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抗デオキシニバレノールモノクローナル抗体の作製と酵素サイクリング法を利用した高感度ELISAの確立-香川大学学術情報リポジトリ

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(1)

抗デオキシニバレノールモノクローナル抗体の作製と酵素サイクリン.グ法を

       利用した高感度ELISAの確立

  川村 理

 PRODUCTION

IS/IONOCLONAL

ANTIBODIES

AGAINST

DEOXYNIVALENOL

AND

DEVELOPIVIENT

OF A HIGH

SENSITIVE

ELISA

USING

ENZY]S4E

AJM]VIPLIFICATION

Osamu KAwAMURA

       Abstract

 ln order to establish a high sensitive ELISA fbr deoxynivalenol (pON),worldwideoccu 「ng in c6real grajns contaminated FzljαΓjg謂 grz2j?2&zgαΓM謂,specific monoclonal antibodies(mAbs)against DON were newly prepared. The immunogen was prepared as follows ; 3-acetyl DON(3ADON)was reacted with anhydride hemiglutarated,and the resulted 3ADON hemigultarate(3ADON-HG)was deacylated by ・acetylase.The product, DQN-HG,was coupled to bovine serum albumin (BSA)and ovalbumi!l by mixed anhydride reaction. Spleen cells from the mice immunized with DON-HG-BSA were fused with SP2/O myeloma.After HAT selection and cloning,five anti-DON antibody producing hybridomas(DON.1-5)were obtained.ln the indirect competitive ELISA with horseradish peroxides-labeled second antibody and 3 ,3≒ 5,5’-tetramethly

benzidine as substrate(HRP/TMBZ method),the detection limit was l00 ng/ml With DON. l or DON.3.,The sensitive DON. 1 and DON.3 crQss-reacted with nivalenol (5and 6%),and 15-acectyl DON (267 an(j333 %),respectiyely. DON.3 cross-reacted le闘than 0.5%other trichothecens.。

 To impμ)ve the sensitivity,alkaline phosphatase-labeled silcond antibody and NADP as substrate (enzyme amplifi6ation method,ALpノフNADP method)was established.The detection limit in the ALP/NDAP method using DON.3 was 5 ng/mi,20-fold sensitive than the HRP/TMBZ method. Using the ALP/NDAP method, the‘4uautification of DON in wheat and naked barley was performed. 70% aqueous metbaりol extract from wheat or naked barley was evaporated,and the residue dissolved in 0.01M phosphate buffbred saline pH 7.4 containing O. 05%Tlyeen20 and 10%methanolMlas sul!jected the ELISA. The detection limit was 50 ng/g. The average recovery of DON Spiked in the range 5 0 to 2,500 ng/gwas 105%.Survey natural occurrence has revealed that 18 out of 20 cereal samples in Japan were positive.The ELISA data were closely correlated with those gas chromatography (r2°O.988).Application of the present ELISA in combination with an enzyme amplification system is expected for mass screening of DON in cereals.

Key words : Deoxynivalenol,Monoclonal

antibody,ELISA,An

enzyme amplificationsystem

ケ       

緒      言

 デオキシニバレノール(DON)は,凡,g治。graニ

「,z・・z。などが産生するトリコテセン系マイコトキシ

ンで,最も高頻度に麦類をはじめとする穀類の汚染が知

られているカ,ピ毒である‘11.t)ONをはじめとするトリ

コテセン系マイコトキシンは,細胞毒性が強く,増殖の

盛んな臓器である腸管上皮繕胞や免疫泉の細胞に対して

障害性を示し,胃腸障害や免疫不全などの症状を引き起

こすことが知られている‘2).JECFAは2001年の部会で

DONリスク評価を行い暫定TDIIμg/kg体重/日を提示

した‘s).これを受け,薬事・食品衛生審議会食品衛生分

科会食品規格・毒性合同部会は,玄麦中のDON暫定基

準値を1.1mg/kgに設定した(‘'.故に,DONの簡便かつ

高感度な分析法の確立が求められている.

 そこで,本研究ではDONに対するモノクローナル抗

体を作製し,酵素サイクリング法(5)を導入した高感度

ELISA法の確立し,その応用性について検討した.

