痙攣発症におけるメタロチオネインの役割とその応用

著者

永沼 章

′

疫撃発症におけるメ-タロチオネインの役割とその応用

(課題番号10557217)

平成1 0年度∼平成1 1年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(2))研究成果報告書

平成12年3月

研究代表者 永 沼  章 (東北大学大学院薬学研究科教授)

は し が き メタロチオネインは構成アミノ酸の約1/3をシステインが占め,しかもS-S結

合を一つも持たないことから,本蛋白質の生理作用として知られる重金属毒性軽

減作用やフリーラジカル除去作用はこれらシステイン残基に由来するものと考え

られている｡しかし,メタロチオネインは人間からカビに至るまでほとんど全て

の生物種に広く存在する蛋白質であり,本来の存在意義は他にあるとの可能性も

否定できない｡

本研究申請者は細胞内メタロチオネインの一部が核内に移行するとの報告があ

ることから,メタロチオネインが遺伝子の発現調節に関与している可能性を考え,

メタロチオネイン遺伝子欠損マウスおよび正常マウスの肝臓から不死化細胞株を

樹立してディファレンシャルディスプレイ法で両細胞間で発現量の異なる遺伝子

の検索を試みた｡その結果,メタロチオネイン遺伝子欠損細胞では発現が認めら

れず,正常細胞でのみ高発現している遺伝子(NM3 1)が存在することを明ら

かにした｡ NM31はペンチレンテトラゾ-ルによって誘発される塵撃(けいれ ん)発症に関与する遺伝子として同定･報告されているPTZ-1 7と同一であり,

ヒトやラットおよびマウスの脳で特異的に高い発現が認められる｡痘撃発症時に

はカルシウムの神経細胞内への流入が起こるが, PTZ-1 7はペンチレンテトラ ゾ-ルによりその発現が顕著に誘導され,また, PTZ-1 7の発現がカルシウム

の流入を促進することからPTZ-1 7は痘撃発症の鍵となる遺伝子の一つと考え

られる｡したがって, PTZ-1 7遺伝子の発現に必須な蛋白質であるメタロチオ

ネインは痘撃の発症を調節する重要な細胞内因子である可能性が高い0

メタロチオネインには4種類(メタロチオネイン1-4)の分子種が知られて おり,脳中に主に存在する分子種はメタロチオネイン-3である｡したがって,脂 中でのPTZ-1 7の発現にはこのメタロチオネインー3が関与している可能性が考 ー1

-′

えら叫るo脳や皐丸以外の組織中での主要分子種はメタロチオネインー1および-2

であるが,本研究申請者らがPTZ-1 7遺伝子の検索に用いたメタロチオネイン 遺伝子欠損マウスはメタロチオネインー1および-2を共に欠損したものであり,肝

臓などの組織ではPTZ-1 7遺伝子の発現が認められないが,脳中ではメタロチ

オネインー3遺伝子およびPTZ-1 7遺伝子が共に正常に発現している｡そこで本

研究では,メタロチオネインー3およびその他の各分子種がNM3 1の発現に果た

す役割を検討する共に,メタロチオネインの発現量の違いがペンチレンテトラゾ-ルの細胞毒性に及ぼす影響などについても検討を加えた｡

研 究 組 織

研究代表者:永沼 章(東北大学大学院薬学研究科･教授)

研究分担者:宮入伸一(東北大学大学院薬学研究科･助教授)

研究分担者:三浦伸彦(東北大学大学院薬学研究科･助手)

研究分担者:西山省二(明治製菓(秩)薬品稔合研究所主席研究員)

研 究 経 費 平成1 0年度 平成1 1年度 円円 千千 0 0 0 0 8 1 '       ' 6 6 計     12, 900千円 研 究 発 表

(1)学会誌等

1. Miura, N., Satoh, M., Imura, N. and Naganuma, A.,恥tective effect of bismuth

mitrah5 against lqury tOthe bone marrow by g-irradiation inmice: possible iilVOIvement

of induction of metallothioneinsynthesis･ J･ Phamacol･ Exp･ Ther･, 286, 1427-1430

(1998).

2･ Miyairi, S･, Shibata, S･and Naganuma, A･, Detemination of metallothionein by

high-performance liquid chromatography withnuorescence detection using an is∝ratic

solvent system. Anal. Biochem･, 258, 168-175 (1998)･

3. Hanada, K., Sawamura, D., Tamai, K., Baba, T., Hashimoto, I., Muramatsu, T･, Miura, N.and Naganuma, A., Novel function of metallothionein in photoprotection:

rrctallothionein-null mouse exhibits托duced tolerance against ultraviolet-B injury inthe

skin. J. Invest. Damato1., 1 I 1, 582-585 (1998).

4. Okazaki, Y., Miura, N., Satoh, M., Imura, N. and Naganuma, A･,

Metallothionein-mediated resistance to multiple drugs canbe induced by several

-3-′

amiCancer drugs inmice･ Bi∝hem. Biophys. Res. Commun., 245, 815-818 (1998).

5･ Nakagawa, I･, Suzuki, M･, Imura, N･ aJld Naganuma, A., hvolvement of oxidative

stress in paraquat-induced mBtallothionein synthesis under glutathione depletion･ Free

Radic. Biol. Med., 24, 1390-1395 (1998).

6･ Hana丸K･, Sawamura, D･, Hashimoto, Ⅰ･,Kida, K.and Naganuma, A., Epidermal proliferation of the skin in metallothionein-nullmice. J. Invest. Darmato1., 110, 259-262 ( 1998).

7･-,Asahi, Ⅰ･, Miura･ N･, Yamabe, Y･, Toyoda, H･, Imura, N･, Koyama, M･ aJld

Nagamma･ A･･ PFIO70A, a novel and potent inducer of the synthesis of

metallothionein･ Biochemistry, 38, 104 I 5- 10423 ( 1999).

8･ Yasun0, T., Matsumura, T., Shikata, T., Inazawa, J., Sakabe, T., Tsuchida, S., Takahata, T･, Miyairi, S., Naganuma, A.and Sawada, T., Establishment and

ch∬acteri23don of cispladn-resistant humanneuroblastoma cell line. A血Cancer Res.,

19, 4049-4057 (1999).

9･ Toyoda, H., Mizushima, T., Satoh, M., Iizuka, N., Nomoto, A., Chiba, H., Mita, M., Naganuma, A., Himeno, S.and lmura, N., HeLa cell transformants

overproducing mouse mBtallothionein show in vivo resistance to cis-platinum in nude

mice. Jpn. J. Cancer Res., 91, 91-98 (2(X氾).

(2)絵説等

I.永沼 章 金属結合蛋白質メタロチオネインの役割一遺伝子ノックアウトマ

ウスの知見から バイオメタル一生体調節の多彩な役割と病態-,山口正義

編,黒船出版,静岡153-170 1998.

2･ Hanada, K., Sawamura, D., Tamai, K., Baba, T., Hashimoto, I., Muramatsu, T.,

Miura, N. and Naganuma, A. Metallothionein-null mouse exhibits reduced tolemnce agalnSt ultraviolet-B injury inthe skin MolecularMedicine: Novel Findings of Gene

Diagnosis, Regulation of Gene Expression, and Gene TTlerapy, Eds･ by Hashimoto, I･

etal., EIsevierScienccPubl. B V,Amsterdam137-144 1999.

3. Miyairi, S. and Naganuma, A. Metallothionein detemlination by is∝ratic HPLCwith 瓜uorescence derivatization て)xi血ive Stress Biomarkers andAntioxidant Protocols, Ed･ by Armstrong, D･, Human Press Inc･, Totowa, U･ S･ A･inpress 2000･

(3)口頭発表 1.三浦伸彦,永沼 章:メタロチオネインノックアウトマウスから樹立した不

死化細胞を用いたメタロチオネインの生理機能の検討.日本生化学会東北支

部会第65回例会, 1998. 2.永沼 章:メタロチオネインはどこまでわかったか.第71回日本生化学会大 会シンポジウム, 1998. 3.三浦伸彦,浦野 勉,長井和佳子,永沼 章:メタロチオネインによるNM31 遺伝子の発現制御.第71回日本生化学会大会シンポジウム, 1998. 4.永沼 章:薬毒物の毒性から生体を防御する蛋白質メタロチオネイン.第18 回日本中毒学会西日本部会, 1998.

5.長井和佳子,三浦伸彦,永沼 章:メタロチオネイン遺伝子の欠損がシスプラ

チンの細胞毒性に与える影響.第71回日本生化学会大会シンポジウム,

1998. 6.三浦伸彦,西山省二,永沼 章:ベツリンによるメタロチオネイン非依存的な カドミウム毒性の軽減作用.メタロチオネイン99, 1999. 7.長井和佳子,三浦伸彦,永沼 章:低グルタチオン条件下におけるカドミウム

およびシスプラチンの細胞毒性に村するメタロチオネインの防御効果.日本

薬学会第119年会, 1999. 8.北 加代子,三浦伸彦,山崎健太郎,吉田 稔,永沼 章:ヒトのメタロチオ ネイン遺伝子異常の検索.メタロチオネイン99, 1999.

