海産無脊椎動物のオピンデヒドロゲナーゼのcDNA解析および組換え大腸菌を用いた生理機能の解明

海産無脊椎動物のオピンデヒドロゲナーゼのcDNA解

析および組換え大腸菌を用いた生理機能の解明

著者

木村 朋寛

号

838

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/16644

氏

名(本籍)

学 位 の 種 類

学 位 記 番 号

学位授与年 月目

学位授与の要件

研 究 科 専 攻

学 位 論 文 題 目

き む ら とも ひろ

木

村

朋

寛

博

士(農

学)

農

博

第838号

平 成18年3,月24日

学 位 規 則 第4条

第1項

該 当

農学 研究 科 資源生 物科 学専 攻

(博士課 程)

海 産無 脊 椎動 物 のオ ピ ンデ ヒ ドロゲナー ゼ のcDNA解

析

お よび組 換 え大腸 菌 を用 い た生 理機 能 の解 明

論 文 審 査 委 員

實

邦

彦

清

順

藤

賀

口

佐

室

谷

授

授

授

教

教

教

 

 

査

査

主

副

(

(

論

文

内

容

要

旨

第1章 緒 言 オ ピ ン デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ(OpDHs)は 、 ア ミ ノ酸 と ピル ビ ン酸 を 基 質 と し 、NADH を 補 酵 素 と して オ ピ ン類 を 生 合 成 す る酸 化 還 元 酵 素 で あ る 。ア ミ ノ酸 基 質 特 異 性 か ら オ ク ト ピ ンデ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ(OcDH)、 ア ラ ノ ピ ン デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ(AIDH)、 ス ト ロ ン ビ ンデ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ(StDH)、 タ ウ ロ ピ ン デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ(TaDH)お よ び β一ア ラ ノ ピ ン デ ヒ ド ロゲ ナ ー ゼ(B・ADH)の5種 類 に 分 類 さ れ て い る 。OpDHsは こ れ ま で の 研 究 に よ り脊 椎 動 物 の 乳 酸 デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ(LDH)と 同 義 的 役 割 、す な わ ち 嫌 気 的 環 境 下 で の エ ネ ル ギ ー 産 生 に重 要 な 役 割 を持 っ て い る と さ れ て お り、嫌 気 環 境 に 曝 し た 後 や 激 し い 運 動 を さ せ た 後 に オ ピ ン量 が 増 加 す る と い っ た 間 接 的 証 明 は さ れ て い る が 、遺 伝 子 操 作 に よ る 直 接 的 な 証 拠 は 得 ら れ て い な い 。 ま た 、OpDHsは 各 種 無 脊 椎 動 物 に 広 く 分 布 し 、一 部 に つ い て は 酵 素 化 学 的 性 質 も 明 ら か に さ れ て い る が 、ア ミ ノ酸 配 列 な ど の 分 子 構 造 に つ い て は ほ と ん ど 知 ら れ て い な い 。 本 研 究 で は 、 ま ず 、OpDHsのcDNA解 析 に よ り一 次 構 造 で あ る ア ミ ノ酸 配 列 情 報 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。 同 時 に 、得 られ た 配 列 情 報 を 基 に 大 腸 菌 で の 発 現 を 試 み 、 本 酵 素 の ア ミ ノ酸 基 質 特 異 性 を 明 らか に す る こ と 、 す な わ ちOpDHsの 特 定 を 試 み た 。次 に 、本 研 究 で 得 られ たcDNA配 列 お よ び 推 定 ア ミ ノ 酸 配 列 を 、 こ れ ま で に 解 明 さ れ て い る他 の 生 物 種 に お け るOpDHsのcDNA配 列 お よ び 推 定 ア ミ ノ 酸 配 列 と 比 較 し 、 相 同 性 や 分 子 進 化 に つ い て 検 討 し た 。 最 後 に 、 嫌 気 環 現 ・最 少 培 地 で は 増 殖 で き な い 変 異 大 腸 菌 に 本 酵 素 の 遺 伝 子 を 導 入 す る こ とで 本 酵 素 の 生 理 機 能 の 解 明 を 試 み た 。 第2章 オ ピ ン デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ のcDNA解 析 お よ び 発 現 セ グ ロ イ ソ メ 体 壁 筋 、 エ ゾ ア ワ ビ 貝 殻 筋 、 ホ タ テ ガ イ 閉 殻 筋 、 ウ バ ガ イ 閉 殻 筋 、 お よ び ハ マ グ リ閉 殻 筋 の5種 のcDNA解 析 を 行 い 、そ の 配 列 を 基 に 大 腸 菌 で の 発 現 を 試 み た 。 cDNA解 析 の 際 に 、 内 部 配 列 決 定 の た め の 汎 用 プ ライ マ ー の 設 計 を 試 み た 。

先 ず 内 部 配 列 の 解 析 を行 い 、決 定 さ れ た 配 列 を 基 に した プ ラ イ マ ー を 用 い た5'お よ び 3'.RACEに よ り両 端 の 配 列 を解 析 し、 そ れ らを繋 ぎ 合 わ せ る こ と で 全 配 列 を 決 定 した 。 解 析 さ れ た 配 列 を 検 証 し 、 発 現 ベ ク タ ー を 構 築 す る た め 、 全 コ ー ド領 域 を 含 む 断 片 を PCRで 増 幅 し 、 サ ブ ク ロー ニ ン グ し た 。 解 析 さ れ た 配 列 は セ グ ロ イ ソ メ 、 エ ゾ ア ワ ビ 、 ホ タ テ ガ イ 、 ウ バ ガ イ 、 お よ び ハ マ グ リで そ れ ぞ れ1428、1430、1278、1377お よ び1471塩 基 で あ り 、1191、1215、1200、1227、 お よ び1230塩 基 の コ ー ド領 域 が あ り397、405、400、409、 お よ び410ア ミ ノ 酸 を コ ー ド し て い る と 推 定 さ れ た(図1一 図5)。 ハ マ グ リに お い て は 複 数 の 核 酸 配 列 が 解 析 さ れ 、 推 定 ア ミ ノ 酸 配 列 も変 化 す る こ と か らア イ ソザ イ ム の 存 在 が 示 唆 さ れ た(図5)。 内 部 配 列 決 定 の た め に 設 計 した プ ラ イ マ ーODH-9Fお よ びODH-11R(表1)の 組 み 合 わ せ でPCRを 実 行 した と こ ろ 、 試 み た 全 て の 種 に お い て 目 的 断 片 の 増 幅 が 確 認 さ れ た (図6)。 本 プ ラ イ マ ー セ ッ トは 他 の 多 く の 種 で も 利 用 可 能 で あ る こ と が 確 認 さ れ 、 汎 用 プ ラ イ マ ー と して 今 後 のOpDHsの 研 究 発 展 に 大 き く寄 与 す る も の と考 え る 。 解 析 さ れ た 配 列 を 基 に 大 腸 菌 で の 発 現 を 試 み た 結 果 、発 現 量 に 差 は あ る も の の 、ハ マ グ リ以 外 の 全 て の 種 に お い て 活 性 を 持 っOpDHsの 発 現 に 成 功 した(表2)。 発 現 に は pTV118Nの ベ ク タ ー 、お よ びJM109株 とFMJ39株 の 大 腸 菌 株 を用 い た 。JM109株 は 一 般 的 な 大 腸 菌 株 で あ り 、FMJ39株 は 乳 酸 デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ(1actatedehydrogenase、LDH) お よ び ピル ビ ン酸 ギ 酸 リア ー ゼ(pymvateformatelyase、pFL)欠 損 株 で 嫌 気 環 境 ・最 少 培 地 で 増 殖 す る こ と が 出 来 な い 。FMJ39株 を 用 い た 理 由 は 、 大 腸 菌 由 来 のLDHが 後 の 活 性 測 定 や 精 製 に お い て 妨 害 物 と な る と考 え た の でLDH遺 伝 子 を 持 た な いFMJ39株 の 利 用 が 効 果 的 だ と考 え た か ら で あ る 。 セ グ ロ イ ソ メ 由 来 の 酵 素 は 粗 抽 出 物 で タ ウ リ ン を 基 質 と して 」M109で 平 均180.5ユ ニ ッ ト、FMJ39で 平 均2755ユ ニ ッ トの 活 性 を得 る こ とが で き た(表2)。FMJ39の 方 が 高 い 活 性 を 得 ら れ る が 、 ぱ らつ き は 大 き く な っ た 。エ ゾ ア ワ ビ 由 来 の 酵 素 は タ ウ リ ン を