(2)

28 香川大学農学部学術報告 第57巻(2005)      材料および方法 材 料  DONおよぴ関違トリコテセン類は,研究室で精製し た純度98%以上のものを用いた.ウシ血清アルプミン  (BSA)・3,3≒5,5’ -tetramethylbenzidine (TMBZ),フロ イド完全アジュバンドおよびフロイド不完全アジュバン ドは和光純薬社製を,卵白アルブミン(OVA)は生化 学工業社製をそれぞれ用いた.1 -ethyl-3 ,3’.diethy- lamino-propyl-carbodiimide(EDPC),acetylesterase,alco-hol dehydrogenase, j7-iodotetrazoliumvioletはSigma Chemi-cal社製を,horseradish peroxidase (HRP)標識ヤギ抗マ ウスイムノグロブリン抗体およぴalkanne \phosphtase  (ALP)標識ヤギ抗マウスイムノグロプリン抗体はTago 社製を,NADP(NAD-free)とdiaphoraseはBoehringer Mannheim GmbH社製をそれぞれ用いた.その他め試薬 は特級又は同等品を用いた.BALB/cマウス(8週令, メス)は三協ラポサーピスより購入した.     ‥ 留水で洗浄後,溶媒を留去した.DON-G-OSu(0.3mg) を0.03mlの7V-hydroxysuccinimindeに溶解し,3mgの OVAを溶解した3mlのPBSに加え,室温で24時間反応 させた.反応液をPBS 1 Lに対して4回透析し, DON-HG-OVAを得た.

免 疫

 BALB/cマウス(8週令,メス)に等量のフロインド

完全アジュバントと乳化したDON-HG-BSA

0.03mgを皮

下注射した.2週間後,等量のフロインド不完全アジュ

バントと乳化したDON-HG-BSA

0.03mgを皮下注射し,

その後2回1週間間隔でDON-HG-BSA

0.03mgを腹腔内

投与したレ4回の免疫1週間後,採血し,抗体価を測定

した.最も抗体価の高かったマウスに細胞融合3日前に

O,01mgのDON-HG-BSAを静注した.

DON一蛋白質結合体の作製  DON-ヘミグルタレート(DON-HG)は,Millsらの方 法(6)を一部変えて作製した.3-アセチルDON(3 -ADON)20mgを1mlのピリジンに溶解後,無水グルタ ル酸(166mg)を加え,90℃で3時間加温した.1mlの 蒸留水を加え反応を停止したのち,2mlのクロロホル ムで抽出した.クロロホルム層を9mlの蒸留水で4回 洗浄した.溶媒を留去したのち残浚を0.5mlのアセトン に溶解し,6mlの0.02%NaN3を含む0.1Mリン酸緩衝液  (pH6.5)を加えた.この溶液にacetylesterase(100 units)を溶解.した3mlの0.1Mリン酸緩衝液(pH6.5) を加え,30℃で1遺間反応させた.反応液のpHを1M 塩酸で3に調製し,DON-HGを酢酸エチル40mlで2回 拍出した.酢酸エチル層を合わせ,溶媒を留去した.  DON-HGは,大谷らの方法(7りこ準じてBSAと結合さ せた.すなわち,BSA(28mg)を;・2.8mlのO.01Mリン酸 緩衝生理食塩水(pH7.3,PBS)に溶解し,EDPC2.6 mgを添加した.この溶液に2.6mgのDON-HGを溶かし たN,Nこ・ジメチルホルムアミド0.1mlを加え,室温で12時 間反応させた.反応液は,PBS1Lに対して4回透析し, DON-HG-BSAを得た.また,DON-HG(2.8mg)と jV-hydroysucciniminde(0.8mg)を0.2mlのアセトニトリ ルに溶解後,0.25mgめdicyclohexylcarbodiimideを加え, 4℃で48時間反応させ,3-[4-(jV-sucinimidoxycarbonyl) -butyl]-DON(DON-G-OSu)を作製した.DON-G-OSu は,反応液に1mlの蒸留水を加えたのち,クロロホル ム(0.75ml)で抽出した.クロロホルム層を同量の蒸

細胞融合およびクローニング

最終免疫3日後のマウスより牌細胞を取り出し,マウ

スミエローマー細胞SP2/O-Ag14と50%ポリエチレング

リコール4000を用い常法゜により細胞融合を行った.