-5-′ 9.永沼 章:金属ストレスとその応答:メタロチオネインの合成誘導とその意 義.第25回環境トキシコロジーシンポジウム, 1999. 10.三浦伸彦,永沼 章:カ'TIhミウムによる熟ショック蛋白質の誘導に対するメ タロチオネインの影響.メタロチオネイン99, 1999. ll.柳沼 宏,三浦伸彦,有馬八重野,花田勝美,永沼 章:ヒノキチオールと亜 鉛による相乗的なメタロチオネインの誘導.メタロチオネイン99, 1999. 12･.永沼 章:重金属及び薬物毒性とメタロチオネイン.第34回日本アルコール･ 薬物医学会稔会, 1999. 13.三浦伸彦,千菊浩明,宮入伸一,内海英雄,永沼 章: γ-GTP高発現細胞

株の樹立とそれを用いた化学物質の腎毒性評価法の確立.日本薬学会第119

年会, 1999. 14.永沼 章:新しいメタロチオネイン研究の流れ.メタロチオネイン99, 1999. 15.北 加代子,三浦伸彦,山崎健太郎,吉田 稔,永沼 章:ヒト腎皮質におけ

るメタロチオネイン遺伝子の翻訳領域及びプロモーター領域の塩基配列異常.

日本薬学会第120年会, 2000. 16.三浦伸彦,磯 輝行,永沼 章:メタロチオネイン欠損細胞におけるカドミウ ムによる熟ショック蛋白質の誘導合成.日本薬学会第120年会, 2000. 17.村山殊樹,加藤芳徳,宮入伸一,三浦伸彦,永沼 章:大腸菌を用いたマウス

メタロチオネイン分子種のGST融合蛋白質としての発現系の開発.日本薬学

会第120年会, 2000.

研究成果

ー7-′

痩華関連遺伝子の発現におけるメタロチオネインの役割

メタロチオネインは1957年jこウマの腎臓から単離された分子量約6,000の金属 結合蛋白質であり､構成アミノ酸の1/3をシステイン残基が占め､しかもS-S結合

を一つも持たないという非常に特徴的な構造を有している1)｡本蛋白質は生物種間

でよく保存されており､カビなどの真菌類からヒトをはじめとした晴乳類にまで

その発現が認められる｡メタロチオネインの生理作用と一しては､その分子中に豊

富に存在するSH基を介した重金属の毒性軽減作用やフリーラジカル除去作用がよ

く知られており､従って各種重金属や酸化ストレス誘串物質に対する重要な生体

防御因子として機能しているものと考えられている｡

ところで最近になって､メタロチオネインの一部が核内に移行するとの報告が

なされた2)｡そこで本研究申請者はメタロチオネインの新しい生理作用として他の

遺伝子の発現制御を行なっている可能性を考え､メタロチオネイン遺伝子欠損マ

ウス3)及び対照の正常マウスの肝臓から不死化細胞株を樹立し､両細胞間で発現量

■

の異なる遺伝子の検索をディファレンシャルディスプレイ法を用いて行なった｡

その結果､メタロチオネイン遺伝子欠損マウスでは発現が認められず､正常マウ

ス由来の細胞でのみ発現している遺伝子(NM31)が存在することを兄いだした｡メ

タロチオネイン遺伝子欠損細胞にメタロチオネイン遺伝子を再導入するとNM31

の発現が認められるようになることからも､本遺伝子の発現にメタロチオネイン

が関わっている可能性が高いものと思われる｡ところでNM31は､ペンチレンテ トラゾ-ル(PTZ)によって誘発される塵撃発症に関与する遺伝子として同定･報告 されているPTZ-174)と同一であり､ヒトやラットおよびマウスの脳で高い発現が 認められる｡ FI芝-17は､ FTZを投与したマウスの脳で発現量が顕著に減少する遺

伝子であり､神経細胞の初代培養系でも同様の現象が認められることが報告され

ている.痘撃発症時にはカルシウムの神経細胞内への流入が起こるが､ PTZ-17の 発現がカルシウムの流入を促進する5)ことから､ FrZ-17は痘撃発症の鍵となる遺 伝子の一つと考えられている.そこで本研究では､ rTrZなどの薬物によって誘発

される塵撃発症におけるメタロチオネインの役割と意義を明らかにし､またNM31

の発現におけるメタロチオネインの関与を検討した｡

【材料及び方法】

<細胞>

･ MT(+) : 01a129/Svマウスの肝臓から単離し､ SV40ウイルスの感染によりsv40 ウイルスlargeT抗原を導入して不死化した細胞｡ MT(-)細胞の対照細胞として用い た｡ ･MT(-) :メタロチオネイン遺伝子欠損マウスの肝臓から単離し､ MT(+)細胞と同 様の方法で不死化した細胞｡ ･ MT(-)n&Ⅱ : MT(-)細胞にMT-I及び-II遺伝子を再導入した細胞｡以下に作製方 法を概略した｡      ∨ ･ MT(-)A : MT(-)細胞にhqr-Ⅰ遺伝子のみを導入し､ MT-Ⅰ蛋白質のみを発現させた

細胞｡以下に作製方法を概略した｡

･ Mr(-)皿: MT(-)細胞にMT-Ⅱ遺伝子のみを導入し､ MT-Ⅱ蛋白質のみを発現させ

た細胞｡以下に作製方法を概略した｡

･ MT(-)皿Ⅰ : Mr(-)細胞にMT-Ⅲ翻訳領域を導入し､ MT-Ⅲ蛋白質を発現させた細

胞｡本蛋白質の発現にはサイトメガロウイルスプロモーターを用いた｡以下に作

製方法を概略した｡ <MT-Ⅰ&Ⅱ発現プラスミドの構築>

-9-′ マウスMT-ⅠおよびⅢ遺伝子を含む約10kbのインサートを持つプラスミド (pKH6),Fig.5)はワシントン大学のPalmiter博士から供与された.このプラスミド からマウスMr-ⅠおよびII遺伝子断片を単離し､ハイグロマイシンB耐性を与える ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子をセレクションマーカーと して持つ発現ベクター(pcDNA3.1爪ygroα, Fig. 6)に組み込むことを計画した｡な お､この発現ベクターはhvitrogen社から購入したが､マルチクローニングサイト の上流にサイトメガロウイルスプロモーターを有している.･今回､ Mrプロモーター

の支配下に発現するMTの機能を調べることを目的としており､挿入する遺伝子に

はMTプロモーター領域が含まれている.そこで､こq)発現ベクターをNruⅠおよ

びNheIで処理し､平滑末端化して連結することによりcMVプロモーター領域を

除去したベクター(pcDNA3.1爪ygrn)をまず作製した.次にpKHのKpnIおよび

EcoRVによる部分切断で生じた10kbの断片をアガロースゲル電気泳動により単

離し､ GENECu三ANⅢm(BIOIOl)により精製してマウスMr-Ⅰおよび-Ⅱを含む 遺伝子断片を得た.得られた遺伝子断片を挿入するために､ pcDNA3.1佃ygrwベ ヾ クターをKpnIとEcoRVで切断後､アガロースゲルから単離精製して両者をDNA LigadonKitVer.2(TAKARA)を用いて連結した.そのライゲ-ション溶液を､引き 続き大腸菌へ導入した.大腸菌への導入はHanahanらの方法7)に従って行った.コ ンビテントセル(ⅩLI blue)溶液(200pl)に上述のライゲ-ション溶液(10Lll)を加 え､氷上で30分間静置した後､ 42℃で45秒間の熟ショックを与え､さらに氷上

で2分間静置した｡これにSOC培地(2% bacto-tryptone, 0.5% bact&yeast extract,

0.05% NaCl, 20mMM$12,

20mMglucose)0.8miを加え42oCで1時間インキュベ-トした後､アンピシリン50pg/miを含むLB寒天培地(1%bacto-tryptone,0.5%

bacto-yeastextract, 1% NaCl, 7% agar)に塗布し､ 37oCで一晩培養した｡形成された

bacto-yeast extract, 1% NaCl)にて一晩振塗培養した後､ wizard Mimipreps DNA

PurificadonSystemを用いて大腸菌よりプラスミドを単離した. pcDNA3.1乃Iygrca

ベクターへのMr遺伝子の挿与を確認するために､前述の制限酵素で切断し､確実

に遺伝子断片を持つプラスミドを得た｡得られたプラスミドを持つ大腸菌を大量

培養し(100mi)､ QmGENPlasmid Mhxikit(QIAGEN)によりMT-Ⅰ&Ⅱ発現プラスミ

ドを精製した｡ < MT-Ⅰ発現プラスミド及びMT-Ⅱ発現プラスミドの構築> MT-Ⅰ遺伝子のみを含む断片は､ pKHのHind Ⅲによる完全切断で生じた5.4kb 断片として単離した.peDNA3.I/HygrnベクターをHindⅢで消化後､アガロース ゲルから単離精製し､ライゲ-ション反応を行った｡また､ MT-Ⅱ遺伝子のみを含 む断片はpKHからNdeIで切り出し､生じた3.8kb断片の両端をDNABluntingKit (TAKARA)を用いて平滑末端にした.peDNA3.1nlygr叱ベクターをboR Vで切断 して平滑末端とし､上記のLigadonkitを用いてMT-Ⅱ遺伝子断片とライゲ-ション ヅ

