博 士 （ 歯 学 ） 瀬 川 卓
学 位 論 文 題 名
Clearance of wild‑type and lipoprotein‑deficient strains of human oral streptococci from murine perltonealCaVity ，blOOdnOW ，SpleenandliVer （ 腹腔， 血中 ，脾 臓なら びに 肝臓 から の口腔 レン サ球 菌の排除における りポタンパク質の影響）
学位論文内容の要旨
【 目 的 】 徽 生物 由 来 リ ポ タン パ ク 質(LP)は 種 々 の生 物 活 性を有 してい る。 口腔レ ンサ球 菌は菌 血症の 原因 菌 の ― つ で あ り、 ま た 、 細 胞壁 にLPを 有し て い る 。 本研 究 では 、ロ腔 レンサ 球菌の 生体 からの クリア ランス に お け るLPの 役 割 を 、LPを 発 現 す る 野 生 株(WT)と 発 現 し な い 欠 損 株(dLP)を 用 い て 調 べ た 。
【 材 料 と 方 法 】 口 腔 レ ン サ 球 菌 と してStreptococcus mutans 109c (Sm)な ら び に ＆gordonii Cha川s(Sg) のWT株 とdLP株 を 用 い た 。実 験 動 物 と し てC57BL/6 (TLR2v＋） とTLR2ノック アウ卜 マウス(TLR21/一）を 用い た。TLR2．／ ゛とTLR2ナマウ スの腹 腔にレ ンサ 球菌を 接種し 、経時 的に腹 腔浸 出液を 採取し 、希釈 した 後BHI寒 天 培 地に 播 種 し 、2日 間 ロ ― ソ ク嫌 気 下 で 培 養 し、 形 成 さ れ たコ ロ ニ ― 数 をカ ウ ン ト した。 また、 腹腔マ ク ロ フ ァー ジ （Pめ を調 製 し 、WT株 とdLP株 の 貪 食 速 度 を比 較 し た 。 血中 か ら の ク リア ラ ン ス は 尾静 脈 に 菌 体 を 接 種し た 後 、 経 時的 に 採 血 し 、 上記 の 方 法 で 生菌 数 を カ ウ ン卜し た。脾 臓、肝 臓か らのク リアラ ンスは 尾 静 脈 に菌 体 を 接 種 した 後 、 経 時 的 に臓 器 を 摘 出 し、 ホ モ ジ ナ イズ し た 臓 器 ペー ス 卜 をPBSに懸 濁し、 生菌 数 を カ ウン ト し た 。 血中 に お け るTNF−a産 生誘 導 活 性 は 尾静 脈 に菌 体を 接種し た後、 経時的 に採 血し、TNF−a 量 をELISA法 で 測 定 し 、 評 価 し た 。PMを レ ン サ 球 菌 で 刺 激 し 、 賓 食 受 容 体cD14な ら び にCD36の 刪A発 現 を り アル タ イ ムPCR法 で 解 析 した 。 さ ら に 、こ れ ら の 菌 株の 臍 帯血 内皮細 胞（HUvEC，IF050271）に 対す る付 着 能 を以 下 の 方 法で 評価し た。HUVECと 菌体を 反応 させ、 よく洗 浄した 後0．025％（v/v）TritonX―100で 溶解 し 、BHI寒 天 培 地に 播 種 し て 得ら れ た 生 菌 数を 総 菌 数 （ 付着 十 侵 入 ） と した 。 ま た 、HUVECと菌 体 を 反 応 し た 後 、100斗g/mlのぺ ニシリ ンと100pg/m｜ ス卜レ プトマ イシ ンで1時間 処理し 、0．025％（v/v）TritonX―100 で 細 胞を 溶 解 し て 得ら れ た 菌 数 を 侵入 菌 数 と し た。 な お 、 付 着菌数 は総菌 数から 侵入 菌数を 引き算 して得 ら れた 菌数と した。