基 質 と してWildtypeで 平 均81.5ユ ニ ッ ト、T2A変 異 型 で は 平 均45.8ユ ニ ッ トの 活 性 が 得 られ た 。ウ バ ガ イ 由 来 の 酵 素 は ア ル ギ ニ ン を 基 質 と してJM109で 平 均15.5ユ ニ ッ ト、 FMJ39で 平 均45.0ユ ニ ッ トの 活 性 を 得 る こ とが で き た 。 セ グ ロイ ソ メ の 場 合 と 同様 、 FMJ39に 高 い 活 性 が 得 ら れ た 。 ホ タ テ ガ イ 由 来 の 酵 素 は 、 ア ル ギ ニ ン を 基 質 と して FMJ39で1.2ユ ニ ッ ト程 度 の 活 性 し か 得 られ な か っ た 。活 性 が 弱 く発 現 法 の 改 良 が 必 要 で あ る が 、基 質 の ア ミ ノ 酸 お よ び ピ ル ビ ン酸 を 加 え な い 条 件 で の 値 と の 差 を考 慮 す る と 、 本 酵 素 は ア ル ギ ニ ン を 基 質 とす るOcDHの 可 能 性 が 高 い と 考 え られ る 。ハ マ グ リで も発 現 を 試 み た が 、 活 性 を も っ 酵 素 の 発 現 に は 至 っ て い な い 。 大 腸 菌 で の 発 現 に よ り酵 素 の 基 質 特 異 性 つ ま りOpDHsの 種 類 を 明 らか にす る こ と が 可 能 とな り、 セ グ ロ イ ソ メ お よ び エ ゾ ア ワ ビ のOpDHsをThDHと 、 ホ タ テ ガ イ お よ び ウ バ ガ イ のOpDHsをOcDHと 確 定 し た 。 セ グ ロ イ ソ ・メ 由 来 の 馳DHを 完 全 精 製 し(図 6)、 ア ミ ノ 酸 基 質 特 異 性 を 明 ら か に した(表3)。 そ の 結 果 、 タ ウ リ ン に 非 常 に 特 異 的 な 酵 素 で あ る こ と が 明 ら か と な り、 こ の 性 質 は 天 然 物 由 来 の 酵 素 と ほ ぼ 同 様 で あ っ た 。 エ ゾ ア ワ ビ は60%飽 和 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム 塩 析 の 上 清 を80%飽 和 に して 遠 心 分 離 に か け た 沈 殿 を 透 析 し て 得 た 部 分 精 製 物 で 活 性 を測 定 し た(表4)。 こ の 処 理 に よ りJM109株 に お い て も 基 質 と して の ア ミ ノ酸 を 加 え な い 条 件 で のNADHのNAD+へ の 酸 化 、 す な わ ちLDH様 活 性 が な く な る こ と が 確 認 さ れ た 。 相 対 活 性 を調 べ た 結 果 、 ア ラ ニ ン に対 し て 天 然 型 で5.3%、T2A変 異 型 で4.8%の 相 対 活 性 を 示 し 、有 意 な 差 が 認 め られ た 。 こ の 性 質 は 二 番 目 の ア ミ ノ酸 の 違 い で あ り、N末 端 側 の ア ミ ノ酸 が 基 質 特 異 性 に 影 響 を 与 え る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。ウ バ ガ イ で も エ ゾ ア ワ ビ と 同 様 に 硫 安 分 画 を行 っ て 活 性 を 測 定 した(表5)。JM109株 お よ びFMJ39株 で 発 現 さ せ た ウ バ ガ イOcDHは リジ ン に 対 し て 、 そ れ ぞ れ3.8%お よ び3コ%の 相 対 活 性 を示 した 。 そ れ 以 外 の ア ミ ノ酸 で は 活 性 は 認 め られ ず 、 ア ル ギ ニ ン に 対 す る 基 質 特 異 性 の 高 い 酵 素 で あ っ た 。

第3章 オ ピ ンデ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ の 分 子 進 化 これ ま で 知 られ て い る5種 類 のOpDHsは 、 基 質 とす る ア ミ ノ酸 の 種 類 や 基 質 特 異 性 の 高 さ な ど酵 素 的 性 質 が そ れ ぞ れ 異 な っ て い る 。そ こで 、 これ ま で に解 明 さ れ て い る 海 産 無 脊 椎 動 物OpDHsのcDNA配 列 お よ び 推 定 ア ミ ノ酸 配 列 を 比 較 検 討 し、 構 造 的 特 徴 を 探 る と と も に 、 系 統 樹 を 作 製 し、OpDHsの 分 子 進 化 が 従 来 の 形 態 お よ び 解 剖 学 的 系 統 分 類 に 沿 う の か 、 も し く は 基 質 特 異 性 に よ っ て 分 類 さ れ る の か 検 討 し た 。 推 定 ア ミ ノ酸 配 列 の 多 重 ア ラ イ メ ン ト(図8)は 、 全 体 的 に 変 異 に 富 ん で い る が 、 配 列 が 非 常 に よ く保 存 さ れ た 部 分 が 全 体 に 散 らば っ て い る こ と か ら、こ れ ら の 酵 素 が 同 じ 酵 素 フ ァ ミ リー に属 して い る と 考 え ら れ る 。この 保 存 性 の 高 い 部 分 は 酵 素 と して 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る と 思 わ れ る 。 中 で も 、GGGNXAの 配 列(図8の18.23残 基)は 、 脱 水 素 酵 素 に お け るNADH、FADHお よ びNADPHと い っ た ジ ヌ ク レオ チ ドの 結 合 に 関 与 す る 部 分 の 共 通 配 列GXGXXGIAと 対 応 して お り、.本酵 素 に お い て も補 酵 素NADH の 結 合 に 関 与 し て い る 部 分 で あ る と考 え られ る 。 他 のNADHな ど ジ ヌ ク レ オ チ ドを 補 酵 素 と す る 脱 水 素 酵 素 で は 、 ア ラ ニ ン の 部 分 は グ リ シ ン で あ る こ と が 多 い が 、海 産 無 脊 椎 動 物 のOpDHsで は ア ラ ニ ン で あ る こ と が 一 つ の 特 徴 で あ る と考 え られ る 。 核 酸 配 列 相 同 性(表6右 上)は 、50%前 後 の 値 が 多 く 見 られ た 。 しか し、 腹 足 綱 同 士 や マ ル ス ダ レガ イ 目 同 士 で は61%と や や 高 く な っ た 。 イ カ 綱 同 士 や イ タ ヤ ガ イ 科 同 士 で は80%を 超 え る 更 に 高 い 値 と な っ て お り、近 縁 に な る に つ れ て 値 が 高 く な っ て い た 。 二 枚 貝 綱 で は 変 異 が 多 く 起 こ っ て お り 、 特 に ハ マ グ リ(Mlu-1お よ びMlu-2)は 同 目 の ウ バ ガ イ と61%の 相 同 性 を 示 す も の の 同 綱 の ヨ ー ロ ッ パ ホ タ テ ガ イ と は21、2%と 非 常 に 低 い 値 を 示 した 。 しか し 、 ホ タ テ ガ イ と は45%の 標 準 的 な 相 同 性 を 示 し た 。 ア ミ ノ 酸 配 列 相 同 性(表6左 下)は40%前 後 の 値 が 多 く見 られ た 。 こ こ で も 腹 足 綱 同 士 で は61%、 マ ル ス ダ レ ガ イ 目 同 士 で も57%と や や 高 くな り、 イ カ綱 同 士 や イ タ ヤ ガ イ 科 同 士 で は90%前 後 の 非 常 に 高 い 値 と な っ て お り、 近 縁 に な る に つ れ て 値 が 高 く