を行った｡これらをそれぞれ大腸菌に導入し､上述の方法で挿入断片の確認及び

各々の発現プラスミドの精製を行った｡

< MT-ⅡⅠ発現プラスミドの構築> マウスMT-Ⅲの発現には､上述のpeDNA3.1/Hygro(hvitrogen)ベクターのサイト メガロウイルスプロモーターの下流にMT-Ⅲ翻訳領域を挿入することにより行っ た｡まず､マウスMT-ⅡⅠ翻訳領域をpcR法により増幅した｡即ち､ αa129/Svマ ウスの大脳からISOGENを用いてtotalRNAを抽出し､ 0.5miチューブに3.Opg

totalRNA､ 0.5 pg/plOligodT primer(I.0 Ill)およびイオン交換水を入れて全量を12

plとし､ 70oC 10分間の熟変性後､氷上で急冷した.次に､ 5x lststrandBuffer(4.0

-pl),0･1叫mT (2.Olll)および10mMdNTP(1.Opt)を添加して37℃ 5分間保温後､

200mit/miMMLV(Mouse MoloneyLeukemiaViruS)逆転写酵素(1.0 Lil)を加え､タッ

ビングで軽く混和して､ 37oCで1時間逆転写反応を行った｡これを70℃15分間

処理して酵素を失括させた後､氷上で急冷した｡さらに混入しているRNAを切断

するために､ 3.8midmiRNaseH(0.26pl)を加えて､ 37oC20分間反応した.次に､

PCR用の0･5miチューブに､得られたcDNA(0.5pl)､ 10xPCR buffer(2pl)､ 2mM

dNTP (2 pl)､ loo pM MT-Ⅲ forward pri-r (0･2 pl)､ loo pM･MT-Ⅲ reverse primer (0.2

pl)およびTaqGOLD(0.2 pl;Perkin Elmer)を加えて全量が20111になるようにイオ

ン交換水で調製し､ 95℃で10分間の加熱後､ 95℃15秒､ 60℃30秒､ 72℃45秒

の増幅反応を30サイクル行うことによりpcR産物を得た｡これを､ 2%アガロー スゲルで泳動し､ PCR産物の増幅を確認した｡なお､用いたプライマーの配列を 以下に記した｡

MT-ⅡI forward primer : 5--ATGGACCCTGAGACCTGCCCCTG-3'

■

MT-Ⅱl reverse pnmer : 5

I-TCACrGGCAGCAGCTGCAmCrCGGCCTCTGCCTTG-GCCCCCTC-3 ■ 次に､ PCR産物をpGEM-Teasyベクター(Promega)にTAクローニング法により 挿入した.即ち､増幅したpcR産物(2pl)､ 50ngのpGEM-Teasy(1 pl)及びDNA hgadonkit(TAKARA)添付のSolutionI(3 pl)を混合し､ 16oCで一晩インキュベ-ト

した.この溶液を上述の方法でⅩLlに導入し､生えてきたコロニーをLB堵地で

培養してプラスミドを単離した｡得られたプラスミドをEcoRIで消化することに より挿入断片の確認を行い､ PCR断片の挿入が確認されたプラスミドについてシー

クエンスを行い塩基配列の確認を行った｡正しい塩基配列を持つプラスミドを選

び､次にpeDNA3.1/Hygroベクターへのサブクローニングを行った｡即ち､プラス

ミドをEcoRIで消化して2%アガロースゲル電気泳動を行い､挿入断片を上述の

方法で単離精製した.同様にpcDNA3.1/HygroベクターをEcoRIで消化し､ calf intesdne dkaline phosohatase (Boehringer)による脱リン酸化処理を行った後､ o･8%ア

ガロースゲルで単離精製した.このベクター50ngと5倍モルのMT-Ⅲ断片をラ イゲ-ションした後ⅩLlに導入し､生えてきたコロニーを培養してプラスミドを 単離し､ ･MT-Ⅲ断片の挿入をboRI処理により確認した. MT-Ⅲ断片が挿入され たプラスミドを持つ大腸菌を培養後､上述のようにQIAGEN精製を行った｡ <各発現プラスミドのMT(-)細胞へのトランスフェクション(Fig.7)> まず､ 100plのFCS-thee D'MEMに4plのTransITrrM-LTl試薬を滴下して軽く撹 拝した後､室温で5分間以上放置し､さらに211gの各精製プラスミドを加え､室 温で再び5分間以上放置してTransrrTM-LTl試薬とプラスミドの複合体を形成させ た｡ 6穴プレートで50-70%コンフルエントの状態のMT(-)細胞を､トランスフェ クション直前にPBS(-)で一度洗った後､ FCS-fteeD-ME姐に交換した.このプレー

トを軽く揺すりながら複合体溶液を滴下した後4時間培養し､その後､ FCSを含

むD･MEM培地に交換して一晩培養した｡この細胞をl/10,9/10の割合で55 cm2プ レートに播き直し､一晩培養した後にハイグロマイシンBを175pghlになるよう に添加して､ 1-2週間後に生き残って増えてくる細胞を､メタロチオネイン遺伝 子導入細胞とした.なお､これらの細胞のコントロールとしてpeDNA3.1/Hygroα またはpcDNA3.1nlygroベクターのみを導入した細胞も同時に作製したo

<メタロチオネイン遺伝子導入細胞の確認>

得られた各細胞を55cm2シャーレに50-70%コンフルエントになるように培養 -

13-′

後､ PBS(-)で一度洗い､ ISOGEN lmiを加えてtotalRNAを抽出した.上述の方法

で逆転写反応を行い､ PCRにより遺伝子導入の確認を行った｡即ち､ pcR用の0.5

miチューブに､得られた逆転写産物(0.5 pl)､ 10xPCRbuffer(2pl)､ 2mMdNTP(2

pl)･ 100pMforward primer (0･2 pl)､ 100 PM reverse primer(0.2 pl)およびTaqGOID

(0･2pl;PerkinElmer)を加えて全量が20plになるようにイオン交換水で調製し､ 95℃で10分間の加熱後､ MT-Ⅰあるいは-Ⅱについては95℃15秒､ 53℃30秒､ 72℃30秒の増幅反応を35サイクル､ MT一Ⅲについては上述と同様のサイクルを 行い､その産物を10%ポリアクリルアミドゲルで泳動し､導入したMr遺伝子が 細胞の染色体上に組み込まれていることを確認したoなお､ hqr-I及び-Ⅱの増幅に

用いたプライマーの配列を以下に記した｡

Mr 344 primer : 5.-CACGACTrCAACGTCC-3' Mr 408 primer : 5.-CAGCAGGAGCAGCAGCTCTTCTrGCAG13. hqr 409 primer : 5.-GTCCCrAGAACTATTCAJuC-3. 344と408の組み合わせにより178bpのMTJcDNAのみが､また408と409の組 ■ み合わせにより169bpのMT-ⅡcDNAのみが増幅される3). <ノーザンブロッテイング> 2xlO6個の細胞を55cm2ディッシュに播いて一晩培養後､培地を捨て､ 10miの PBS(-)で細胞を洗浄した後lmlのISOGEN (ニッポンジーン社製)を添加した｡

室温で5分間放置して細胞を溶解させ､その溶液を1.5mlチューブに移した｡な

お､臓器からの抽出には､臓器約50mgを15mlチューブに秤量後lmlのISOGEN を加え､ホモジナイザ-を用いて氷上で1分間ホモジナイズした後にホモジネ-トを1･5miチューブに移した.次に､ 1.5miチューブにクロロホルム200plを加 えて激しく撹拝(20秒間)し､室温で5分間放置した後､遠心(15,000rpm,15分

問)して､水層(0.5ml)を新しい1.5mlチューブに移した｡ここに同量のイソプ

ロパノールを加えて混和後､室温で10分間放置した｡これを再び遠心(15,000

rpm,10分間)し､沈殿したto,talRNA画分を得た｡この沈殿を75%のエタノール

溶液で洗浄し､乾燥後TE緩衝液(10mMTrisll mMEDTA)に溶解した. totalRNA の収量は､ 260nmにおける吸光度を基に算出した｡ totalRNA(20pg)にサンプルバッ

ファー(6.4%ホルムアルデヒド､ 48%ホルムアミド､ 6.7%グリセリン､ 5.3%プロ

ムフェノールブルーを含むl XMOPS (20mM MOPS, 5血Msodiumu acetate,0.5 mM

EDTA)バッファー)を加えて65℃で15分間加熱変性させた後､泳動バッファー

としてlxMOPSバッファーを用い､ホルムアルデヒド(2.2M)を含む0.8%アガロー

スゲル電気泳動(100V,3.5時間)を行なった｡泳動終了後､ 10xSSC(1.5M

NaCl, 150mMs誠umcitrate)を用いてゲルからRNAをNytran-N (S&S社製)にトラ

ンスファーした｡一晩トランスファー後､メンブランを2xSSCで2回洗浄し､そ の後乾燥してtJV照射によりRNAをNytran-Nにクロスリンクして固定した. <ハイブリダイゼ-ション> DNAプローブのラベルはBcaBESTDIGL血lingKit仰瓜A社製)を用いて行 なった｡即ち､ DNAプローブ(long- lps)とrandomprimer(6mer)､精製水を混合 して15plとし､熟変性(95oC,3分間)した後氷水中で急冷した.そこに2Lllの

lox Buffer, 2 plのDIG DNAI･血1ingMix,及び叫1のBcaBEST DNAPolymeraseを 加えて50oCで30分以上反応させた｡ 2plのStopSolutionを加えて反応を停止した 後､ ControIDNAを用いて定量を行なった. ハイブリダイゼ-ション､および検出はベ-リンガ-マンハイム社のジゴキシ ゲニン(DIG)を用いた方法に従った｡即ち､ポリエチレンバッグに入れたメンブラ ンを高sDS濃度バッファー(7%SDS,50%ホルムアミド,5xSSC,2%プロツキン -