【 結 果 と 考 寮 】TLR2+t+マ ウ ス の 腹 腔 で は 、 両菌 種 と もWT株 がdLP株 よ り 有 意 に 早く ク リ ア ラ ンス さ れ 、 TLR2・/一 マウス では 両菌株 のクリ アラン スの速 度に 有意差 がみら れなか った 。また 、PMによ る貪 食が腹腔から の ク リ ア ラ ン ス に 童 要 で あ る と 考え ら れ る の で、PMに よ るWT株 とdLP株 の 貧 食能 を 比 較 し た。 そ の 結 果 、 TLR2゛ ／ ＋ マ ウス 由来PNIでは 両苗 種ともWT株がdLP株 より有 意に早 く竇食 され、TLR2+マウス 由来P一で は両菌 株 の 貪 食 能に 有 意 差 が 認め ら れ な か った 。P一によ る細菌 の寅食 は賓食 受容 体を介 して行 われる こと が報告 さ れ て い る ので 、P rlを こ れ ら の苗 株 で 刺 激 し た後 、 貪 食 受 容体 で あ るCD14とCD36のmRNAの 発 現 を翻 べ た 。 そ の 結 果 、両 菌 種 と もWT株 がdLP株 よ り 強 くこ れ ら の 貪 食 受容 体 の 発 現 を誘 導 す る ことが わかっ た。し たが っ て 、 マ ウ ス 腹 腔 か らWT株 がdLP株 よ りも 早 く ク リ アラ ン ス さ れ た理 由 の ー つ とし て 、WT株に 存 在 す るLP がTLR2依 存 的 にPMに お け るCD14な ら び にCD36等 の 貪 食 受 容 体 の 発 現 をdLP株 よ り も 強 く誘 導 し た こ とが
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考 え ら れ る 。TLR2＋／ ＋ マ ウ ス の血 中で は、両 菌種と もdLP株がWT株より 有意に 早くク リア ランス された が、
TLR2+マ ウ ス で はWT株 とdLP株 で 有 意 差は 認 め ら れ なか っ た 。 こ の結 果 は 、LPの 存 在 が 血 中か ら の レ ンサ 球 菌 の ク リ ア ラン ス に 抵 抗 性を 示 す こ と を示 唆 し て い る。 次に 、毛 細血管 の豊富 な臓器 である 脾臓 、肝臓 から の ク リ ア ラ ンス を 調 べ た 。TLR2v゛ マ ウ ス で は、 両 菌 種 ともdLP株 がWT株よ り有意 に早 くクリ アラン スされ 、 TLR2‐/一 マ ウスで はWT株 とdLP株で有 意差は 認めら れな かった 。この ように 、臓器 から のクリ アラン スは血 中 か ら の ク リ アラ ン ス と 同 じ傾 向 を 示 し た。LPの 存 在が 血 中や 臓器か らのレ ンサ球 菌の クリア ランス に対し て 抵 抗 性 を 示 す原 因 の ー っ とし て 、 菌 体 がLPを 介 し て血 管 内皮 に付着 したの ではな いか という ことが 推測さ れ た の で 、HUVECへ の レ ン サ 球 菌 の 付 着 と 侵 入 に つ い て 調べ た 。 両 菌 種と もWT株 の方 がdLP株と 比 べ て 強 く HUVECに 付 着 し た 。一 方 、HuVECへ の 菌体 の 侵 入 性 では 、smは 両菌 株 と も 侵 入性 を 示 し た が、 有 意 差 は認 め ら れ な か っ た。 し か し な がら 、Sgは 両菌 株 と も 侵 入性 を 示さ なかっ た。こ れらの 結果 は、LPの 存在が 血管 内 皮 細 胞 の 付 着に 関 与 し て いる こ と を 示 唆し て い る 。 以上 の こ と か ら 、血 中 な らび に臓 器からWT株がdLP株 よ り も よ り 遅 くクリ アラン スされ る理由 のー っとし て、LPを 介し た血管 内皮細 胞の付 着が 考えら れる。 さらに 、 菌 血 症 な ら びに 敗 血 症 で 童要 な 役 割 を 果た し て い る 炎症 性 サ イ ト カ イン の ー つで あるTNFlaの 血中産 生誘 導 活 性を翻 べた。TLR〆゛マ ウスで は両菌 種ともWT株がdLP株 より有 意に 強い活 性を示したが、TLR2・ノーマウスで は そ の 差 が 減弱 し た 。 こ の結 果 は 口 腔 レン サ 球 菌 の 血中 に お け るTNFmの 産 生誘 導 活 性 に はwT株 に 存 在する LPのTLR2によ る認識 が重 要であ ること が推測 され た。