な っ て いた 。 OpDHs遺 伝 情 報 か ら 作 成 した 系 統 樹(図9)は 、 ア ミ ノ酸 基 質 特 異 性 に よ る ク ラ ス タ ー(OpDHs毎 の ク ラ ス タ ー)を _{形 成 す る こ と は な く 、 曲 体 亜 門 に属 す るイ カ 綱 と腹 足} 綱 が 直 体 亜 門 に 属 す る 二 枚 貝 綱 よ り も 小 さ な ク ラ ス タ ー に 収 ま る な ど 、形 態 学 的 お よ び 解 剖 学 的 解 析 に基 づ く 系 統 分 類 と一 致 し て い た 。

第4章

オピンデ ヒ ドロゲナーゼの生理機能

本章では、遺伝子欠損 により嫌気環境 では増殖で きな い大腸菌株 に本酵素の遺伝子 を

導入 ・発現させ 、嫌気環境下での増殖能 の再獲得 を試 み、本酵素 の生理的役割 につ いて

直接的証拠を得 る ことを 目的 とした。

大腸菌FMJ39株

はLDHお

よびPFLの

欠損株 であ り、嫌気環境 ・最少培地で増殖 が出

来ないが、PFLの み欠損の場合 は、LDHがNAD+の

供給者 と して働 くと考 え られるため、

培地への酢酸塩 の添加で 増殖 演可能 とな る。 ウバ ガイ 由来OcDH遺

伝子 を導入 した

pTVSsaFMJ39で

は同条件下で多数のコロニーが認め られ増殖 が確 認された(図10)。 よ

って、ウバガイ由来OcDH遺

伝子の導入 によ りFMJ39株

は嫌気環境下での増殖能 を再

獲得 した。 この ことよ りOpDHsは

嫌気環境下 にお いてNAD+の

供給者 として重要な機

能 を果た し、機能的にLDHと

置き換え可能 である ことが示 された。 この ことをよ り強

く証明す るために菌体内でオク トピンが生成 され ることをHPLCで

確 認 した。菌体 のエ

キス成分 に標品 のオ ク トピンの ピー クと同 じ保持時間 を持っ ピー クが見 られた(図11)。

この ことか ら、導入 した遺伝子は菌体 内で正常に発現 、翻訳 され、生成 された酵 素は解

糖で生 じた ピル ビン酸 と遊離のアルギニ ンか らオク トピンを生成 した ことが確 認 され

た。本実験によ り、OpDHsの

主な生理機 能 は、嫌気環境下 における解糖 を維持す るた

めのNAD+供

給 であ り、嫌気環境下で のエネルギー産生 に重要な役割 を持 って いる こと

が直接的に証明された。

第5章 総 合 考 察 本 研 究 で 設 計 し た 共 通 プ ラ イ マ ーODH-9Fお よ びODH41Rに よ る 内 部 配 列 の 解 析 を 足 が か り と す る 方 法 は 、 多 く の 種 でOpDHsのcDNA解 析 を 可 能 に し た 。 さ ら に 、 こ の 方 法 で 解 析 さ れ た 配 列 を 基 に 大 腸 菌 で 発 現 さ せ る こ と に 成 功 し 、 基 質 特 異 性 す な わ ち OpDHsの 種 類 を 明 らか に す る こ と が 可 能 と な っ た 。 そ の 結 果 、 セ グ ロ イ ソ メ お よ び エ ゾ ア ワ ビ のOpDHsを 艶DH、 そ して ホ タ テ ガ イ お よ び ウ バ ガ イ のOpDHsをOcDHと 確 定 した 。 こ の よ う に 、 動 物 種 に よ り発 現 し て い るOpDHsの 種 類 が 異 な っ て お り、 そ の 理 由 に興 味 が 持 た れ た 。 推 定 ア ミ ノ 酸 配 列 を 多 重 ア ラ イ メ ン ト に供 し た 結 果 、全 体 的 に 変 異 が 多 い も の の 、非 常 に 保 存 性 の 高 い 部 分 も散 在 し、 そ の 内 の 一 つ は 補 酵 素NADHの 結 合 に 関 与 し て い る 共 通 配 列 で あ る と 考 え られ る 。 OpDHs遺 伝 情 報 か ら作 成 した 系 統 樹 は 、 これ ま で の 形 態 学 的 お よ び 解 剖 学 的 解 析 に 基 づ く系 統 分 類 と 一 致 して い た 。OpDHsは 近 縁 関 係 に 応 じて 変 異 の 程 度 が 大 き く変 化 し て お り、OpDHsフ ァ ミ リー のcDNA解 析 は 、 未 だ 不 明 な 点 が 多 い 系 統 進 化 、 と りわ け 海 産 軟 体 動 物 間 の 科 お よ び 属 レベ ル で の 類 縁 関 係 を 明 ら か に す る た め に 役 立 つ と 考 え られ る 。 OcDH:遺 伝 子 の 導 入 に よ りFMJ39株 は 嫌 気 環 境 ・最 少 培 地 で の 増 殖 能 を 再 獲 得 した 。 OpDHsはLDHと 同 様 に嫌 気 環 境 に お け るNAD+の 供 給 者 と して 機 能 し 、機 能 的 にLDH と 置 き換 え 可 能 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 本 研 究 に よ り、OpDHsの 主 な 生 理 機 能 は 、 嫌 気 環 境 下 に お け る 解 糖 を維 持 す る た め のNAD+供 給 で あ り、嫌 気 環 境 下 で の エ ネ ル ギ ー 産 生 に 重 要 な 役 割 を 持 っ て い る こ と が 直 接 的 に 証 明 さ れ た 。

5 GCCG TTG CCT CAG TCTCACGTCTTCTTTTTCCGC TTGTGCTGTGGATAAATTGAC AATGCCGCCCACACG NAAHT CTG L ACC T GTG V ACCTTGTATGCC TLYA TTG L GAC D ACCATCAAGTATGCC TIKYA ACCAAG TK GCTTTT AF GTTGTG VV CTTGCC LA GAGTTT EF AATGGG NG G T ー 均 C ATG 匿 GCT A C ρ U S A C G S A AAG K TGT C CCA P CTC L CCA P AAT N AAT N G ︻し ム 抽 G AAT N CAT H A C P C T C ム μ G GGTTTTCCG GFP 蝋 K A ρ U ρ b G CAA e AAG K GAG E CAG e GGT G TGCACG CT TGC ATC TCGAGC ATGGTT MV GCTGGCATAGCATCCAAC AGIASN GAGGCAGAGCGATGGATC EAERWI ACC T CAG e TAC Y CAG Q GTG V TCTTAG GTCCTA VL CAG Q 蝋 x A C nr C C ρ し S T GGTAAGGACCCTGTCCACCTC GKDPVHL GGAGCTACTGGTGCAGACATC GATGADI CTGACAGCATTAAAACCCCAC LTALKPH CGC ACT T AAC N ATG M 醐 K ATC l GTG V AGC ATC i ATG M G ム n E G A C T 五 A C T 乙 V G G 触 K CCTGGCTTCGACTTCGAGATCATGAAG PGFDFEIMK ATGAATTTCGTATCCCTCCCCTGGGCT MNFVSLPWA TCTGTGGAAGTTCTGGCTACCAAGGAT SVEVLATKD ACTGTGGCTCCCAAGATGGATCCAACTGCAATG TVAPKMDPTAM ATG M ATC I AGGTTGGAATGCTCCGGACACCTGTTGGGCATGTCC RLECSGHLLGMS CAC H CCA P CCCTCCATCATG PSIM CTCTTTTACCAT LFYH TATAACAGG YNR GGTCTGAGC GLS GAAACCATTGCCATTGCCAAGAAG ETIAIAKK C T 二 V G AGCAGC SS ATC I CTC L TGG W CAG Q GTC V CATGAC HD GCTGGT AG ATGGAA ME CATATGCATCCCTATTATATCGGTGCC HMHPYYIGA G ρ U W T A C ム 昌 G ATG M CAA Q ATT I GAT D GAC D C T F T C ρ U 月b G G → ﹂ M A C ρ U ρ U G C T 且 L C CAACGTCAA QRQ TATCCGGAT YPD TACACCTGCATAAACACCAATGCAGGCTTC YTCINTNAGF ACCAAGACTGCCGATGGCAAG TKTADGK GACATCCCCTTTGGGCTGGCCGTG DIPFGLAV TTC F ACC T GTGCCTGACTTCACC VPDFT AAG K GGG G T r U ρ U G T rU R C CTGGCCCAG TGTGGAGGA CGG GAGGTGAGA EVR ACCAACGAC TND AAGCCAAAG KPK ATCACAGTT ITV CCTGGAACT PGT ATCTGGGGA IWG TGCCGTATC CR] GGGTCAGTG GSV TGCCTGGGG CLG GCAGTC AV AAACCAGTA KPV TTGTCTGAT LSD GGAGTAGAT GVD GACATTAGT DIS CTCACCCAT LTH TACTTTGGG Y CGGGGCATTGCAGAAATAGCGGGC RGIAEIAG CCCAACATTGACAAGATCATCGAATGGGCC PNIDKIIEWA GGTGGCAAGTTCACTGGTAAAGATATCAGT GGKFTGKDIS C 触 N TTT ACC T GTA TTGGACTCGATTCTGTGA LDSIL* CAG Q GCA A AAGCTGATG KLM ACTAGGGCT TRA GGC G CCA P AAACTTACTTGACGCCACACA GAGATGGGAACCCTTCACCCAGTGCCAAACATTATAAGC CCTGAAAATCTGATCGGATACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA F TGC C GAC C ρ U ρ U G C T l V G C T 二 F T T T 累 L C T ρ し D l C G T V G T ■ . ム 砧 D G G M K A ρ U R A A C D ユ C AATゴGGC NG GAT D GTC V C T 二 ー ︼ C C ム n D G CCC P GAA GE CCCACC PT AAGGAGTATTTGGTT KEYLV CAA 4 ACA CGTTACGGGTTC RYGF TCATGCCCATAT TCCAAT AA3' ACAGAACTC 図1セ グ ロ イ ソ メTaDHのcDNA配 列 お よ び 推 定 ア ミ ノ酸 配 列 「*」は 終 止 コ ドン を 示 す 。 1 6 1 0 2 1 1 1 0 8 3 1 1 0 4 rO 2 1 0 0 7 3 1 0 鳶 U 9 3 1 0 0 乙 裏 4 1 1 0 8 0 0 4 1 1 0 4 = ﹂ 5 1 1 0 0 7 2U l 661 190 721 210 1 0 8 3 7 2 1 0 ﹂ 優 ︻ ﹂ 8 2 -nU O 7 9 2 1 0 農 U 9 α ﹂ 2 1 0 2 1 0 00 1 1 0 Q Q り 0 0 0 0 1 1141 350 1201 370 1261 390 1 7 n乙 O J O O 3 1 1381 1428