15-′ グ試薬,50mMリン酸ナトリウム(pH7.0),0.1%N-ラウロイルサルコシンナトリウ ム)中で1時間以上プレハイプリダイズし､その後熟変性(95℃,15分間)させた DIG-DNAプローブを含む(25Jng/mi)高sDS濃度バッファーに交換して一晩ハイブ リダイゼ-ションを行なった.メンブランをprimarywashingbuffer(2xSSC, 0.1% SDS)で室温で5分間､ 2回洗浄した後､ stringencywashing buffer(0.I x SSC, 0.1% SDS)で68℃で15分間､ 2回洗浄した｡メンブランをBufferl(0.15MNacl,0.1 M mieicacid(pH 7.5))で平衡化した後ポリエチレンバッグに入れ､ Buffer2 (ブロッ キング試薬をBufferlで10倍希釈)で室温で30分以上インキュベ-トしたo次に､ 20,000倍希釈したanti-DIG抗体を含むBuffer2に交換し､室温で更に30分間イン キュベ-トした.抗体溶液を捨て､メンブランをBuffer3(0.I MTriS-HCl(pH 9.5), 0･l MNaCl)で平衡化した後､ 50倍希釈した基質(CDP-Star)を含むBuffer3をメン ブラン上に均一に滴下し､メンブランをポリエチレンバッグにシールしてⅩ線フイ ルムに露光した｡ <MT蛋白質の定量8)> 細胞を､ 6穴プレートに1穴あたり3xlO5個播き24時間培養後､各濃度の塩化

亜鉛(国産化学)または塩化カドミウム(和光純薬) ､あるいはその溶媒である

イオン交換水を添加し､さらに24時間培養した｡細胞をpBS(-)で洗浄した後､セ ルスクレイパーを用いて剥がし､ I,500rpm,5分間遠心して細胞を沈殿として集め た.ここに内部標準物質としてN-propinylcysteaminedimerを含む0.15M KCl溶液 (500pl)を加えて､細胞をソニケ一夕-を用いて氷上で超音波破砕した後に､沸騰 水洛中で加熱(5分間)し､これを遠心(3,000rpm,10分間)して上清を得た｡こ の加熱上清(150pl)にIMホウ酸緩衝液(350pl), 20%TBP(10pl; tri-n-buthylphosphine,ナ カ ラ イ)お よ び 0.5% SBD-F (40 pl ;

aJrLrrmOmium-7-fuluor0-2-benz-1,3-oxadia101el41Sulfate,同仁化学)を加えて､ 50oCで

30分間加温L MrをsBD誘導体化した後､ 4N塩酸(50pl)を加えて誘導体化反応 を停止したoこれを遠心(2,8,00rpm, 10分間)後､その上清をイオン交換水で10

倍希釈して蛍光検出HPLC法にてMr濃度を測定したo即ち､ HPLCシステムとし

てシステムコントローラー(SCL-10A)(S…ZU)､オートサンプラ- (SCL-10AxL)

(SMZU)､マルチポンプ(LC-10AD) (Sm仏DZU) ､蛍光検出器(RF-10AxL) (SIMADZU)を用い､ ShodexRSpakRP18413 (昭和電工)一とpuresilC18 (ウオーター

ズ)を連結して分離を行った.移動層には20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5): アセトニトリル:メタノール=80:18:2を用い､流速0.7 mUminで励起波長384mm､ 検出波長510nmにおける蛍光強度を測定した｡なお､ MTのスタンダードとして rabbitMetallothionein-Ⅱ (Sigma)を用いた｡細胞内Mr濃度は､蛋白質1 mg当りの量 として表わし､蛋白質の定量はBradford試薬(BioRad)を用いた色素結合法により 行った｡

<細胞毒性測定法>

96穴プレートに対象となる細胞を1穴あたりlxlO4個J90plの濃度になるよう播

き､ 24時間培養後､各濃度の各薬物溶液10plを添加して､さらに24時間培養し

た｡細胞生存率は培地にAlawBlue溶液10plを加え､ 5%CO2存在下37℃で2 時間培養した後に､蛍光プレートリーダーを用いて測定した(励起波長544nm,検 出波長590 mm)0 <pTZによる痘撃発症試験> 12- 16週齢の雄のMT遺伝子欠損マウス(MT-null)及びその対照マウス(Ola 129/Sv)に30mg此g,75 mg此g及び100mgnCgのPTZ (ナカライ)を腹腔内投与した.

ー17-なお､ _PTZは生理食塩水に溶解し､ 0･2mu20g体重の割合で投与を行った.また

コントロール群は生理食塩水のみを腹腔内投与した｡マウスに薬物を投与すると

同時にタイマーをスタートし､ノ間代性痘撃あるいは強直性塵撃が認められる最初

の時間を記録した｡

<pTZによる細胞傷害性試験> 96穴プレートに対象となる細胞を1穴あたりlx104個βopl培地(D-MEM)の濃 度になるよう播き､ 24時間培養後､各濃度のPTZ溶液10plを添加して､さらに

24時間培養した.なお､ PTZは滅菌精製水に溶解し､また滅菌精製水のみを添加

した群をコントロール群とした｡ PTZ添加24時間後に培地を捨て､新たに培地で 10倍希釈したAlamarBluePalgene)溶液100plを添加し､ 5%CO2存在下37oCで2 時間培養した後に､蛍光プレートリーダーを用いて測定した(励起波長544nm,検 出波長5901m)｡なお､AlaIWBlueはミトコンドリアの呼吸鎖系により代謝(酸化)

されて蛍光強度を増す試薬であり､細胞の酸化還元系を利用したMrr法と同様の

V 原理の細胞増殖測定試薬である｡ <塩化亜鉛またはpTZによるNM31 mRNAへの影響> MT(+)及びMT(-)細胞を6穴プレートに2Ⅹ 105個播いて24時間培養後､精製水 に溶解した塩化亜鉛を培地に添加した｡亜鉛添加3,6, 12そして24時間後に細胞 からtotalRNAを抽出し､ 1レーンあたりその20pgのRNAをのせてノーザンプロッ ト法によりNM31mRNAの発現量を調べた｡また､ PTZによるNM31mRNAへの

影響はMT(+)細胞を用いて調べた｡即ち同様の方法でMT(+)細胞を播き､精製水

に溶解したPTZ (最終濃度5, 10,25, 50mM)を添加して30分後および60分後に totalRNAを抽出した.なお､プローブとしてはNM31wholeを用いた｡

<マウス組織内NM31 mRNA発現量> 10-12週令の雄の129/Svマウス及びMT-ndlマウスをエーテル麻酔し､開腹し

て門脈から約5mlの生理食塩水を入れ､肝臓を藩流した｡放血後､肝臓､大脳及

び小脳を摘出し液体窒素に漬けて急速凍結し､超低温槽で保存したo totalRNAの 抽出には約50mgの組織を秤量して用いた.

【結果及び考察】

メタロチオネイン遺伝子欠損マウス及び対照の正常マウスの肝臓から樹立した

不死化細胞株(MT(-)及びMT(+), Fig. 1)を用い､両細胞間で発現量の異なる遺伝子 の検索をディファレンシャルディスプレイ(DD)法により行なったところ､ MT(-) 細胞では発現が認められず､ MT(+)細胞でのみ発現している遺伝子(NM31)が存在 することを兄いだした(Fig.2)｡そこでこのバンドをゲルから切り出し､ Ⅰ》法に用 いたプライマーの組み合わせでPCRによりこのバンドを再増幅したのち､クロー

ニングベクターに組み込んでシークエンスを行なった｡}その結果､本遺伝子の塩

基醍列(288base)はペンチレンテトラゾ-ルによって誘発される疫撃発症に関与す る遺伝子として同定･報告されているPTZ-17の3■末の塩基配列と完全に-敦した (Fig.3).そこでPCRにより増幅した産物をプローブ(DDprobe)として､両親晦に おけるこの遺伝子(NM31)の発現をノーザンプロット法により調べたところ､ DD 法の結果と同様にMT(-)細胞での発現はほとんど認められず､またpTZ-17の cDNA配列をもとに､上記のPCR増幅領域を含まない領域(wholeprobe)､あるい はpTZ-17の翻訳領域(oRFprobe)を用いて同様にノーザンプロット法により