こ の よう に 、 両 菌 種に お い て 、WT株 はdLP株 に 比 べ て 強い 血 中TNF−a産 生 誘導 活性 を有し 、また 、血中 な ら び に 臓 器 から の ク リ ア ラン ス に お い てwT株 がdLP株 よ り も抵 抗 性 を 示 し たこ と から、 ロ腔レ ンサ球 菌に 存 在 す るLPは 菌 血 症 や 敗 血 症 等 に お い て 病 因 的 役 割 を 果 た し て い る も の と 推 測 さ れ る 。
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学位論文審査の要旨 主 査 教 授 川浪 雅 光 副査 教授 柴田健一郎 副 査 教 授 田村 正 人
学 位 論 文 題 名
Clearance of wild‑type and lipoprotein‑deficient strains of human oral streptococci from murine peritoneal cavity, blood fiow, spleen and liver
（腹腔，血中，脾臓をらびに肝臓からの口腔レンサ球菌の排除における りポタンパク質の影響）
審 査 は 主 査 、 副 査 全 員 が 一 同 に 会 し て 口 頭 で 行っ た 。 は じ めに 申 請 者 に 対し て 本 論 文 の 概要 の 説 明 を 求 め た と こ ろ 、 以 下 の 内 容 に つ い て 論 述 し た 。
本 研 究 は 、 口 腔 レ ン サ 球 菌 の 生 体 か ら の ク リ ア ラ ン ス に お け るLPの 役 割 を 、LPを 発現 す る 野 生 株(WT)と 発 現 し な い 欠 損 株(dLP)を 用 い て 調 べ た 。
【 材 料 と 方 法 】 口 腔 レ ン サ 球 菌 と し てStreptococcus mutans 109c (Sm)な ら ぴ に ＆gordonii Challis (Sg)のWT株 とdLP株 を 用 い た。 実 験 動 物 と してC57BL/6 (TLR2゛/十 冫 とTLR2ノ ッ クア ウ 卜 マ ウ ス(TLR2+)を 用 い た 。TLR2十/十 とTLR2‑1‑マウ ス の 腹 腔 にレ ン サ 球 菌 を 接種 し 、 経 時 的に 腹 腔 浸 出 液 を 採 取 、 希 釈 後 、 寒 天 培 地 で 培 養 し 、 形 成 さ れ た コ ロ ニ ー 数 を カ ウ ン卜 し た 。 ま た、 腹 腔 マ ク ロ フ ァ ー ジ(PM)を 調 製 し 、WT株 とdLP株 の 貪 食 速 度 を 比 較 し た 。 血 中 か ら の ク リ ア ラ ン ス は 尾 静 脈 に 菌 体 を 接 種 し た 後 、 経時 的 に 採 血 し、 上 記 の 方 法で 生 菌 数 を カ ウン ト し た 。 脾臓 、 肝 臓 か ら の ク リ ア ラ ン ス は 尾 静 脈 に 菌 体 を 接 種 し た 後 、 経 時 的 に 臓 器 を 摘 出し 、 臓 器 ぺ ース ト を 懸 濁 し 、 生 菌 数 を カ ウ ン ト し た 。血 中 に お け るTNF―a産 生 誘 導 活 性 は尾 静 脈 に 菌 体を 接 種 し た 後 、 経 時 的 に 採 血 し 、TNF−a量 をELISA法 で 測 定 し 、 評 価 し た 。PMを レ ンサ 球 菌 で 刺 激 し、 貪 食 受 容 体CD14な ら び にCD36のmRNA発 現 を り ア ル タ イ ムPCR法 で 解 析 し た 。 さ ら に 、 こ れ ら の 菌 株 の 臍 帯 血 内 皮 細 胞(HUVEC)に 対 す る 付 着 能 を 以 下 の 方 法 で 評 価 し た 。HUVECと 菌 体 を 反 応 さ せ 、 洗 浄 後TritonX―100で 溶 解 し、 寒 天 培 地 に播 種 し て 得 られ た 生 菌 数 を総 菌 数 （ 付 着 十侵 入 ） と し た 。 ま た 、HUVECと 菌 体 を 反 応 し た 後 、 抗 生 物 質 で処 理 し 、TritonX―100で 細胞 を 溶 解 し て