5'GAGTGTGTGCGGTGGCTGTAAACGATCGGACTCGCGTCTGGAATTACCTGGAGTATATTTCG CACTGTAGGTAGTGTCTACCCATCTGACTTCCC AAAATGACGAAGAAGATAACCGTCCTC MTKKITVL GTTTGCGGGGGAGGCAATGGCGCCCACGTGACAGCTGGTCTCGCTGCATCACGTGATGAC VCGGGNGAHVTAGLAASRDD 62 2 8 2 1 2 8 8 り 6 1 ATTGAAACGAGGGTGCTCACGACATTTGCTGACGAGGCAGAAAGATGGACGAACATCATG IETRVLTTFADEAERWTNIM 06 8 4 4 2 . AAGGAGAACGATCTCAGGATTACCGTCGATGAAGGTGACATAAAAAGCGGAGAATCGGTA KENDLRITVDEGDIKSGESV GATTTTAAGGTTAAACTCAATTGCATCACCAAAGACCCGTCCAAGGCGGTTCCGGGTGCC DFKVKLNCITKDPSKAVPGA 9 白 8 0 2 U 3 り 4 8 2 U 8 3 GATGTCATAATTTTCACGGTTCCAGCGTTTGCCCACCAGAGCTACCTCGAAGCCATTGAG DVIIFTVPAFAHQSYLEAIE CCCTACATTCAACCTAACACCACCATTGTTGGAATGCCTGGTCAGCCTGGGTTTGAGTTC PYIQPNTTIVG昭PGQPGFEF CAGGTGTTTGATGTGCTTAAGGACAAGGCCAAGCAGTGTGTCATCATGTCGTTTGAGTCT QVFDVLKDKAKQCVIMSFES り 乙 8 り 4 0 ﹂ 絵 1 り 乙 8 8 0 ム 4 1 り 乙 0 0 4 4 r ﹁U 正 TTGCCTTGGGCTTGTAGGATCGCTGAATTTGGCAAATTTGTTCAGATCCTGATGGTAAAG LPWACRIAEFGKFVQILMVK GTAAATCTTATGGGATGTTTAATTCGCGGTCAGAGCAAGCCTTCGTATGATCCAATGGAA VNLMGCLIRGQSKPSYDPME GCTGTTCAGAGAGTGATGGGAAAAGCACCTATTCTTACCCAGGCGAATAATTACATTGAA AVQRVMGKAPILTQANNYIE CCAATACTCGCCACTAAGTCTATCATCCATCCTCCGATAATGTACGGTAAATGGAAGGAC PILATKSIIHPPIMYGKWKD TGGGATGGTAAACCCATTGAGGAGAAGCCCCTATTCTACCAAGGTCTTGACGAAGAGCAA WDGKPIEEKPLFYQGLDEEQ り 6 8 0 2 U 己 U l 0 6 8 2 U 8 α U -n 乙 8 0 乙 0 ワ ー 2 06 8 8 2 7 2 2 8 4 4 8 2 GCTCGTTATCTTGGCGGTATAAGTGACGAGTTAGTGGCGACGGCCAAAGCTATTGCGGCA ARYLGGISDELVATAKAIAA CAGAAACCGGAAGTGGATCTTTCCGGTGTCCTTCACCTTTACGACTGGTACCTTCGCGAT QKPEVDLSGVLHLYDWYLRD 9 ム 8 0 丑 0 9 9 6 り 白 0 0 農 U 8 9 2 CACAAACCATACATCAAAGATACAACCAGTCTCCTAACTGTCTTGCAGACAGACACGGCA HKPYIKDTTSLLTVLQTDTA TATGACGGCCTTGTCCATCCGATGAAGGAAACAGAAGATGGCAAATTTGTTCCAGATTTT YDGLVHPMKETEDGKFVP・DF 1022 308 1082 328 CGCTACCGGTACTTGACAGAGGATGTCCCGAACGGCCTGGTGGTGACCAAAGGGCTGGCC RYRYLTEDVPN'CLVVTKGLA 1142 348 CAGATCGCGGGCGTCCCCACACCCTACCATGATGAGGTGATAGCCTGGTGTCAGAAGCAG QIAGVPTPYHDEVIAWCQKQ 1202 368 CTGGGCAAGGAGATCATTGTTGGTGACGAGCTGAAGGGGAAAGATATAGGCAGTACAAGA LGKEIIVGDELKGKDIGSTR 1262 38S TGTCCCCAGCGTTATGGCATCAACACTATGGATGCTCTTGTTAATATCATGTGAACAATG CPQRY'GINTMDALVNIM# ACGCTGTCTTTGACGTCAGGAAACGTAATTGGCATAACAAGTAGGCCGTTCAGGGACGGA CCATTCATATTCGGGGAGGGGTGGTGGTGGGTTGTTCTGGAGTATTAC3' 1322 405 1382 1430 図2エ ゾ ア ワ ビ 血DHのcDNA配 列 お よ び 推 定 ア ミ ノ酸 配 列 「*」'は終 止 コ ドン を 示 す 。