NM31の発現を調べたところ､これらのプローブを用いた場合でも本遺伝子の発現

はMT(+)細胞でのみ認められることが判明した(Fig.4)｡従ってNM31はpTZ-17

ー19-′

と同一であると考えられ､ Mr蛋白質の欠損した細胞では本遺伝子の発現が消失す ることが判明した｡

次に､ NM31の発現におけ阜MTの関与を調べるために､ MT(-)細胞にMT-Ⅰ,II

遺伝子を導入して両蛋白質を再発現する細胞を樹立し､その細胞におけるNM31

の発現を調べてみたo先ず､ MT-I,Ⅱ遺伝子(Fig. 5)をpeDNA3.1爪ygrcaベクター

(Fig.6)に組み込み､ Fig.7に示した方法でMT(-)細胞に導入して､本遺伝子を安

定に発現する細胞をハイグロマイシンにより選択した｡得られた細胞に目的の遺

伝子が挿入されていることの確認は､ RT-PCR法で行なった｡ MT-Ⅰ,Ⅱ欠損細胞は MT-Ⅰ及び-II遺伝子部分にそれぞれストップコドンを含む余分な配列が挿入されて

おり､そのために両Mr蛋白質が発現しない.従って､この領域を増幅すると本来

の遺伝子よりも大きなpCR産物が生じる｡そこで､ RT-PCR法を用いてそれぞれ

の細胞のMT遺伝子を増幅し､ PCR産物の大きさを調べることにより､目的の遺

伝子が細胞に導入されたかどうかを確認したoその結果､ Fig.8に示すように両遺 伝子を導入した細胞では､ MT-Ⅰ及び-II遺伝子産物はともにMT(-)細胞のものよ ヅ りも小さく､正常細胞であるMT(+)細胞と同一の大きさであったことから､両遺 伝子が安定に導入されたものと考えられ､この細胞をMT(-)n&Ⅱ細胞とした.また 空ベクターを導入した細胞をhqr(-)rV細胞と呼ぶことにした.次にMT(-)n&II細胞

におけるMr蛋白質の合成を確認するために､強力なMT誘導剤である塩化亜鉛を

細胞の培地に添加した後､細胞内Mr蛋白質濃度をHPLC法で測定した｡その結

果､ MT(-)n&Ⅱ細胞ではMT(+)細胞と同様に塩化亜鉛の濃度依存的にMT蛋白質の 合成が誘導されることが確認された(Fig. 9)oそこでこの細胞におけるNM31の発 現をノーザンプロット法に調べたところ､ MT(-)細胞で消失していたNM31の発現 はMT(-)〟&Ⅱ細胞ではMT(+)細胞レベルにまで回復した(Fig. 10)｡このことから NM31の発現調節にはMT-Ⅰ, ⅠⅠ蛋白質が深く関わっている可能性が示唆された｡

ところでMT-Ⅰ及び-Ⅱの2つの分子種は､マウスのほとんど全ての臓器でその

発現が同程度に認められることが知られている｡両分子種ともに61個のアミノ酸

で構成され､アミノ酸ホモログ(iden叫)は67%であり､ 1分子中に含まれる20個

のシステイン残基の位置は-敦している.この様な非常に類似した構造を有する

分子種が同様の体内分布を示すことから､各々の機能が異なる可能性が考えられ

る｡そこでMT(-)細胞にMT-Ⅰ遺伝子のみ､あるいはMT-Ⅱ遺伝子のみを導入し､ それぞれの蛋白質を単独に発現する細胞の樹立を試みた｡ Fig. 5に示したMT-Ⅰま たはMT-II遺伝子領域を適当な制限酵素で切り出し､peDNA爪ygroαベクターに組 み込んだのちMT(-)細胞に導入してそれぞれを安定に発現する細胞(MT(-)A, MT(-)瓜)を得た｡両細胞におけるそれぞれの遺伝子の発現は上述と同様のRT-PCR 法により確認した肝ig. ll).その結果､ MT(-)n細胞ではMT-Ⅰ遺伝子産物のみに MT(+)細胞と同一分子量のPCR産物が認められ､逆にMT(-)瓜細胞ではMr-Ⅱ遺

伝子産物がMT(+)細胞と同じ大きさであった｡また塩化亜鉛によるMT蛋白質の

誘導合成はそれぞれの細胞で同程度に認められた(Fig. 12)｡従ってMT(一･)〟または MT(-)瓜細胞にはそれぞれの遺伝子が安定に導入され､亜鉛による誘導も同程度に

生じることが判明した.そこでこれらの細胞におけるM31の発現をノーザンプ

ロット法により調べたところ､ MT(-)瓜細胞ではhqr(-)n&II細胞よりは弱いものの NM31の発現の回復が認められたが､ MT(-)n細胞ではほとんど認められなかID_た

(Fig. 13)｡このことからNM31の発現にはMTIII分子種の存在が必須であり､ wr-I

の存在により発現がさらに促進される可能性が考えられる.またhqr-Ⅰと-Ⅱの機

能の違いを示唆している可能性もあることから､この現象については更に解析を

進めていく予定である｡

マウスのMrにはMT-Ⅰ,ⅠⅠ分子種の他にMT-III, MT-Ⅳの存在が報告され､それ ぞれ68アミノ酸または62アミノ酸から構成されている｡これら2つの分子種の 21

-′ 発現には組織特異性があり､ MT-Ⅲは脳で､ Mr-Ⅳは舌や扇平上皮で発現が認め られる. PTZ-17はヒトやマウスの脳で特に高く発現していることから､次に MT-Ⅲ分子種のNM31発現Jtの関与を調べた｡ MT-Ⅲ翻訳領域をRT-PCR法によ り増幅し､サイトメガロウイルスプロモーターを持つプラスミド (peDNA3･1/Hygro)の下流に組み込んだのちMT(-)細胞に導入した.なお､ MT(-)及 びMT(+)細胞は肝臓由来の細胞であり､ Mr-Ⅲの発現は認められない(Fig. 14)o MT-Ⅲ発現プラスミドを導入した細胞をハイグロマイシンにより選択し､得られ た細胞におけるMT-Ⅲ遺伝子の発現をRT-PCR法により確認して(Fig. 14)､ MT-Ⅲ 安定発現細胞(灯(-)皿pとした｡この細胞におけるNM31の発現を調べた結果､ MT(-)n&Ⅱ細胞と同様にMT(+)細胞レベルにまでその発現は回復した(Fig. 15)｡従っ てNM31はMT-Ⅰ,-ⅡだけではなくMT-Ⅲによっても何らかの形で発現制御を受け

ている可能性が強く示唆された｡

ところで上述のようにMTは塩化亜鉛などの重金属によって誘導合成されること

が知られている.そこで次にMrの細胞内濃度を上昇させた時のNM31発現レベ

■ ルの変動について調べた. MT(+)及びMr(-)細胞を塩化亜鉛で処理し､その3, 6, 12そして24時間後に細胞からtotalRNAを抽出してノーザンプロットを行ない､ マウスMT-IcDNA,ヒトGAPDH及びNM31 wholeをプローブとしてそれぞれの遺 伝子の発現を調べたところ(Fig. 16)､両細胞において､ MTは時間依存的に発現量 が上昇し､亜鉛添加12時間後にピークとなった.一方､ Mr(-)細胞ではNM31の

発現は消失しており､また亜鉛添加による発現の増加は認められなかったが､

MT(+)細胞において､変動は少ないもののW31の発現量は亜鉛添加による減少

が観察された｡ Fig. 9の結果からMr蛋白質は亜鉛添加24時間後には上昇してお

り､従ってNM31の発現レベルはMrの細胞内濃度が減少しても､または増加し

ても抑制される可能性も考えられる｡

また､ pTZ添加によるNM31の変動を調べてみた. MT(+)細胞に5, 10,25また は50mMのPTZを添加し､その30分後あるいは60分後に細胞からRNAを抽出 してノーザンプロット法によりNM31の発現量を調べたところ(Fig.17)､ 50mM のPTZ添加群で両時間において発現量の低下が認められた.従ってNM31はマウ ス肝臓由来のMT(+)及びMT(-)細胞においてもnzによる負の制御を受けている ことが示唆された｡ 次に､ MT(+)及びMT(-)細胞におけるPTZの細胞毒性を調べてみた.両細胞を 96穴プレートに播いて一晩培養後､ pn (最終濃度10-60mM)または塩化カドミ ウム(最終濃度20-100pM)を培地に添加し､その24時間後の細胞生存率をアラ マーブル一法により調べたoその結果､ Mrが細胞毒性を軽減することが知られて いるカドミウムに対し､ MTを欠損したMT(-)細胞はMT(+)細胞に比べて高い感受 性を示したのに対し､ pTZに対する感受性は両細胞で同程度であった(Fig. 18).

NM31はPTZが引き起こす痘撃発症に関与する遺伝子として同定されている

nz-17と同一であるが､ NM31の発現が認められないMT(-)細胞のPTZに対する ■ 感受性がMT(+)細胞と同様であることから､ NM31の発現は少なくとも用いた培

養細胞においてPTZの細胞毒性には影響を与えないものと思われる.