HAT選択後,DON-HG-OVAに対する結合性により,ハ

イブリドーマの選択を行い,限外希釈法(りこより,2

回以上のクローニングを行い,安定な抗DON抗体産生

ハイプリドーマを得た.抗体のアイーソタイプは,マウス

モノクローナル抗体アイソタイピングキット

 (Amersham社製)を用いて決めた.

間接ELISA  マウスの抗体価の測定およぴハイプリ.ドーマの選択は, 間接ELISAによって行った.すなわち,DON-HG-OVA  (2μg/ml/o.1M炭酸緩衝液pH9.6)を100μ1ずつ96-ウ ェルマイクロプレート(NUNC immunoplate H)の各 ウェルに加え,4℃で一晩静置し,コーティングを行っ た.プレートを0.05%Tweenn2 0 を含むPBS(PBS/ Tween)で3回洗浄したのち,各ウエルに0.5%OVA  (PBS溶液)を150μIずつ加え,室温で1時間静置し, プロキングを行った.プレートをPBSノTweenで3回洗浄 したのち,100μ1のマウス抗血清希釈痕または培養上清 を加え,室温で1時間反応させた.プレートをP13S/ Tweenで4回洗浄したのち,100μIのH尽P標識ヤギ抗マ ウスイムノグロブリン抗体(PBS/Tweenで1 /5,000希釈) 加え,室温で1時間反応させた.プレートをPBS/T9/een で6回洗浄したのち,100μIの0.005%過酸化水素と0.1 mg/mlのTMBZを含む0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)を加え, 室温で30分間酵素反応を行った.1M硫酸50μ1を加え 反応を停止したのち,450nmの吸光度を測定した.

(3)

11I

一 ミ =

Pi

NADP

Alkaline hos hatase

     (conjugated

with 2nd Ab)

FOrmazan

i(OD

490 nm)

Q泌地ras!l

‘ρ-iodonitro

teteazoliun

violet

11−I

NAD

Redox

cycle

NADH

Ethanol

Alcohol

dehvdro

Acetaldehyde

enase

      Fig.1 The principle of an enzyme ampnfication system.

The enzyme amplification of alkaUne phosphatase was subsequently measured with an el!zyme amplified assay,involving the initial dephosphorylation of NADP to NAD, and the cycling of NAD and NADH in a redox cycle generatinga colored formazan dye・ .

競合的間接ELISA

HRP/TMBZ法

 HRP/TMBZ法で抗DONモノクローナル抗体の特異性

の検討を行った.上記の間接ELISAと同様にコーティン

グおよびプロッキングを行ったのち,10%(v/v)メタ

ノールを含むPBSノTween溶液に溶解したDONまたは関達

トリコテセン系マイコトキシン50μ1を加え,さらに,

PBS/rweenで希釈した各抗DONモ・ノクローナル抗体を50

μ1を加え撹祥後,4℃で一晩静置した.プレートを

PBS/rweenで6回洗浄したのち,上記の間接ELISAと同

様に操作した.

ALP/NADP法(酵素サイクリング法)

 DON-HG-OVA(100ng/m10.1M炭酸緩衝液pH9.6)を

60μ1ずつ96-ウェルマイクロプレートの各ウェルに加え,

4℃で一晩静置し,コーティングを行った.プレートを

PBS/rM/eenで3回洗浄したのち,各ウエルに0.5%OVA

 (PBS溶液)を150μ1ずつ加え,室温で1時間静置し,

プロキングを行った.プレートをPBS/rweenで3回洗浄

したのち,10%(v/v)メタノールを含むPBS/Twe6n溶

液に溶解したDONまたは関連トリコテセン系マイコト

キシン30μ1を加え,さらに,PBS/Tweenで希釈した各

抗DONモノクローナル抗体30μ1を加え撹件後,4℃で

一晩静置した.プレートをPBS/Tweenで5回洗浄したの

ち,60μIのALP標識ヤギ抗マウスイムノグロプリン抗

体(PBS/ri¥eenで1

/5,000希釈)加え,室温で1時間反

応させた.フ゜レートをPBS/Tweenで6回洗浄したのち,

60μ1のO.1mM NADP溶液(1mM塩化マグネシウムと

アジ化ナトリウムを含む50niMジエタノールアミン緩衝

液,pH9.5)を加え,4℃で1時間反応させた.これら の各ウエ.ルに120μIの0.55mg/ml j,-iodonitro tertrazo-liumviolet 2 0 mMリン酸緩衝液,pH7.2(0.1 mg/m1