5'GGAGAAAAACGCTCTACACACTCGGACAAAGTATCCCGTGA GATATGACGCTCAAGGTTTGT MTLKVC GTCTGCGGAGGAGGGAATGGCGCCCACACCCTCTCAGGTCTCGCAGCGTCCAGAGACGGG VCGGGNGAHTLSGLAASRDG り 4 ρ U 6 2 農 U h ソ 白 2 1 GTCGAAGTTCGTGTCCTGACGCTGTTCGCTGATGAAGCCGAGCGTTGGACAAAAGCTCTA VEVRVLTLFADEAERWTKAL 0 4 盈 U 8 4 1 GGGGCTGATGAACTAACGGTGATTGTAAATGAAAAAGACGGAACACAGACAGAGGTCAAG GADELTVIVNEKDGTQTEVK TCACGCCCAAAGGTCATTACCAAGGATCCTCAAGTTGCCATCACTGGGGCGGATGTTGTG SRPKVITKDPQVAITGADVV ATCCTGACAGTTCCAGCGTTTGCACATGAAGGCTACTTCCAAGCCATGGCCCCGTATGTA ILTVPAFAHEGYFQAMAPYV CAGGACTCAGCTCTTATCGTAGGCCTTCCAAGCCAGGCGGGTTTTGAATTCCAATGTAGG QDSALIVGLPSQAGFEFQCR GATATTTTAGGAGACAAGGCAGCCGCGGTTTCTATGATGTCATTTGAAACTCTTCCCTGG DILGDKAAAVSMMSFETLPW 0 乙 2 U 4 己 U 2 9 6 2 U O 8 3 2 ρ U 躍 U O O O I り 4 己 U O ム 0 4 4 1 0 6 盈 U 8 4 4 1 GCGTGTCGTATTAAGGAGTTTGGTAGGAAAGTTGAAGTACTAGGAACAAAATCTGTGCTT ACRIKEFGRKVEVLGTKSVL り 乙 2 U 4 2 U FO l GCAGCTTCTCTCATAAAAGGTACGGCAGAGACCGTTGATCCATTGTCAACGCTACAGAAG AASLIKGTAETVDPLSTLQK 0 6 盈 U O 8 2 U l CTCCACGGTGCCGAACCAGTCTTCCGCCTTGCCAAACACTTTCTAGAGATGGTGATCATG LHGAEPVFR.LAKHFLEMLIM AGCTACTCGTTTGTCCATCCTGCCATTTTGTATGGCCGAfiGGGGTTCATGGGACGGTAAC SYSFVHPAILYGRWGSWDGN Ω 6 4 U 魔 U O 震 U 2 9 乙 2 U 9 0 2 ワ ー り 右 CCGGTGTCTGAAGCACCACTGTTTTATCAGGGTATAGACCAGGCCACCGCGGATATGTTG PVSEAPLFYQGIDQATADML ACAGCCTGTAGTGACGAGTGCAAGGCCGTGGGGAACGCCATCATGGCGGCGTGTCCAGGC TACSDECKAVGNAIMAACPG リ ム 盈 U O O 4 ワ 醒 り 6 2 2 U 4 齪 U 8 9 ム AATGACCTATCTGACGTCAAAGATATCTATCAATGGTATCTTGAGTATTACCACGAAGAT NDLSDVKDIYQWYLEYYHED ATCCAAGACGACCACGACCTTTACCACGCGATCACCACTAACAAGTCCTATAAGGGGCTC IQDDHDLYHAITTNKSYKGL GTTCATCCAGTCAAGACAGTAGATGGCGGCGTCGCTCCCGACTTCGGGAATCGTTACCTG VHPVKTVDGGVAPDFGNRYL り 右 盈 U O 8 0 ﹂ 2 2 2 U 藍 U O O J り 0 9 6 盈 U O 4 リ ム 0 3 ACGGAGGACATCCCGATGGGGATGATTGTGTTTAAAGGCGTGGCTATTGCAGCCGGAGTA TEDIPMGMIVFKGVAIAAGV 2 6 8 4 0 9 0 CCCATCCCTAACAACGACAAGCTGATCACGTGGGCTCAGGAGAAGATCGGAAAGGTGTAT PIPNNDKLITWAQEKIGKVY リ ム 農 U 4 農 U 1 0 0 1 CTCGTGGACGGAGCTCTGACCGGCAAGGATGTGGCAACAACGCGCTGTCCTCAACGTTAC LVDGALTGKDVATTRCPQRY GGCTTCAACACACTCAACGCTATTCTTACAGGCAAAAAGGAGTAA GFNTLNAILTGKKE* CCGGACAGTGTTGGT り 6 6 0 8 9 白 り 0 1262 400 AGTTAGTGACCAGTGT3' ' 1278 図3ホ タ テ ガ イOcDHのcDNA配 列 お よ び 推 定 ア ミ ノ 酸 配 列 「*」は 終 止 コ ドン を 示 す 。

5 ACCGTCGAAGTCAATGTGAAGGTCGTTTGATTTCCTGGAGAATCACCGGCTGACATACGTT AAAGTTTTGACGGCTTTGTTATTCTGTTATTGACTGACA ATGTCAAGAAGTTTGGAAAAG MSRSLEK AGTTGTAACATCACCATATTTGGTGGTGGTAATGGGGCCCATGTTTTATCGGGTCTTTCC SCNITIFGGGNGAHVLSGLS TCTGACGTAGTTAATGCCAATGTGACAGTTGTTGACACATTCCAAGATGAAGCTGAGAGA SDVVNANVTVVDTF4DEAER TGGACAAAAGCAATGGCCGCCAATGGGTTT.ACAGTTAAGTATGGGAATGGGAAGGATCTT WTKAMAANGFTVKYGNGKDL GTCCAAGCACCTGGAAAACCTAAGTTTACTGTCACTAAAGAAGTTCAGAAGAACGTTGAG VQAPGKPKFTVTKEVQKNVE AAAGCAGATGTGGTTATTCTCTGTATGCCAGCTTTCTTGCACGAAATGGTCCTTACTTCA KADVVILCMPAFLHEMVLTS GTGGCACCATATGTACCAGAAACTTGCCCCATTGTAGGATTACCAGGTCAGCCGGGTTTC VAPYVPETCPIVGLPGQPGF GAGTATCAAGCATTATTTCATCTTCGACAAAATGGCAAAAAAGGCAGCGTCATGTCAATT EYQALFHLRQNGKKGSVMSI GAAACACTTCCATGGGCTTGCAGAATTGCCAAGTATGGTCAAGAAGTTGATGTTATTGGA ETLPWACRIAKYGQEVDVIG ACAAAAGAATGTATATATTTCTCATCAGTAGATCAGCAGAGCAGTGGCTATGTTGGAGCT TKECIYFSSVDQQSSGYVGA GGATTGGTTCAACTTATTCAGACCCTTCTTGGTGCAAAGCCAGTGCTCAAACGGGAAGAA GLVQLIQTLLGAKPVLKREE AATATCATCAAGTACACATTCTTGTACCGTCCAACTGTTCATCCTCCACTCATGTATGCC NIIKYTFLYRPTVHPPLMYA AAATGGAAAAACTGGGATGGTAAACCATTAGATGCAGCTCCTCTCTTCTACCAAGGTGCT KWKNWDGKPLDAA、PLFYQGA GATGAAGAAGCTGTGAAGTATCTTGATGGTGCCACAAATGAAATGATTAAGATCGCTGAT DEEAVKYLDGATNEMIKIAD TTCCTTCAAACAAAATATCCTGACATGGATTTTTCGGGCATTTCATCTATGCAGGACTGT FLQTKYPDMDFSGISSMQDG TTTATAGGTGAATATCCAGAACAGATCAAAGATAAGAGTACCCTCCTCTCATGTTTGAAG FIGEYPEQIKDKSTLLSCLK ACAAACCAAGCTTATGATGGATTGGTTCATCCCATGAAGAAGACGGATGATGGTAAGTTT TNQAYDGLVHPMKKTDDGKF GTACCAGATTTCAAGTACAGATATTTGATGGAAGATGTTCCTTATGGTTTGTTGATTATC VPDFKYRYLM8DVPYGLLII AAGCAGATAGCTGAGATGGCTGGTGTGGCTACACCTATAATTGATGAAATAATCCTTTGG KQIAEMAGVATPIIDEIILW GCTCAGACGAAAGTGGACGCTGAATATCTGAAAGATGGAAAATTATGCTTTGTGGACAGA AQTKLDAEYLKDGKLCFVDR AAACATGGCAGAATACCTATGGCATTTGGAATAAAGACCCTGGAGGAGTTTGTTAACTAC KHGRIPMAFG(KTLEEF'VNY 61 ー ワ { 2 1 ー ワ 8 8 9 白 1 1 7 4 ﹂ 恐 2 ー ワ ー 0 2 U 3 1 7 罐 U 8 3 ー ワ ー 0 ム 0 4 1 1 7 8 9 4 4 1 -? ﹂ 讐 4 FO -ー ワ ー 0 2 U 2 U l ー ワ ー 2 0 8 6 1 ー ワ 8 2 0 7 9 6 1 7 8 り 4 7 0 乙 1 7 . 4 匹 ﹂ 恐 8 り 自 ー ワ ー 0 2 U O J 9 右 蓋 7 2 U 8 9 2 1021 307 ー ワ σ 8 り 山 0 0 0 1 1141 347 1201 367 1261 387 1321 407 TGCAAGTAAACATTTGTAACA CK* TTTACCCTAGAAGTAAAAGGAATGACATCATAEAG3' 1377 409 図4ウ バ ガ イOcDHのcDNA配 列 お よ び 推 定 ア ミ ノ酸 配 列 「*」は 終 止 コ ドン を 示 す 。