さらに､ MT遺伝子欠損マウスを用いてPTZの痘撃発症における影響を調べてみ た｡ Mr遺伝子欠損マウス(MT-null)及び対照の正常マウスである129/Svマウスに 30mgnCg, 75 mgnlgまたは100mgnCgのPTZを腹腔内投与し､投与と同時にタイマー をスタートさせ塵撃が最初に認められる時間を比較した.その結果､ Tablelに示 すように30mgn(gのPTZ投与ではマウスの死亡も痘撃も認められなかったが､ 75 mgnCgで投与60秒前後に間代性塵撃が生じ､その後強直性痘撃が現れすべてのマ

ウスが死亡した｡その効果に対し､両系統のマウスで違いは認められなかった｡

100mgACgのPTZでは投与50秒後までに強直性痘撃とともにマウスは死亡し､同

-23-様にMTの有無で違いは認められなかった｡

以上の結果からpTZの細胞毒性及び塵撃発症に対してNM31は直接関与してい

ない可能性が考えられるが､上述のようにマウスで確認されている4つのMT分子

種のうちMT-Ⅲは脳で特異的に発現が認められることが知られている｡ Fig. 15に 示したようにNM31の発現はMT-Ⅰ,IIのみならずhqr-Ⅲによっても回復する｡ま た､ MT-ndl及び129/Svマウスの脳におけるNM31の発現に差は認められなかった (Fig. 19)ことから､ MT-Ⅰ,-Ⅱを発現している肝臓においては両遺伝子の欠損によ りNM31の発現が消失するが､ MT-Ⅰ,-IIに加えてMr-Ⅲが発現している大脳及び 小脳においては､ Mr-ⅡⅠによる制御を受け､ NM31の発現に変動が生じないのかも しれない｡ PTZ-17はペンチレンテトラゾ-ル投与後､早い時期にマウスの脳でその発現が 減少する遺伝子として同定4)され､本遺伝子の転写産物をxenopus oocytesで発現さ

せるとカルシウムの流入量が増大することが報告されている5)｡塵撃発症時には細

胞内カルシウム濃度の変動が生じることから､ PTZ-17は塵撃に関わる遺伝子とし V

て注目されている｡我々は偶然にもMT遺伝子欠損により発現が消失する遺伝子

NM31がpTZ-17と同一のものであることを兄いだし､ MTと塵撃発症の関わりに ついて検討を行った｡特にMT欠損マウス個体において､ PTZ誘発塵撃に対する感

受性が高まることが期待されたが､痘撃発症までの時間を指標にした本検討では

その感受性に違いは認められなかったo上述のようにNM31の発現はMT-I及び

MT-Ⅱ分子種により正の制御を受けると考えられるが､これら2つの分子種のみな

らず脳で特異的に発現しているMT-Ⅲによっても発現が制御されていることが判

明した.今回用いたMr遺伝子欠損マウスはMT-Ⅰ, -II分子種の発現は欠損してい

るもののMT-Ⅲ分子種は正常に転写･翻訳されており､従って脳内のNM31の発

現量は両系統のマウスで同様であると考えられる｡今後､ MT-Ⅲ遺伝子欠損マウ

スを早急に作製し､ NM31の脳における発現及びpTZ等の痘撃誘発物質に村する

感受性などを調べていく予定である｡

【参考論文】

1. Kagi, J.H.R. in Metallothionein Ill (eds･ Suzuki, K･T･･lmura, N･ &Kimura･ M)I

29-55 @irkhauser Verlag, Basel, Switzerland, 1993)

2. Cherian, M.G., Environ. Health Perspect･, 102, 131-135 (1994) 3.Masters, B.A. etal, Pl10C. Nail. Acad. Sci･ USA, 91, 584-588 (1994)

4. Kajiwara, K. etal, Brain Res･, 671, 170-174 (1995)

5. Kajiwara, K. etai, Mol･ Brain Res･, 47, 49-58 (1997) 6. Searle, P.F. etal, MoL. Pharmacol., 4, 1221-1230 (1984) 7. Hanahan, D. etal, ). Mol. Biol., 4, 122111230 (1983) 8. Miyairi, S. etal, Anal･ Biochem･, 258, 168-175 (1998)

ー25-血〔.'=/sn:

● MT nun Liver

I

∫

I

minced

incubated in Hanks'solution contaiming 0.05 %

conagenase at 37.C for 15min

centrifuged 50 I g for lnin

Ppt (hepatic cells)

i seeded into 6 wel. plates (4 x 105/wen)

I

↓

I

I

I

incubated in Col incubator at 37.C for 3 hr

infectedwith SV40 virus

incubated in Col incubator at 37.C for 2 hr

washedwith PBS (I)     .

incubated in Col incubator at 37.C for 3 ･ 4 weeks

MT(+) : derived from 129/Sv

MT(-) : derived from MT null

medium: D.MEM + 10% FCS +

I I lO･5M dexamethasone

10 ng/d insulin

loo nglhl EGF

Fig. 1

NM31 ト

L..1':.願';. :書1i, I:!一

Fig. 2

Differential Display of CDNA uslng Total

●

RNA from MT (+) and MT (-) Cells

-27-′

sLX's<'

NM31 -

cut and eluted

∫

ampliGedwith PCR

1

cloned into cloning Vector

(ラ

>二 Sequence PTZ･17 1 3 2 1 ' TTGCGCTTCTGACTGTTAAACACCAATGATGCATGCACTGTCCCTCTTCACTCTTTCTCT ★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ NW 1 1 I-        GACTGTTAAACACCAATGATGCATGCACTGTC C CTC TTCAC TC TTTC TC T PTZ･17 1 3 8 1 T CGCTTCCCCTCTGGCTTGAGTTTCTTGTGCATTCTCGCTACCCCCACCTCTGTTAGGGTA ■ ★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ NW1   5 1 -■ CGCTTCCCCTCTGGCTTGAGTTTCTTGTGCATTCTCGCTACCCCCACCTCTGTTAGGGTA PTZ･17 1 4 4 1 I GGTATATCAGCTATGTuTAAAGCWGGAAAJCGGTATTGTGCATTTGTGGCATTATGTA ★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ NM3 1  1 1 1 I- GGTATATCAGC TATGTAAATAAAGCAAJGGAAACGGTATTGTGCATTTGTGGCATTATGTA PTZ.17 1 5 0 1 ' GAATTGCAGTGTGCGCTGCCGAAAATGCAGGCTTTTGTAACGTGGTCCTCTCATAAGTAC ★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ NM31  1 7 1 TI GAATTGCAGTGTGCGCTGCCGAAAATGCAGGCTTTTGTAACGTGGTCCTCTCATAAGTAC PTZ_17 1 5 6 1 T CCAATGTATTTTAGCTATTTTAGTAGGATTTGTTCAATAAATATGCAAGCTATAAGGT ★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ NM31  2 3 1 " CCAATGTAmTTAGCTATTTTAGTAGGATTTGTTCAATAAATATGCAAGCTATAAGGT

Fig. 3

DD probe

PTZ probes

GAPDH

MT(+) MT(J MT(+) MTト) whole probe

ORF probe

室-S!_-___ _i_:室:-_-;≡

Fig. 4

Northern Blot Analysis or NM31 (PTZ･17)

CDNA by Three Different Probes

-29-p!ust!tJHXdhtJt!3鏑S3u39

●

tt･LMPut!(･J.DV3SnODV3qこOdt!DVuO!73!JTS3d

s'誠!&

一u3uBt!JJt3pNqq∞.e 3u33tt･J.言 一tT3uBt!JJtttPu!Hq等.S 3ttaBt･J.Du 一u3uut!JJAt[03甲tud出qqOt 3u337(2g(･J.言 一】3Su!qqOT

Fig. 6

Structure or仙e pcDNA3.1/Hygroα Vector

-MT gene

MT(-) cems

T ransfection

●

Selection by Hygromycln

Fig. 7

cel. l lSL･,#L,,sL-,S#L,,01滴軸瑞♂

+mtLtated pmdtLCt

Jーnonml product

MT(+) : Cells obteined from liver of normalmouse

MT(-) : Cells obteined fromliver of MT tluII mouse '

MT(-)/V : pcDNA3.1JⅡygroα transfected MT(-) cell

MT(-)n&II : pcDNA3.1/Ⅱygroq･MT･I&Ⅱ transfected MT(-) cell

Fig. 8

Expression or MT･I or MT･ⅠI mRNA in

MT(+), MT(-) and MT(-)〝&ⅠI Cells

-33-′ (u!370｣d如uP]])一u3一uO3LDV 3 つ一 1 0 0 150 180 0 150 180 0 150 180 0 150 180

Zinc concentration in the culture medium (uM)

Fig.9

一嶋 NM31

→嶋 GAPDH

MT(+) : Cells obteined from liver of 129/Sv mouse

MT(-) : Cells obteined from liver of MT-null mouse

MT(-)n&ⅠⅠ : pcDNA3.1mygroα-MT-Ⅰ&II transfected MT(J cell

Fig. 10

Expression of NM31 Specific RNA in

MT (+), MT (-) and MT(-)〟&ⅠI Cells

ー35-付目-は3旧

Primer MT一Ⅰ MT.ⅠⅠ

cell SL.lsL-lsL-lOsL,lbh sL･l#L,lsL-18#L,l∼h

S.njSted,pH::;I

MT(+) : Cells obteinedfromliver of 129/Sv mouse

MT(-) : Cells obteinedfrom liver of MT-null mouse

MT(-)A : pcDNA3.I/Hygroα･MT-I transfected MT(-) cell

MT(-)nI : pcDNA3. I/Hygroα･MT-II transfected MT(-) cell

Fig. ll

Expression of MT･I or MT-ⅠI mRNA in

MT(+), MT(-), MT(-)〟 and MT(-)ⅠI Cells

(u!3一OJ[dM息]])一u3一uO3J.DV

丁

0 150 180  0 150 180  0 150 180  0 150 180

Zinc concentration in the culture medium (LIM)