alcohol dehydrogenase, 0. 075mg/ml djaphorase,45(v/V) エタノールおよぴ5 mg/mlBSAを含む)を加え,4℃で 20分間反応させ,490nmの吸光度を測定した.この反応 の原理をFig.1に示した.    ▽

ELISA試料溶液の謂製

 粉砕した5gの裸麦およぴ小麦を40mlの70%(v/v)メ

タノールを加え30分聞振とう抽出した.抽出液は3,000

回転で5分聞遠心し,上清を採り,−20℃で一晩保存し

た.−20℃保存後,生じた沈殿を3,000回転で10分間遠

心し取り除いたのち,上清を0.4ml採り,溶媒を完全に

留去し/乾固させた.残浚を0.5mlの10%(v/v)メタ

ノールを含むPBS/Tψeenに溶解し,この溶液をELISA試

料溶液とした.また,ガスクロマトグラフィー(GC)

によるDONの分析はTanakaらの方法(8’で行った.

         結     果

モノクローナル抗体の作製

 細胞融合後,1,020ウェルに細胞をまき,HAT選択後,

925ウエル(91%)でハイブリドーマの増殖を確認した.

これらめ培養上清を間接ELISAでDON-HG-ONAに対し

て結合が認められたのは64ウェル(6.9%)であった.

これらの培養上清を競合的間接ELISA(HRP/TMBZ法)

で,DON(10μg/m1)でDON-HG-ONAに対して結合が

阻害されるのは27ウェル(42%)であった.この27ウェ

(4)

3 0 % lu!Pu!g 120 1 0 0 8 0 4 0 2 0 0 0 0.1 1 香川大学農学部学術報告 第57巻(2005) 1 0 1 0 0       DON(lg/II)

Fig.2 Comparison of the standard curves wi!h

anti-     deoxynivalenol monoclonal antibodies by the

indi-     rect competitive ELISA HRP/TMBZ method.

The detgction limits, expressed as concentration giving over 15%

(−)jnhibition observed in the indirect むompetitive ELISA HRPyTMBZ method,vvere0.8(DON.1,●),1.0(DON.2, 0),0.1(DON.3,1),1.3(DON.4,□)and 1.0μg of deoxynivilleno】/ml(DON.5,△),respectively・

16(?ト132

−︲ 町. R5’ H

R3

ルのハイブリドーマすべてを限界希釈法でクローニング

を2回行った結果,5クローンの安定な抗DONモノク

ローナル抗体産生ハイブリドーマをえた.これらのク

ロー;/の産生する抗体をDON.1∼5と名付けた.また,

これらの抗体のアイソタイプはすべてlgGI

・ λであっ

た.

抗体の特性    ‥

‥ ‥

 これらの抗体の特性を明らかにするために,競合的間

接ELISA(HRP/TMBZ法)でのDONの検量線を比較し

た(Fig.2).検出限界を有為に結合阻害がかかる値とし

て15%阻害(85%Binding)に設定し比較した.その結

果,15%阻書に必要なDONの濃度は,それぞれ,・DON.

1が0.08,DON.2が1.0,DON.3が0.10,DON.4が

1.3, DON.

5が1.0・μg/mlであった.