5 GACTGTCTTACTAGTGCATCTACGTATCATCTTGTACAAAAATCAGATTGTGAGGAATGC60 CATAGACGTAACAAAACAGTTTTGAATTTGGTTTGACAAAGGCAAGCTCTGTGCACATCA120 AATATGGEGGGATTCCAAGACAAAATCCACGTCACGATCTGCGGTGGAGGGAACGGCGCC180 MAGFQDKIHVTICGGGNGA19 CATACTTTCGCCGGAATTTCTTCTTTGGTTCCAAATGCAAATGTTATTGTTCTTGATATA240 HTFAGISSLVPNANV・;奪VLDI39 300TATGAAGACGAAGCGGAAAGATGGACTGAGAGTATGAAAACTCATGGTTTCGCAGTTAAA 59YEDEAERWTESMKTHGFAVK CGTAGTGATGGTAAAATATTGCACCAGAAGCCGGGCAGCETAAATTTCAGTGTAACAAAA360 RSDGK… 韮LHQKPGS「 「プ華NFSVTK79 GATGTGAAATCTGTTGTTCCGAAATCAGACATTGTGATCATAACGGTTCCGCATACACG420 99DVKSVVPKITVPAYTSDIVI 480CACGAAACATATCTGAATATCATTGCACCTTATTTGCCGGAGTCGTGTCCTGTTGTTGGA llgHETYLNIIAPYLPESCPVVG ATGCCTGGCCAGCCGGGATTTGAATATCAAGCGCTAACCATTCTTAAAGAAAACAACAAA540 MPGQPGFEYQALTILKENNKI39 AAATGTCCCGTTATGTCCATTGAAACACTGCCATGGGCTTGCAGGATTTCGAAATACGGA600 KCPVMSIETLPWACRISKYG159 CAGGAGGTGGTAATGGTCGGCATAAAAGAAGAAGTGTGCTACACATTTATAGAGCAAAAT660 QEVVMVGIKEEVCYTFIEQN179

轡AITAIG讐TIG轡AIGAITCIAGIGAITCITTIAC母A蝉CIAGITIIl

響 響A料TCIGCIAG掛G合T糟TTIA膿GTICAIATITCIGTITAIACITIIl

ACAATACATCCACCTATTATGTATGCGAGATGGAAAGACTGGAATGGCGAACCAGTGGAG840 PIMYA.RWKDWNGEP.異iE239TIHP ACACCGCCGCTGTTTTACCAGGGTGTCGATGAAAGCTCGGTGAAATACCTTGACGGTCTA900 TPPLFYQGVDESSVKYLDGL259 ACAAATGAGGTACTTGAAA奪 嚢GCAGAAGCGCT奮AAAGAATATCT建CCCGGGCTGGATTTC960 TNEVLEP..AEAL`KEYLPGLDF279 ACTGGCGTTTCAACGATGCAACAATGGCTGTTAGACCATTACACCGATCAAATTGAGGAC1020 TGVSTMQQWLLDHYTDQIED299 AAGAGTTCACTACTCACGTGTTTAAAAACCAACAAAGCATATGATGGTCTACTTCATCCT1080 KSSLLTCLKTNKAYDGLLHP319 ACCACACGAACAGCCGAGGGAAAATACGTTCCAGATTTTACCTATCGCTATGTCAGGGAA1140 TTRTAEGKYVPDFTYRYVRE339 GAGGTTCCTTATGGTTTGATAGTGCTTCGTCAAATAGCCGACATGGTCGAAGTTAGGACG1200 DVPYGLIVLRQIADMVEVRT359 CCCATTATTGATGAGATTATTGAGTGGGCCCAAACAAAGATAGGTGTACAGTTTTTACAG1260 PIIDEIIEWAQTKIGVQFLQ379 GATGGAAAGCTATGCGACCTTGACAGGGCTAAAGGCAGGCT:TCCGAAGACCTACGGCATC1320 LDRAKGRLPKTYGI399DGKLCD AATTCCATTGAAGAATTTGTTAATTTTTTTGCCTAATACAATCTGCAGGCTTTAATGGTT1380 NSIEEFVNFFA#410 TAACGCATTGCGTTAATTTGCTTTCTTTGGGGCGACTTAAGGTTTCAACTTCTGTAGAAA1440 AAAATATTGTCCGCGTAATTTAATCAAGTGT3'1471 図5ハ マ グ リOpDHのcDNA配 列 お よ び 推 定 ア ミ ノ酸 配 列 「*」は 終 止 コ ド ン を 示 す 。 異 な る 塩 基 も解 析 さ れ た 部 分 、 お よ び そ れ に よ っ て ア ミ ノ酸 配 列 が 変 化 す る 部 分 は 網 掛 け を して あ る 。

表1汎

用 プ ライマーの配列

プ ライ マ ー

配 列*

ODH-9F

5'一GCYGACGARGCMGAGMGVTGG-3' ODH-11R 5'一CGRCAVGCCCARGGRAGRGWYWCRAA-3' *YはTお よびCを 含 む RはAお よびGを 含 む MはAお よびCを 含 む VはA、Gお よびCを 含 む WはAお よびTを 含 む by 1500

珊

輔

鋤

鱗

雛 乳

欝

聯

、

1234567

図6各 種 海 産 無 脊 椎 動 物 に お け るODH.9Fお よ びODH-11Rで のPCRに よ る 増 幅 矢 印 は 目 的 の 断 片 を 示 し て い る 。 レ ー ン1お よ び7100bpDNALadder、 レ ー ン2オr4わ ε〃屠7fco'07、 レ ー ン3撫'ご θf捨4細c鱈 加 π〃4f・ レ ー ン4P厩 πρρεc彪πyξ∬oθ澗 お・ レ ー ン5⑫ 融 如 ∫4c加 伽 ε鰐 臨 レ ー ン6耽 だ罐1斑or如

表2粗

抽 出物における活性

由来 大腸菌 基質 見 か け の 活 性(Uんube) 平 均 偏 差AA(一)r(一) セ グ ロ イ ソ メWildtype セ グ ロ イ ソ メWildtype JM109Taurine.173韮93188168180.511.9

ホ

ホ

FMJ39丁aurjne227319329227275,556。2 エ ゾ ア ワ ビWildtypeJM109Tau㎡ne エ ゾ ア ワ ビT2AmutantJM109Tau6ne s2zse2as 42464847 ウ バ ガ イ 臓ldtypeJM109Arginine16151516 ウ バ ガ イ 棚ldtypeFMJ39Argini爬40454748 81.54.1 45.82.6 15.50.6 45.03.6 ホ タテ ガ イT2Am晦gr詫FMJ39Arhine1.201.211.221.24t2180.017 1.210.37 1.170.45 1.210.56 0.730.23 0.650.54 0.500.47 AA(→ アミノ酸基質なし PyKg)ピ ルピン酸およびアミノ酸基質なし 一 未測定 *酵 素 の ユ ニ ッ ト数 は_{、5m1の 培 地 の 入 っ た 試 験 管1本 当 た り の 量 で あ る} **こ の 株 は 南 イ リ ノ イ 大 学 のDavidRC1肛k博 士 よ り分 与 さ れ た kDa

.葺

愚

黛

嫡 袖

揚

勢

50 37 20 15 10 `三㈱ 1 ・.』ハ・。鞭 ・鰯 ㈱ ぐ 一 一A細}H 2345 図7各 精 製 段 階 に お け る 組 換 え セ グ ロ イ ソ メTaDHの SDS-PAGE レー ン1分 子 量 マ ー カ ー 、 レー ン2粗 酵 素 液 、 レー ン3ゲ ル 濾 過 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー 活 性 画 分 、 レー ン4ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 活 性 画 分 、 レ ー ン5イ オ ン 交 換 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー 活 性 画 分