Fig. 12

1mduction or Metallothionein (MT) Proteins in

MT-I&II Genes Transfected Cells by Zinc

ー37-㌔♂♂♂♂

二I-:_I-t=:二

→■ NM31

一I GAPDH

MT(+) : Cells obteinedfrom liver of 129/Sv notISe

MT(-) : Cells obteinedfrom liver of MT-null mouse

MT(-)n&II : pcDNA3.1/Hygroα･MT･I&ⅠI transfected MT(-) cell MT(-)A : pcDNA3.I/Hygroα･MT･I transfected MT(-) cell

MT(-)nI : pcDNA3.1/Hygroα-MT･II transfected MT(-) cell

Fig. 13

RT･PCR

3㌧∼ ㌔㌔

一l MT一日

一■ GAPDH

MT(+) : Cens obteined from liver of 129/Sv mouse

MT(-) : Ceus obteined from liver of MT-null mouse

MT(-)n&ⅠⅠ : pcDNA3. 1mygroα･MT-I&II transfected MT(-) cell MT(-)nII : pcDNA3.1mygro-MT･ⅠⅠI transfected MT(-) cell

Fig. 14

Expression of MT-ⅠⅠI mRNA in MT-ⅠⅠI

Transfected MT(-) Cells

-39-㌔♂♂

→嶋 NM31

一■ GAPDH

MT(+) : Cells obteined from liver of 129/Sv mouse

MT(-) : Cells obteined from liver of MT-null mouse

MT(-)nII : pcDNA3. 1mygro-MT-ⅠⅠI transfected MT(-) cell

Fig. 15

0 3 6 12 24 0 3 6 12 24 (hr)

一l NM31

一嶋 MT

一} GAPDH

(H凸dVDJトM) SlO>OIVNtJLL]トMO^rlt2Pt] 0  06  5 4 3 2 . 1 ● ∩▼  0  0  0 0  6  12 18  24

Time after ZnCl2 treatment

(H凸dV9JLCMN)

SP^OLVNtJuJ LC≡NO>Jtt!lOtd 0  > 0.4  3

2    1

0.  0.

0  6  12 18  24

Time after ZnCl2 treatment

Fig. 16

Effect of ZnC12 0n NM31 and MT mRNA

Levels in MT(+) and MT(-) Cells

-30 min

60 min

PTZ O 5 10 25 50 5 10 25 50 (mM)

一嶋 NM31

■●●■●■●}『

(H凸dV9JLC≡N) のlO>OLVNt]uJ LC≡NO>LteIOt] 0 0 5 10 25 50 5 10 25 50 30 min     60 min

一■ GAPDH

Fig. 17

Effect of Pentylenetetrazole (PTZ) on NM31

mRNA Level in MT(+) Cells after 30 min or

(lOJluO0-0%)lt2^!NnSニ03 00  75 0 lD    0 5    2 5    0    5 7,   lb    2 0 0 20    40    60

PTZ (mM)

0  20 40  60  80 100

CdCl2 (PM)

●一･･.-.1 MT(｣ 〇一････｣〇 MT(+) ●一･.一･一→● MTH

Fig. 18

Sensitivities or MT(+) and MT(-) Cells to

Pentylenetetrazole (PTZ) and CdC12

-43-33!言tPu･LMPudASJ6=Tu!SJJnZ!3SP33nPu!･(ZJ.a)atOZt!J}373u3tRTuad

Tatqt!L

守.I I:0.∞寸 め.S胡卜.9寸 S.卜刊ト.寸S 0.S+ 叫.e9

白Z

.p373313P一Ou3J3jhS3JnZ!aS'･白N(*

白Z

白と (☆白と (%)Rt!tdq一3t (33S) 白S劃tttPut ニーrj 章     二

(33S)3JTLZ!3S3!ttqP!uOP

ISJtJ〇一&3u3一t!rt (.d.!'3忌u)

ZJ.A

NM31

GAPDH

♂ @^&LIGh ♂ @^･bLIGh

Livor

Cerebru ∩

Cerebellum

･.-i:.･･.● = 1声1● -:･∴ ･

Fig. 19

Expression of NM3l specific RNA in Various

Tissues of 129/Sv and MT-mull Mice

-45-MetaIIothionein Mediates Gene Expression of 3.I mRNA (PTZ17)

Related to Epileptic Seizure

- I Metallothionein(S) is a small protein found in most eukaryotic species. Cysteine residues account for approximately 30 % of the totalamino acid

content of metallothionein (K年gi, 1993; Webb, 1979) which has roles in

protection againstthe toxic effects of heavy metals, xenobiotics and

y-irradiation, as well as in drug resistance, homeostasis of essentialmetalsand

free radicals scavenging (Bremner, 1987; K卑gi, 1993; Lazo and Bahnson,

1989; Sato and Bremner, 1993). The high content and intermolecular

■

localization of cysteine residues in metallotbionein are highly conseⅣed

among species',these facts are considered to be extremely important to

metallothionein function (Hamer, 1986; Kagi, 1993). On the other hand,

nuclearlocalization of metallothionein in mammaliancells has been reported by severalinvestigators (Cherian, 1994; Kuo et al･, 1994; Panemangalore eE al., 1983), indicatingthat metallothionein mayalso be associated withuclear

functions. We speculatedthat metallothionein is involved in gene expression･

gene is dismpted

MATERIALS AND METHODS

DIHeTmtial display screening･ TotalRNA was extracted from exponentially

growlng Cells or from mouse liver uslng guanidinium

thiocyanate-phenol-chlorofom (Chomczynskiand Sacchi, 1987). Differentialdisplay proceeded

as･described by Liangand Pardee (Liang et all, 1994). TotalRNA (0.1 pg)

was converted to single stranded CDNA uslng MMLV-reverse transcnptase

and primersanchored by one base in a volume of 20 pl. The solution (1 pl)

Containing CDNA was then added to a PCR reaction mixture (10 pl)

contaiming 2 pM oftheanchoredand random primers, 2 pM dNTP, 0.5 pCi of

lα-32p]dCTPand O･5 umits of Taq polymerase (Boehringer). PCR proceeded

using athemalcycler (MP; Takara)through40 cycles of 94.C for 30 see, 40

V

.C for2minand 72 ℃ for 30 see followed by 72.C for 5min･ Theanplified

cDNAs(3･5 pl) were separated on a 6% sequencing gel, blotted on 3M paper,

driedand exposed to X-ray film･ Bands of interest were eluted fromthe gel by boiling ln Water･ DNA was precIPltated in ethanol,then re-amplified using

血e same pnmer set and PCR conditions except血e dNTP concentrations were

20 pMand no isotope was added･ PCR samples were separated on a 1.5%

agarose gel, extractedand used as a probe for Northem hybridization.

-47-Northem blot analysis. TotalRNA (20 llg) was resolved by electrophoresis on o･8% agarose/formaldehyde gels,then transferred to Hybond-N+nylon

membrane (Amersham), amd′UV cross-linked･ The membrane was then

hybridized overnight with random primed l32p]dCTP-labelled CDNA fragments obtained as above･ The membrane was washedand exposed to

X-ray filmovemight at -80 oC withanintensifying screen･ The membrane was

strippedand re-probed with32p-labelled GAPDH CDNA asanintemal control･

Gene transfer. MT(-)cells were incubated with a calcium phosphate precipitate containing 12 pg of DNA (10 pg of PKH plasmid containingthe

MT-Ⅰand -II genes(Searle et al., 1984) and 2 pg of PCDEBD containing

hygromycin-B phosphotransferase as a selective marker) for 7 hr･ This

mixture was replaced withnormalmedium and incubated for afurther 48 hr･

■

stably transfected cells were selected by culture in the presence of

hygromycin-B (300 pg/mi, Boehringer) for about 14 days･ Clones resistant to

RESULTS AND DISCUSSION

We isolatedand established SV40-immortalized stellate cell lines from

the livers of transgemiCmice deficient inthe genes for metallothioneinland

-II (Masters et al., 1994)and from normal129/Sv mice (controls). These cells

were designated as IMS-MT (-) (immortalized mouse stellate cells from

MT-null mouse) and IMS-N(immortalized mouse stellate cells from normal

mouse) , respectively. We exmined totalRNA sample from bothcell lines by

differentialdisplay (Liang et al., 1994),and we found one CDNA(tentatively

named NM31)that was expressed only in IMS-N cells (Fig. la). Northem

hybridization uslng NM3 1 as a probe confirmedthatthis gene was expressed

at negligible levels in IMS-MT (-) cells (Fig. lb)･ nLeSe results suggestedthat

metallothionein(S) is involved in NM31 gene expression. To confirmthis

notion, plasmid PKH contaiming mouse metallothionein-Iand -II genes(Searle

■

et al., 1984) (a kind gift from Dr. R. D. Palmiter) was introduced into IMSI

MT (-)cells. Stable transfomants called IMS-MT (-)/PKH, expressed both

normaland disrupted mutant metallothionein Iand II mRNA as shown in Fig.

