20側 鎖切 断 酵 素 の 両 酵 素 活 性 を 示し た 。 ま た 、 本 酵 素 mRNAは、SPH投与 前の卵 巣で は検 出され なか った ものの、催熟により卵黄形成が始ま ると、検出されはじめ卵黄形成中期までその量は増加し、その後大きな変化を示さなか っ た 。以 上 の 結 果 、SPH投 与 によ りP450c17 mRNAの転 写が 誘導 される こと が示 され た 。 また 、 ウ ナ ギP450c17は17a水 酸化 酵 素 お よ びC17‑20側 鎖 切断酵 素活 性を 有し ており、卵黄形成中期ではアンドロゲンの、核移動期では17a―OHPやDHPの合成に重要 な役割を果たしていると考えられた。
20[3−HSDは、17a−OHPをDHPに直接転換する酵素である。近年ブ夕精巣の20(3−HSD の一次構造が決定され、可溶性夕ンパクのーつであるカルボニルリダク夕―ゼ（CR）であ ることが明らかにされた。そのため、魚類の20(3−HSDもCR様夕ンパクであると考えられ ている。そこで次に、ウナギ卵巣の20t3―HSDのタンパクレベルでの性状解析およびCR cDNAの構造 解析 を行い、20[3−HSDがCRであるか否かを検討した。20(3−HSD活性は、
ウナギ卵巣において主にミトコンドリアおよびミクロソ―ム画分に分布しており、本酵素 は細胞膜結合型夕ンパクであった。20(3ーHSD活性はSPH投与前の卵巣で検出され、その 後卵巣の発達に伴ない上昇した。ウナギCR cDNAから推定されるアミノ酸配列は、他の 動物種のものと高い相同性を示し、哺乳類のものと同様に可溶性夕ンノヾクであると考えら れた 。卵巣 の発 達に伴うCRmRNA量の変化を調べたところ、卵黄形成中期で若干高まっ たが 、その 後大 きな変化を示さなかった。更に、CR遺伝子を導入したCOSー7細胞は、
20(3−HSD 活性 を示さなかった。以上の結果、ウナギの卵巣では、SPH 投与により 20(3―HSD活性が高まることが示された。また、本種の20(3−HSDはCRではないことが魚 類で初めて示された。
最後に、P450aromとともにェス卜ロゲン合成の最終段階を触媒する17(3一水酸基脱水 素酵 素夕イ プ− ｜（17[3−HSD−I）のcDNAを魚類で初めて単離した。単離したウナギ 1 7[3‑HSD−lcDNAを用いてタンパクを発現させ、その酵素活性を調べたところ、本酵素は エス トロン （Ei）か らE2を合成 する 反応 のみ を触媒した。また、17pーHSD−lmRNAは SPH投与前の個体の卵巣では検出されなかったものの、SPH投与後は全個体において検出 され成熟に伴って大きな変化を示さなかった。以上の結果、1 7[3‑HSD−Iの基質特異性よル ウナ ギ卵巣 にお いては、E2は主にEiの前駆体であるアンド口ステンジオンからEiを経 て合成されることが示された。また、17(3−HSD―｜mRNAの転写活性はSPH投与により誘 導されるものの、成熟に伴い大きな変化を示さないことが明らかとなった。これまでに知 られ ている 卵巣 の発 達に 伴うE2合成 能お よびP450arom mRNA量の変化と17[3−HSD−l mRNA量の変 化を 考え 合わ せると 本種 の卵 巣に おけるE2産 生の 制限要 因はP450aromで あると考えられた。
上述のように、本研究では、人為催熟されたウナギ雌を用い、卵黄形成および卵母細胞 の最終成熟を制御するE2およびDHPの合成に関与するステロイド合成酵素に関する詳細
な知見が数多く得られた。これらの結果は、人為催熟により誘導される卵黄形成および最 終成熟の問題点をステロイドホルモン合成の観点から考察する足がかりとなり、今後、催 熟法を改良するうえで極めて重要な知見を提供したものとして高く評価され、本論文が博 士 （ 水 産 学 ） の 学 位 請 求 論 文 と し て 相 当 の 業 績 で あ る と 認 定 し た 。