表3セ

グロイソメ組換え 血DH完

全精製物 における相対活性

基質

iOOmMTaurine 100mML-Alanine 100mMa-Alanine 100mMGlycine 10m蘭L-Arglni日e 100mML-Lysine 0 1 り 乙 ー コ コ ロ コ 0 0 0 0 0 ︿ 1 一 活 性 は 認 め られ な か っ た

表4エ

ゾア ワビ組換 えTaDH部

分精製物にお ける相対活性

基質

Wildtype

T2Amutant

100mMTaurine 100mML-Alanine 100mMa-Alanine 100mMGlycine 10鵬ML-Arginine 100mM」_一Lysine * 0 つ 0 ﹃ 0 ﹂ 弓 0 5 n U O O 1 * 0 8 ﹂ 弓 ﹂ 碍 n U 4 0 0 0 1 ・1%有 意 差 あ り 一 活 性 は 認 め られ な か っ た

表5ウ

バ ガイ組換 えOcDH部

分精 製物 における相対活性

基質

川109

FMJ39

10mMし 一Arginine 、100 mML一 しysine 100mML-Aianine 100mMQ-Alanine 100mMGIycine 100mMTaurine

goo.0

3.8

goo.0

3.7

一 活性 は認 め られなか った

A.Tricolor 混4/58〃5カ3〃 〃∂ノ 丑0∫ θ80刀 θπ515 P.yessoensis P.maximus S.sachallnensis M.lusoria-1 M.1usaria-2 S.o/licinalis ムF〃18ヨ ∫15 五.0ρ8ノ θ50θ π5 M VVLTIC M一一一一一一一TKHITVLV M一一一一一一一ADKLTVCV M TLKVCV M一一 一一一一一一TVKVCV M一一一SRSLEKSCNITI M一一一一AGFQDKIHVTI M一一 一AGFQDKIHVTI MAHHQEKPPVLINLLV NAHHQEKPPVLIKLLI M-THQEKPPVLVKLLV 事 LAf,IASNQPNMEVRVLTLYADE:4ERAIKSMETNDFTTIKYATGK-TAGLAASRDDIETRVLTTFA塵E睡 装写丁"1閣KENDLRITVDEGDIK MAGLAAAHPGTEARVLTLFQ瞬 脚ANI揺KEεNFTIQQNKPDK一 『TLSGLAAS RI)GVEVRVLTLFA葦 涯螂 卸TKALGADELTVIVNEKDG-LSGLAASRDGVEVRVLTLFA蹴 顧TKALGADELTVIVNEKDG-h'纏LSGLSS DVVNANVTVVDTFQ癩 璽TKAMAANGFTVKYGNGKD- FAGISSLVPNANVIVLDIYEI?&RTESMKTHGFAVKRSDGKI-FAGISSLVPNANVTVLDIYE麟 _{.鐡TES醜KTHGFAVKRSDGKT-LTG} LASSRHNVKVNVLSLFA醗 蛍戯醸黒RNτLGDNHFVV麗FREKD{ト LTGI」ASSRHNVKVNVLSLFA鐡 奪RKTLGDNHFVVNFREKDG一 、吊LTGLASSRHNVKVNVLSLFA購 鍵RNTLADNHSVVNFREKDG一 ホ*承 ‡ ネ 華年*榊 A.Tricolor 混ol/5`〃5〃8〃 刀a/ F.oregonensis P.yessoensis P.勿 ヨ■ノ刀〃3 5.∫8σ カ8ノノπ49π515 〃1ノ 〃50rノ ∂一1 冠.1〃30∫18鵯2 5.oノ ノノ6ノ〃8ノ ノ5 五.yぴ183∫ ∫5 L.opalescens 湖.ノrf`010r 亙4150〃5カ ∂〃刀ヨ1 F.oregonensis P.yessoensis P.忽 ∂■1〃び5 3.3∂`カ ∂1ノ〃θ刀5/5 〃.ノ 〃50∫18-1 M./usnria-2 S.nfficinalis L.vulgaris 五.0ρ ∂ノθ50θ175 一一DPVHLKTKPKLVTKNPEQGATGADIIVITVPAFAHAQYLTALKPHVKPGTVVVGFPGQPGFDFEIMKI SGESVDFKVKLNCITKDPSKAVPGADVIIFTVPAFAHQSYLEAIEPYIQPNTTIVGMPGQPGFEFQVFDV 一一SVVHIKAKPALVTKDASQAVPGANIIIFCVPAFANAQYFKAIEPYVYPNTAIIGLPGQPGFEFQCFDV 一一TQTEVKSRPKVITKDPQVAITGADWILTVPAFAHEGYFQAMIIAPYVQDSALIVGLPSQAGFEFQCRDI 一一TQTEVKSRPKVITゆP琶IAISGADWILTVPAFAHEGYFQ柵YVQDSAHVGLPSQAGFεFQC田)1 一一LVQAPGKPKFTVTKEVQKNVEKADVVILC匪AFLHEWLTSVAPYVPETCPIVGLPGQPGFEYQALFH 一一LHQKPGSVNFSVTKDVKSVVPKSDIVIITVPAYTHETYLNIIAPYLPESCPVVGMPGQPGFEYQALTI 一一LHQKPGSINFSVTKDVKSWPKSDIVIITVPAYTHETYLNIIAPYLPESCPWGMPGQPGFEYQALTI 一一TNKIITSRPNNITNDPSRAVPGCNLVIFTVPAFAHEGYFRAIAPYLEPNTVIVGLPSQPGFQFQCCDL 一一SSQIITSRPNMITNDPSRAVPGCNLIIFTVPAFAHEGYFRAIAPYLEPNTVIVGLPSQPGFQFQCCDL 一一SNKIITSRPNMITNDASKAVPGCNLVIFTVPAFAHEGYFRAIAPYLEPNTVIVGLPSQPGFQFQACDL ##########

灘 灘縫 灘騰lllliiii灘

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表6核

酸(対 角線 上側)お よびア ミノ酸(対 角線下側)配 列相同性

Taxon Air Hdi For PvePmaSsaMlu-iMlu-2Sof Lvu

147αわε1血 師 ωbr(Air) H読o∼ ま54酌 α瓢 加 朋4∫(Hdi) Fusitritonoregonensis(For) Patinopectenyessoensis(Pye) Pεc孟8川 πα 加 με(Pma) 勘 な〃1434`ん α」'πθπ5'5(Ssa) 〃 珍rε∫7此 伽o融 一1(Mlu-1) ルセ ァεか ㍑1耶or如 一2(Mlu-2) 5qp∫4のdπ α海5(Sof) Loligovulgaris(Lvu) LoliQOonalescens(L.a 6 5 7 7 0 0 0 0 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 55 61 49 49 40 40 ⑳ 51 52 52 く ゾ ー 5 10 7 7 7 8 8 1 0 1 4 4 3 3 3 5 5 5 6 6 5 ︽ ゾ く ﹂ く ゾ 5 8 7 !0 0 / 8 8 9 3 3 3 4 4 4 10 7 4 4 = ﹂ ︽ ノ だ﹂ 8 0 0 7 6 9 8 8 3 3 像 ﹂ 4 4 4 4 1 7 9 9 5 5 3 4 4 57 57 38 佃 39 3 5 0 ノ く ゾ 2 1 2 5 2 4 2 /0 只 り 7 ' 周 ー ワ ' 0 ノ ∩ ﹂ ユ ﹂ ︹ ﹂ 3 7 9 5 1 1 8 2 4 2 4 2 6 9 10 6 7 3 弓﹂ 弓 ﹂ 4 8 6 5 4 1 1 2 5 5 5 5 5 5 2 2 0 / 0 0 0 0 ノ 6 5 5 6 5 1 2 2 4 5 5 5 5 5 5 2 2 8 93 Nucleotide

A

ioa 加 加 伽 飼bolb7・α'3DH) p励qρ εc`朗y8∬08窮曲(06DH) P8`島朋 撹四吻3醐(0ωH) ioo 卵 ㎞ 如 』昭o鳩 ε欄 な(0{:DH) ㎜2rε婬 【如思o「血韓]L 86.8 100 1鹿 γρ力脅'碍o磁 ・2 9a.i 胴 血画r4血ご必r加 躍擢置ゴ(TaDH) 81.8 F認 励oπoκ80π ε罰曲(AIDH) o.i 一 5叩 血q茄 ◎動幽(OoDH) 100L o躍go四 ㎏酪(OcDHD 100 ムoμ80ρρ」瓢85`8鳳3(OcDH) Am血 量03cid