 高感度測定の可能なDON.1と3について,抗体の交

差反応性を検討した(Fig.3).その結果,DON.1と3

ともに15-アセチルDONにそれぞれ267%と333%と強く

H H

-'RI --H

R2

Fig: 3 The structures Qf tfichothecene mycotoxins and cross-reactivity of anti-deoxynivalenol monoclonal antibodies ( DON.1     and DON.3). Trichothecenes

Deoxynvalenbl(DON)

15-AcetylDON

3-AcetylDON

Nivalenol(NIV)

4-AcetylNIV

3,4-Diacetyl

NIV

Tetraacetyl

NIV

T-2 toxintetraol

T-2 toxin

AcetylT-2 toxin

Diacetoxyscirpenol

Neosolaniol

・RI 一 〇H OH OAc OH OH OH OAc OH OH OAc  Side-chainresidues R2  Rs  R4  R5 H  OH OH  =O H  OAc OH  =○ H  OH OH  =○ OH OAc OAc OAc OH OAc OH OH  =O OH OH  =○ OAc OAc OH  =○ OAc・ =○ OH  H OAC  H OAc OAC  H OH OAC OAC  H OH OAC OAC  H OH ISV¨・ ISV H OH

Cross-reactivity of anti-deoxynivalenol monoclonalantibodies

      DON.1 1C5°(ng/mL)‘ Cn)−fatibily(%)“  0.30  0.08  50  3 >60  43 > 6 0   2 2   1 4 > 6 0   1 0 > 6 0 100 267  0.6  10 く0.5  0.7 く0.5  1.4  2.1 く0.5  3 く0.5        DON.3 1C5°(ng/mL)' Qs-rsibity(%)¨  0.30  0.09 〉60  6  30 >60 >60  30 >60 〉60 >60 >60 100 333  <0.5    N Ln LfD¥ O      く LfMXI OI く く0.5 く0.5 4).i く0.5

‘IC5a ; The concentration of required to give 50%inhibition of the antibody binding in the indirect competitive ELISA HRP汀MBZ method.

“;Percent of cross-reactivity relative DON were calculated as amount of deoxynivalenol requirgd for 50%inhibition of binding/amount of

trichothecene myeotoxins required of 50%in!libjtion of bjnding x 100.

(5)

反応し,また,ニバレノこール(NIV)にそれぞれ10%と

6%,T-2トキシンテトラオールにそれぞれ1.4%と1.2

%の交差反応性を示した.DON.1抗体は他にネオソラ

ニオールに3.0%,T-2トキシンに2.1%,3,4-ジアセチ

ルNIVに0.7%および3-アセチルDONに0.6%の弱い交差

反応死を示したが,DON.3抗体はこれらのトリこゴテセ

ン類との反応性は0.5%以下であった.また,他のトリ

コテセン類との反応性はいずれも0.5%以下であったレ

以上の結果から,測定感度の点でDON.1と3はほぼ同

程度であるか,特異性の面では,DON.3が,より特異

的にDONを認識することがわかったので,以下の実験

ではDON.3を実験に用いた,

ALP/NADP法(酵素サイクリング法)によるDONの測定

 日本の小麦中のDONの暫定基準値は1.1μg/gであり,

DONの分析法としては,基準値の1

/10程度,すなわち

100ng/g程度の測定感度を必要とされる.比色法で最も

高感度なELISAである酵素と発色剤の組み合わせ,HRP

とTMBZにおいて,溶液中で100ng/ml程度の測定感度で

は不十分であると予想された.そこで,2次抗体をALP

標識抗体に変え,基質としてNADPを用い生成された

NADをFig.1に示した酵素サイクリング法で有色フォル

マザン化合物を生成させる方法(g)を競合ELISAに初めて

導入した.その結果(Fig,4)。ALP/NADP法の測定感度

は5 ng/mlであり,HRP汀MBZ法での測定感度より,20

倍高感度であった.

120 1 { } 0 8 0    60 % 11u!pu!g 4 0 2 0

裸麦および小麦中のDONの測定

犬ALPZNADP法で裸麦およぴ小麦中のDONの測定への

応用性に付いて検討した.ELISAに適用できる抽出物の

濃度を検討したところ,200mg裸麦または小麦相当量

/mlまでは,抗原抗体反応にあまり影響しないことが認

められた(Table.1).そこで,裸麦およぴ小麦に20∼

2,500ng/gになるようにDONを添加し,柚出後,200mg

裸麦または小麦相当量/mlになるように調製した試料で

の回収実験を行った.その結果(Table.2),20ng/g

DONを添加した場合,裸麦と小麦いずれの場合でも回

収率は120%を超えバラツキも大きかったが,50∼2,500

ng/gの範囲では,回収率は100%前後であり,バラツキ

も少なかった.よって,ALPZNADP法で裸麦およぴ小麦

中のDONの測定感度は,50ng/gであった.