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得 ら れ た 菌 数 を 侵 入 菌 数 と し た 。 な お 、 付 着 菌 数 は 総 菌 数 か ら 侵 入 菌 数 を 引 き算 し て 得 ら れ た 菌 数とし た。
【 結 果 と 考 察 】TLR2十/十 マ ウ ス の 腹 腔 で は 、 両 菌 種 と もWT株 がdLP株 よ り 有意 に 早 く ク リア ラ ン ス さ れ 、TLR2‑1‑マ ウ ス で は両 菌 株 の ク リア ラ ン ス の 速 度に 有 意 差 が みら れ な か っ た。 ま た 、PM に よ る 貪 食 が 腹 腔 か ら の ク リ ア ラ ン ス に 重 要 で あ る と 考 え ら れ る の で 、PMに よ るWT株 とdLP株 の 貪 食 能 を 比 較 し た 。 そ の 結 果 、TLR2十/十 マウ ス 由 来PMで は 両 菌 種 ともWT株 がdLP株 よ り有 意 に 早 く 貪 食 さ れ 、TLR2‑t一 マ ウス 由 来PMでは 両 菌 株 の 貪食 能 に 有 意 差が 認 め ら れ な かっ た 。PMに よ る 細 菌 の 貪 食 は 貪 食 受 容 体 を 介 し て 行 わ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る の で 、PMを こ れ ら の 菌株 で 刺 激 し た 後 、 貪 食 受 容 体 で あ るCD14とCD36のmRNAの 発 現 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 両 菌 種 と もWT 株 がdLP株 よ り 強 く こ れ ら の 貪 食 受 容 体 の 発 現 を 誘 導 す る こ と が わ か っ た 。 し た が っ て 、 マ ウ ス 腹 腔 か らWT株 がdLP株 よ り も 早 く ク リ ア ラ ン ス さ れ た 理 由 の ー っ と し て 、WT株 に 存 在 す る LPがTLR2依 存 的 にPMに お け るCD14な ら び にCD36等 の 貪 食 受 容 体 の 発 現 をdLP株 よ り も 強 く 誘 導 し た こ と が 考 え ら れ る 。TLR2十/十 マ ウ スの 血 中 で は 、両 菌 種 と もdLP株 がWT株 よ り 有 意に 早 く ク リ ア ラ ンス さ れ た が 、TLR2ー ／ー マ ウ ス で はWT株 とdLP株 で 有 意差 は 認 め ら れ なか っ た 。 こ の 結 果 は 、LPの 存 在 が 血中 か ら の レ ンサ 球 菌 の ク リア ラ ン ス に 抵抗 性 を 示 す こ とを示 唆して いる 。 次 に、毛 細血管 の豊富 な臓 器であ る脾臓 、肝臓 からの クリ アラン スを調 べた。TLR2゛／ ゛マウスでは、
両 菌 種 と もdLP株 がWT株 よ り 有 意 に 早 く ク リ ア ラ ン ス さ れ 、TLR2‑t‑マ ウ ス で はWT株 とdLP株 で 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ の よ う に 、 臓 器 か ら の ク リ ア ラ ン ス は 血 中 か らの ク リ ア ラ ン ス と 同 じ 傾 向 を 示 し た 。LPの 存 在 が 血 中 や 臓 器 か ら の レ ン サ 球 菌 の ク リ ア ラ ンス に 対 し て 抵抗 性 を 示 す 原 因 の ー っ と し て 、 菌 体 がLPを 介 し て 血 管 内 皮 に 付 着 し た の で は な いか と い う こ とが 推 測 さ れ た の で 、HUVECへ の レ ン サ 球 菌 の 付 着 と 侵 入 に つ い て 調 べ た 。 