B

ぷ4加 翫 師cobrぐraDH) ioo 勘 酌 幽54`ゐ4猷 躍8榔 む(OcDH) 瓢97r8励 加ぼo月1α.1 100 伽rε 力云じ'劇ぽα 血,2 68.9 P励 ρP8c惚πy2∬02犀5酌(OcDH》 iw P8c`2轟 繍 醐(OcDH) 99.2 伍 猷o蝕r曲`囎 ゐ4躍囮 噂σaDH) 87.7 F砿8曲顧o躍 ⑦κ80露2泌(AIDH} o.i 一 3εP並 ゆ`幡(OcDH) iooL o'なoり露⑫α廊(OcDH) 72.8 L滅80ρ ρぬrc8躍3(OcDH)

図9核

酸(A)お

よびアミ ノ酸(B)配

列相同性か ら作成 した系統樹

A B 「「藩 騨 一、 、 耀 .嘱 蘂 . . , 甘 ﹂ . ・㍉ 姻 ザ 〆 分〆 ..一二 饗&.. 1駄 、 べ . 図103プCで 一 週 間 嫌 気 培 養 を 行 っ た シ ャ ー レの 写 真 (A)pTVSsaFMJ39、(B)FM」39 2 A 1 3

1;Octopine

2;L-Arginine

3;Guanidine

1日1搾 目 畢ゐ1婁 日 1ム1日 曇歯 一r噂 朝 B

∫

萎 釜銑 ,1暑1ポ ・1占1日 急 朝 一 〇・毒 図11pTVSsaFMJ39の エ キ ス 成 分 のHPLCク ロ マ ト グ ラ ム (A)標 準 サ ン プ ル 、(B)pTVSsaFMJ39の エ キ ス 成 分

論 文 審 査 結 果 要 旨

オ ピ ン デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼ(OpDHs)は,ア ミ ノ酸 と ピル ビ ン酸 を基 質 と し,NADHを 補 酵 素 と して オ ピ ン類 を 生 合 成 す る酸 化 還 元 酵 素 で あ る。 ア ミ ノ酸 特 異 性 か らオ ク トピ ンデ ヒ ドロゲ ナ ー ゼ (OcDH),ア ラ ノ ピ ンデ ヒ ドロゲ ナ ー ゼ(AIDH),ス トロ ン ビ ンデ ヒ ドロ ゲナ ー ゼ(StDH),タ ウ ロ ピンデ ヒ ドロゲ ナ ー ゼ(TaDH)お よび β一ア ラ ノ ピ ンデ ヒ ドロゲ ナ ー ゼ(β一AlDH)に 分類 され て い る。 OpDHsは これ まで の研 究 に よ り脊 椎 動物 の 乳 酸 デ ヒ ドロゲ ナ ー ゼ(LDH)と 同 義 的 役 割,す な わ ち嫌 気 的 環 境 下 で のエ ネ ル ギ ー 産 生 に 重 要 な役 割 を持 っ て い る と され て お り,嫌 気 環 境 に曝 した後 や 激 し い 運 動 を させ た後 に オ ピ ン量 が 増加 す る とい っ た 間接 的 証 明 は され て い る が,遺 伝 子 操 作 に よ る直 接 的 な 証 拠 は得 られ て い な い 。 ま た,オ ピン デ ヒ ドロゲ ナ ー ゼ は 各 種 無 脊 椎 動 物 に広 く分布 し,一 部 に っ い て は酵 素 化 学 的性 質 も明 らか に され て い るが,ア ミノ酸 配 列 な どの分 子 構 造 に つ い て は ほ とん ど 知 られ て い な い 。 本研 究 で,セ グ ロイ ソ メ,エ ゾア ワ ビ,ホ タテ ガイ,ウ バ ガイ お よびハ マ グ リの オ ピンデ ヒ ドロゲナ ー ゼ の完 全cDNA配 列 解 析 に よ り一 次構 造 で あ る ア ミノ酸 配 列 情 報 を 明 らか に した 。 この 際 設 計 した プ

ライ マ ー の うち,ODH-9Fお よ びODH-11Rは 各 種 無 脊 椎 動 物OpDHsのcDNA増 幅 が 可 能 で,そ れ

で 得 られ る内 部 配 列 の解 析 を足 が か り とす る方 法 は,多 く の種 でOpDHsのcDNA解 析 を可 能 に した 。

す な わ ちODH-9Fお よびODH-11Rは 無 脊 椎 動 物OpDHsのcDNA解 析 研 究 で 汎 用 プ ライ マ ー と して

利 用 で き る と言 え る。 OpDHsは そ れ ぞれ 利 用 す る ア ミ ノ酸 が 異 な る(生 成 す るオ ピ ン の種 類 も異 な る)こ とよ り,cPNA 解 析 だ けで は ア ミノ酸 基 質 特 異 性(OpDHsの 種 類)を 特 定 す る こ とは で き ない 。 そ の た め,解 析 した 配 列 を基 に大 腸 菌 で発 現 させ,実 際 に 酵 素 活 性 を測 定 しOpDHsの 種 類 を特 定 す る必 要 が あ る。 本 研 究 で はい ず れ のOpDHs遺 伝 子 の発 現 も成 功 し,セ グ ロイ ソメ お よび エ ゾア ワ ビの はTaDH, _{.ホ タテ ガ} イ お よび ウバ ガ イ の はOcDHな ど とOpDHsの 種 類 を明 らか に した 。 推 定 ア ミノ酸 配 列 を 多重 ア ライ メ ン トに供 した結 果,全 体 的 に変 異 が 多 い も の の,非 常 に 保 存 性 の 高 い部 分 も散 在 し,そ の 内 の 一 つ は補 酵 素NADHの 結 合 に 関与 して い る共 通 配 列 で あ る こ とが示 唆 さ れ た 。 また,OpDHs遺 伝 情 報 か ら作 成 した系 統 樹 は,こ れ まで の 形 態 学 的 お よび 解 剖 学 的 解 析 に基 づ く系 統 分 類 と一 致 して い た 。OpDHsは 近 縁 関 係 に 応 じて 変 異 の程 度 が大 き く変 化 して お り,OpDHs フ ァ ミ リー のcDNA解 析 は,未 だ 不 明 な点 が 多 い 系 統進 化,と りわ け海 産 軟 体 動 物 間 の科 お よび 属 レ ベ ル で の類 縁 関 係 を明 らか にす るた めに 役 立 つ と考 え られ た 。 ウバ ガ イOpDH遺 伝 子 を 嫌 気 環 境 ・最 少 培 地 で 増 殖 で き な い 大 腸 菌H>lJ39株 に 導 入 した 結 果, FMJ39株 が嫌 気 環 境 ・最 少 培 地 で も増 殖 す る こ とが 確 認 され た 。 この こ とは,OpDHsがLDHと 同 様 に嫌 気 環 境 に お け るNAD+の 供 給 者 と して 機 能 し,機 能 的 にLDH:と 置 き換 え 可 能 で あ る こ とが は じ め て示 され た 。本 研 究 に よ り,OpDHsの 主 な 生 理機 能 は,嫌 気 環境 下 に お け る解 糖 を維 持 す るた め の NAD+供 給 で あ り,嫌 気 環 境 下 で の エ ネ ル ギー 産 生 に 重 要 な 役 割 を 持 って い る こ とが 直接 的 に証 明 さ れ た 。 以 上 の よ うに,本 研 究 は5種 の海 産 無 脊 椎 動 物 にお い て オ ピ ンデ ヒ ドロゲ ナ ー ゼ のcDNA配 列 を 明 らか に し,そ れ らの 大 腸 菌 で の発 現 に成 功 し,そ れ らの相 同性 や 分子 進化 に つ い て 解 析 し,組 換 え大 』 腸 菌 を 用 い て そ の主 た る生 理 機 能 を 明 らか に した も ので,審 査 員 一 同 は 博 士(農 学)の 学 位 を授 与 す るに値 す る と判 定 した。