 また,本ELISAで国産の裸麦2検体およぴ小麦18検体

のDONを測定し,GCでの測定値との比較を行った.そ

の結果(Table.3),ELISAの結果20検体中18検体が陽性

で,平均568ng/gであった.GCでの測定値との比較した

結果,相関係数はr2=0.988で高い相関性が認められた.

Table l. Effect of cmde exlracts from naked barley and      wheat on the ALP/NADP method

 Extract equivarent to original sample(mg/ml)   5 0 1 0 0 2 0 0 5 0 0 lnterference* Naked barley 1 1 3土1 1.2S 9士 1.7 6.9士7.1 17.9士14.0 <Wheat  NT** ・ -2.8士3.0 -2.2士。3.0 10.8士12.5

*lnterference were calculated as follows ; the absorbance with

 crude extract/the absorbance with 10%(v/v)methanol

 PBS/Tween −1×100.

*NT ; not tested.

Tal?le 2. Recovery of deoxiliivalenol from naked barley and      wheat on the ALP/NADP method

  Samples Naked barley 0 1 10    100 DON(ng/ml) 1 . 0 0 0 1 0 , 0 0 0

Fig.4 (:;omparison o Fig. I Comparison of standard curves

     with DDON.3  antibody by two indirect

     competitive ELISAs, HRPyTMBZ and ALP尽ADP

     methods.

The -detectionlimits, expressed as concentration giving over 15%

(−)inhibition(5bser'ved in the indirect competitive ELISA,

HRlyrMBZ method,M/ere100 ng/inl (HRP/TMBZ method, 0)

and 5 ng/ml (ALPZNADPmethods,●),respectively. Wheat Deoxynivalenol added(ng/g)    20 ≒    50   100   500   2500 0000 り4rDOO     HLQ       2500, *Mumbers were percentages 士SD(n!==4)

%of pecovery 120土 26* 105 104 103 112 138 108 109 102  92 土 土 土 土 士 土 土 土 土 (gQ   4 1 1 3 1 只り4   9 1 0

(6)

32 香川大学農学部学術報告 第57巻(2005)

Table 3. 、Nationaloccurrenceof aeoxyniva!enol in do       mestic naked barley and wheat

rJ    Samnle    Deoxynivaleno1(ng/g)

`)aluPlc5    nunlberELISA GC Naked barley    1      167 Wheat       2      ND        3      147        4      200        5     1,767        6      153        7      73        8      ND*        9      ND       10     1,333       11     2,600       12      533       13      200       14      164       15      417       16      492       17      291       18      145       19      542       20      429  253   33  126  189 1,900   86  143  NT**  NT 1,320 2,486  467  140   89  398  520  269  320  NT  NT

Detection limits ; ELISA (50ng/g),GC(10ng/g)

*ND ; Not detected. **NT : Nc)t tested.

         考     察

 安定な5つの抗DONモノクローナル抗体産生ハイプ

リドーマを得たが,これらのうち2つのハイプリドーマ

が産生する抗体DON.1と3は耳RP/TMBZ法で100ng/ml

のDONの検出が可能であった(Fig.2).この検出感度を

既報のDONのELISAと比較するとCasaleら‘9’および

Scheideら(10)の200 ng/ml, の21倍高感度であり。

Aboouziedら{山およぴYuanら(121の100ng/mlと同じで

あった.DON.1と3について,抗体の交差反応性を検

討した.その結果(Fig.3),DON.1と3ともに15-アセ

チルDONにと強く反応し・,また,ニバレノール(NIV)

に比較的強う交差反応性を示し,T-2トキシンテトラ

オールにそれぞれ弱い交差反応性を示した.DON.1抗

体は他にネオソラニオールに,T-2トキシン,3,4-ジア

セチルNIVおよぴ3-アセチルDONにも弱い交差反応死を

示したが,D0.N.3抗体はこれらのトリコテセン類との

反応性は0.5%以下であった.以上より,測定感度の点

でDON.1と3はほぼ同程度であるか,特異性の面では,

DON.3が,より特異的にDONを認識することがわかっ

たので,以下の実験ではDON.3を実験に用いた.