両 菌 種 と もWT株 の 方 がdLP 株 と 比 べ て 強 くHUVECに 付 着 し た 。 一 方 、HUVECへ の 菌 体 の 侵 入 性 で は 、Smは 両 菌 株 と も 侵 入 性 を 示 し た が 、 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 し か し な が ら 、Sgは 両 菌 株 と も侵 入 性 を 示 さな か っ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、LPの 存 在 が 血 管 内 皮 細 胞 の 付 着 に 関 与 し て い る こ とを 示 唆 し て いる 。 以 上 の こ と か ら 、 血 中 な ら び に 臓 器 か らWT株 がdLP株 よ り も よ り 遅 く ク リ ア ラ ン ス さ れ る 理 由 の ー っ と し て 、LPを 介 し た 血 管 内 皮 細 胞 の 付 着 が 考 え ら れ る 。 さ ら に 、 菌 血症 な ら び に 敗血 症 で 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の ー っ で あ るTNF―aの血 中 産 生 誘 導 活性 を 調 べ た 。TLR2゛ ／ ゛マ ウ ス で は 両菌 種 と もWT株 がdLP株よ り有 意に強 い活性 を示 したが 、TLR2一/Iマウ ス で は そ の 差 が 減 弱 し た 。 こ の 結 果 は 口腔 レ ン サ 球 菌の 血 中 に お けるTNF−aの 産 生 誘 導 活性 に は WT株 に存在 するLPのTLR2に よる認 識が重 要であ るこ とが推 測され た。
引 き 統 き 審 査 担 当 者 と 申 請 者 の 間で 、 論 文 内 容お よ び 関 連 事 項に つ い て 質 疑応 答 が な さ れた 。 主 な質問 事項は 、
（1）dLPが 血中か らの早 くクリ アラン スさ れた理 由につ いて
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(2) (3) (4) (5)
付 着 す る こ と に よ り 、 貪 食 が 促進 す る か に つ いて CD14. CD36を 調 べ た 理 由 に つ い て
り ポ タ ン パ ク 質 の 有 無 で 歯 質 へ の 付 着 能 へ は 違 い は な い か に つ い て 血 中 か ら の ク リ ア ラ ン ス と 臓 器か ら の ク リ アラ ン ス が 同 じに な っ た 理 由 につ い て
こ れ ら の 質 問 に 対 し て 、 申 請 者 は 適 切 な 説 明 に よ っ て 回 答 し 、 本 研究 の 内 容 を 中心 と し た 専 門 的 分 野 は も と よ り 、 関 連 分 野 に つ い て 十 分 な 理 解 と 学 識 を 有 し て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 本 研 究 は 口 腔 レ ン サ 球 菌 に 存 在 す るLPは 菌 血 症 や 敗 血 症 等 に お い て 病 因 的 役割 を 果 た し て いる こ と を 示 し た こ と が 高 く 評 価 さ れ た 。 本 研 究 の 内 容 は 、 歯 科 医 学 の発 展 に 十 分 に貢 献 す る も の で あ り 、 審 査 担 当 者 全 員 は 、 学 位 申 請 者 が 博 士 （ 歯 学 ） の 学 位 を 授与 す る こ と に値 す る も の と 認 め た 。
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