2a. Syn血esis of metallo血ionein protein was induced by zinc chlodde in

Nand MT (-)/PKH, but not in MT (-) cells. Moreover,

IMS-MT (-)/PKH cells were significantly less sensitive thanIMS-IMS-MT (-)cells to

cadmium, indicating that IMS-MT (-)/PKH cells produce functional

metallothionein proteins. We then compared the level of NM31 gene

-49-expression in IMS-MT (-) and IMS-MT (-)/PKH cells by Northern

hybridization. NM3 1 was expressed at high levels in IMS-MT (-)/PKH cells

(Fig･ 2b)･ This finding sugg9StS that NM31 gene expression is essentially

mediated by metallothionein･ It is believed that most of the biological

functions of metallothioneinare due toanabundance of cysteine residues･

The present study presents a new concept to explain the biological roles of

metallothionein: it may mediatethe expression of specific genes･

The nucleotide sequence of NM31 (294 bp) was identical to the 3'

region of 3.1 mRNA(Studler et al･, 1993), which is abundant inthe embryonic

mouse brain･ The gene for 3･l mRNA is conserved at least inthe mouseand

in hunanS, where it is mainly expressed inthe cerebellum, hippocampusand

olfactory bulb(Studler et al., 1993)･ On the other hand, Kajiwara et al.(Kajiwara et al., 1995)also isolatedthe gene forthis 3･ 1 mRNA (PTZ17) as

V

the gene related to chemically induced seizures･ The expression of 3･ 1 mRNA

in the mouse brain is slgnificantly depressed by an intraperitoneal

admimistration of pentylenetetrazole, which induces seizures(Kajiwara et all ,

1995). During the bursting activity induced by pentylenetetrazole, intracellularCalcium is released from storage sitesand moved to the inner surface of the cell membrane in neurons(Sugayaand Onozuka, 1978a; Sugaya and Onozuka, 1978b). The injection of 3.1 mRNA into Xenopus oocytes

intracellularCalcium increase(Kajiwara et al., 1995). We examined 3. I mRNA

expression in the brain and other tissues of nomal and of transgenic mice

deficient inthe genes for rnetallothionein land -ⅠⅠ, by Northem hybridization

using a 3･l mRNA CDNA as a probe･ Figure 3 showsthatthe transcnpt was essentially undetectable inthe livers and kidneys of mice deficient in

metallothionein-I and -II. However, substantial levels of 3.I mRNA were

モXPreSSed inthe mouse cerebellum,althoughthesemice were

metallothionein-I and -metallothionein-Imetallothionein-I deficient (Fig. 3). A brain-specific isoforme (MT-metallothionein-Imetallothionein-Imetallothionein-I) of

metallothionein has been isolatedand ovserbed to inhibit survival of cultured rat neuronsand to be deficient in the brains of patients with AIzheimer's

deserase(Palmiter et aL, 1992; Uchida et al., 1991). The metallothionein-null

mice used inthis study expressthe gene for metallothionein-III. Erickson et

al･ (Erickson et al., 1997) reportedthatmice deficient in metallothionein-III

■

are more susceptible to seizures induced by kainic acid. Therefore,

metallothionein-IIImight play a role inthe expression of 3.I mRNA in the

bmin･ Epileptic seizures affect about O･5% of the population (Kajiwara et al.,

1995), butthe mechanism of their manifestation remains unclear. However,

we conclude that metallothionein(S) is involved in chemically induced

seizures by mediating 3. 1 mRNA gene expression.

-REFERENC ES

Bremner, I. (1987) Nutri,tional and physiological significance of

metallothionein. In Kagi, J.H.R.and Kojima, Y･ (eds･), Metallothionein II,

Experientia Suppl･

Birkhauser Vedag, Basらl, Vol. 52, pp･ 81-107･

Cherian, M.G. (1994) The significance of the nuclear and cytoplasmic

localization of metallothionein in human liverand tumor cells. EnviT10n. Health Perspect., 102, 13 I-135･

chomczynski, P.and Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation

by acid guamidinium thiocyanate-phenoトchlorofbm extraction･ A〃dJ･ ■

Biochem., 162, 156-159.

Erickson, J･C･, Hollopeter, G･, Thomas, S･A･, Froelick, G･J･and Palmiter, R･D･

(1997) Dismption of the metallo血ionein-ⅠⅠI gene in mice: analysis of brain

zinc, behavior,and neuron vulnerability to metals, aglng, and seizures･ J･

Neurosci., 17, 127111281.

Kajiwara, K･, Sugaya, E･,Kimura, M･, Katsuki, M., Nagasawa, H., Yuyama,

N･, Tsu血, T･, Sugaya, A･, Motoki, M･, Ookura, T･ and et al. (1995) Cloning

and characterization of pegtylenetetrazol-related CDNA, PTZ- 1 7. Brain Res.,

671, 170-174.

Kuo, S･M･, Kondo, Y･, DeFilippo, J.M., Emstoff, M.S., Bahnson, R.R.and

-Lazo, J.S. (1994) Subcellularlocalization of metallothionein IIA in human

bladder tumor cells uslng a novel epltOPe-SPeCificantiserum･ Toxicol･ Appl･

Phamzacol. , 125, 104-1 10.

Kagi, J･H･R･ (1993) Evolution, stuructureand chemical activity of class I

metallothioneins:anoverview. In Suzuki, K.T., Imura, N.and Kimura, M. (eds･), Metallothionein III･ Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland, pp. 29-55.

V

Lazo, J･S･ and Bahnson, R･R. (1989) Phamacological modulators of DNA-interactiveantitumor drugs. Tips, 10, 3691373.

Liang, P., Zhu, W･, Zhang, X., Guo, Z., OIConnell, R.P., Averboukh, L.,

Wang, F･and Pardee, A･B･ (1994) Differential display using one-base

anchored olig0-dT primers. Nucleic Acids Resewch, 22, 5763-5764.

Masters, B.A., Kelly, E.J., Quaife, C.J., Brinster, R.L and Palmiter, R.D.

-53-(1994) Targeted dismption of metallothionein l and II genes increases

sensitivity to cadmium. Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America, 91, 584-588.

Palmiter, R.D., Findley, S.D., Whitmore, T.E.and Dumam, D･M･ (1992)

MT-III, a bmin-specific member of the metallothionein gene family･ Proc･ Natl･

Acad. Sci. U.S.A., 89, 6333-6337.

Panemangalore, M., Banerjee, D･, Onosaka, S･ and Cherian, M･G･ (1983)

Changes inthe intracellularaccumulationand distribution of metallothionein

inrat liverand kidney during postnataldevelopment･ Developmental Biology,

97, 95-102.

sato, M. and Bremner, I. (1993) Oxygen free radicalSand metallothionein･

Free Radical Biol. Med. , 14, 325-337.

searle, P.F., Davison, B.L., Stuart, G.W., Wilkie, T.M., Norstedt, G･ and

Palmiter, 良.D. (1984) Regulation, linkage, and sequence of mouse

metallothionein Iand II genes. Molecular & Cellulbr Biology, 4, 122 1- 1230･

of the embryomic bmin persists at a high level in cerebellum･ hippocampusand

olfactory bulb during adulthood･ European Joumal of Neuroscience, 5,

614-623.

sugaya, E. and Onoz止a, M･ (1978a) Intracellular calcium: its movement

d血ng pentylenetetrazole-induced bursting activity･ Science, 200, 797-799･

sugaya, E.and Onozuka, M･ (1978b) Ion showermilling: its application to

cell membrane removal. Science, 202, I 197-1 198.

Uchida, Y., Takio, K., Titani, K., hara, Y.and Tomonaga, M･ (1991) Newon,

7, 337-347.

webb, M. (1979) Metallothionein. In Webb, M･ (ed･) The Chemistry,

Biochemistry and Biology of Cbdmium･ EIsevie〟NorthHolland, Amsterdam･

pp. 195-266･

-55-(A) ♂㌔ (B)

二･-.:....一I

FIG. I a, Gene expression in IMS-N and IMS-MT (-) ceIIs･ Total RNA.extracted from both cell lines

wasthe template for reverse transcription and subsequent PCR amplification in the presence of l32P]-dCTP･ The amplified products were resolved on 6% DNA sequenclng gels and visualized by

autoradiography･ TTle NM31 arrow indicates an mRNA species amplified in IMS-N, but not in IMS-MT

(-) cells. b, Northem hybridization ofNM31 mRNA in IMS-N and IMS-MT (-) ceHs･ NM3l CDNA

(excised from the gel shown in a) was re-amplified and labelled with 32P-dCTP･ GAPDH mRNA was

dete血ned as a loading control.

(a)

約･^L''轟L''

-______ hNM31

{■芸APDH

FIG. 2 Effect of introduction of plasmid PKH, carrylng the genes for metallothionein-I and II, into

IMSIMT (-) cells on expression of metaIIothionein-I (MT-I) and -II (MT-II) and NM31 mRNA･

RNAs from IMSIN, IMSIMT (-) andthe transfわrmed cell line (IMS-MT (-)/PKH) were analyzed by

RT-PCR using primers specific for metalIothionein-I and -II, respectively (Masters et al., 1994) (a)I

在籍の研究者の論文で、かつ、出版社等から著作権の許諾が得られた論文は、個別にTOUR に登録 しております。

TOUR