 DON.

1 と3を用いた場合HRP7IMBZ法で100ng/mlの

DONの検出が可能であったが,この程度の測定感度で

は,日本における小麦中の暫定基準値1.1μg/gからその

1 /10, すなわち0.1μg/g,程度のDONの検出は難しい

ことが予想された.そこで,より高感度測定の可能な酵

素サイクリング法を導入し,高感度化を試みた.原法(9) では,レ酵素反応を37℃で行っていたが,37℃や室温(25 ℃)で行った場合,極短時間で発色していまい,バラツ キも大きかった.そこで,ALPとNAI)pの反応と,酵素サ イクリング反応を4℃で行うことにより,バラツキなく 反応させることが可能と・なった.酵素サイクリング法を 導入したALPZNADP法では,固相化抗原量と抗DON抗 体量をそれぞれ1 /10に滅らすことが可能であった.そ れ故,少量のDON存在下で固相化抗原と抗DON抗体と の結合を阻害できるようになった.ALP/NADP法での検 出限界は5 ng/mlでHRP/TMBZ法より20倍高感度であり, 既報(9)(lo)(11)(12)のELISAの中で最も高感度であった.  ALP/NADP法で裸麦および小麦中のDONの測定への 応用性について検討した.まず,DON汚染のない国産 裸麦およぴ小麦5gを70%メタノールで柚出し,抽出液 を遠心した上清を一部採り,溶媒を完全に留去し乾固さ せ,残流を10%(v/v)メタノールを含むPBS/Tweenに 溶解し,この溶液をELISA試料溶液とした場合,この試 験溶液にはかなり強く抗原抗体反応を阻害する物質が含 まれていた.そこで,701%メタノール抽出液の上清を一. 晩-20℃で放置し,生じた沈殿を遠心分離したのち,溶 媒を完全に留去し乾固させ,10%(V/v)メタノールを 含むPBS/Tweenに再溶解し,ELISAを行った.その結果, 抗原抗体反応を阻害する物質が減少することが認められ た.また,裸麦および小麦で添加回収実験を行った結果, 2Q∼2,500ng/gになるようにDONを添加し,抽出後,200 mg裸麦または小麦相当量/m1になるように贋製した試料 での回収実験を行った.その結果(Table.2),50∼ 2,-500ng/gの範囲では,DONの測定が可能であった.本 法の検出限界は,50ng/gであり,既報の測定感度と比較 すると,Aboouziedら(11)1,000ng/gの20倍,Scheideら(10) およびTrucksnessら(13)500ng/gの10倍高感度であった. また,本ELISAで国産の裸麦2検体および小麦18検体の DONを測定し,GCでの測定催との比較を行った.その 結果(Table.4),ELISAとGCでの測定値との比較よく一 致し,相関係数はr2=0.988で高い相関性が認められ,本 法が裸麦およぴ小麦中のDONの測定に十分適用できる ことを確認した. マイコトキシンの競合的ELISAに初めて酵素サイクリ ング法を導入することで,20倍高感度なELISAの確立で きることを実証し,酵素サイクリング法が,競合法でも 高感度化に有効であることを明らかにした.また,本 ELISA法は,ほとんどクリーンアップ操作を行う/ことな く

裸麦および小麦中のDONを高感度に測定する方法

であり,今後,DONの汚染検査に広く使用されること

が期待される.

(7)

      要     約

 DON-HG-BSAで免疫したマウスの肺臓細胞とミエ

ローマ細胞を融合することにより,5つの抗DONモノ

クローナル抗体産生ハイプリドーマ(DON.1∼5)を

樹立した.HRP7rMBz法において,DON.1とDON.3

抗体を用いた場合100ng/mlのDONの検出が可能であっ

た.また,酵素サイクリング法を導入したALP/NADP法

では,5ng/mlのDONの検出が可能であり,20倍の高感

度化に成功した.酵素サイクリング法が競合的ELISAで

も高感度化で有用なことを明らかにした.ALPZNADP法

では,ほとんどクリーンナップ操作を行うことなく裸麦

および小麦中のDONを50ng/gまで測定できた.本ELISA

のDONの汚染調査に有効である手法であると期待され

た.

引 用 文 献

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参照

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