革新的農業技術習得支援研修
野菜の難防除病害虫の同定・診断法
タバココナジラミ バイオタイプ判別
研修テキスト
2008 年 10 月 15～17 日実施野菜茶業研究所
野菜 IPM 研究チーム
はじめに
人それぞれの DNA が異なるようにタバココナジラミのバイオタイプ間でも DNA に違いがある。タ バココナジラミのバイオタイプ間では形態により判別が不可能であるために DNA の違いにより， 判別が行われる。タバココナジラミの分子系統解析にはミトコンドリア DNA がよく用いられており， 本研修でもミトコンドリア DNA の COI 領域を用いておこなう。ミトコンドリア DNA は核 DNA に比べ， 塩基置換の起こる速度が 5 倍から 10 倍速いとされており，バイオタイプのような遺伝的に近いも のの判別に適している。その他にも核リボソーム遺伝子の ITS 領域などがよく用いられている が，ミトコンドリア DNA は 1 つの細胞に約 1，000 個含まれているため，少ないサンプルで分析で きる点で有利である。
DNA による系統判別方法
１． 増幅した DNA 断片の遺伝子配列を解析し，データベースと比較 確実に判別でき，他のコナジラミなどが混入しても判別可能が可能であるが，シーケンスに かかる試薬・解析機器が高価で実験者にもある程度の技能が要求される。 全てのバイオタイプの判別が可能 ２． 制限酵素により切断された DNA 断片の長さの違いにより判別（PCR-RFLP 法） PCR-RFLP法の利点は、安定な結果が得られやすく、検査をする人やサンプルの状態、DNA 抽出方法などによって結果が左右されにくいことです。また、手法も比較的シンプルで、DNA シ ーケンサなど高価な解析装置や高度な技術が必要ないことから、様々な検査機関で容易に取り 組めることも挙げられます。 BとQの判別可能 ３． それぞれのバイオタイプの DNA を特異的に増幅するプライマーを混合して，PCR を行うこと により，増幅された DNA 断片のパターンで判別(マルチプレックス PCR) CAPS 法と比較して，制限酵素できる必要がないために省力的であるが，結果がぶれること があるので中が必要である。 B と Q，そしてオンシツコナジラミの判別が可能1. タバココナジラミの採集
野外または飼育ストックからコナジラミを採集する。採集するステージは幼虫，蛹，成虫のい ずれでも良いが，体サイズの大きい成虫または老齢幼虫（蛹）が望ましい。採集した後は-20℃ 程度の冷凍庫に保存するよりもアセトンに浸漬して常温で保存した方が長期間保存できる。文献 ではアセトン浸漬後，2 年の常温保存でも解析が可能とされる。採集したコナジラミは蛹の場合は 寄主植物ごとアセトンに浸漬，成虫の場合はそのままアセトンに浸漬するか冷凍殺虫してからア セトンに浸漬するとよい。長期間保存する場合はアセトンの揮発による乾燥に注意する。2. タバココナジラミから DNA の抽出
コナジラミを抽出用緩衝液中で磨砕後，酵素処理を行い，遠心後，上澄みを DNA 溶液をす る。各社から販売されているキット（ex.QIAGEN DNeasy Tissue Kit）を用いても良いが，当研 究室では簡易法を採用している。 試薬：Proteinase K・・（和光純薬，粉末のものを MillQ 水を用いて溶液としても良いが，当研修室 では ProteinaseK 溶液を使用） Triton X-100（和光純薬） Tween20（和光純薬） 機器：エッペンドルフチューブ（1.5ml） ホモジナイゼーション用ペッスル（フナコシ） ヒートブロック（TAITEC DTU シリーズ） 遠心分離器 ☆コナジラミ核酸抽出用 Buffer(for 96 sample：10ml)
Mill 水：4.66mL，2M Tris-HCl：5ml，Triton X-100：45μL，Tween20：45μL， 20mg/ml Proteinase K 50μL，0.5mM EDTA：200μL
（100μｇ/ml Proteinase K，0.45% Triton X-100，0.45％ Tween20，1 M Tris-HCl，pH8） 手順 1.5ml エッペンドルフチューブにコナジラミと コナジラミ核酸抽出用 Buffer 100μL を入れ， ペッスルで磨砕する。 ↓ ヒートブロックで 55℃－1ｈ，100℃－10min，0℃－5min にインキュベートする （55℃でオーバーナイトした方が成功する） ↓ 遠心 10,000g(12,000rpm）×5min 上澄 2μL を新しいチューブ（0.5ml）に入れ，PCR にかける
3. タバココナジラミのミトコンドリア DNA COI 領域の増幅
試薬：Taq Takara EX Taq（タカラバイオ，出来ればホットスタートバージョン）
プライマー2 種（PCR グレード（粗精製）でも可だが，出来れば簡易カラムまたは HPLC 精製が好ましい）
C1-J-2195 MTD-10 TTG ATT TTT TGG TCA TCC AGA AGT L2-N-3014 MTD-12 TCC AAT GCA CTA ATC TGC CAT ATT A 機器：サーマルサイクラー（これから購入するなら Applied Biosystems 社の PCR System
9700 シリーズがよい） PCR チューブ（0.2ml，8 または 12 連）
☆Master Mix (Ex Taq version for 96 PCR plate)
1 本 100 本 □蒸留水 12.3μL 1230μL □Taq Buffer 2μL 200μL □2.5 mM dNTP Mixture 1. 6μL 160μL □Primer(MTD-10) 10μM 1μL 100μL □Primer(MTD-12) 10μM 1μL 100μL □TaKaRa Ex Taq 0. 1μL 10μL --- Total 18μL 1800μL PCR→Master Mix 18μL＋Template 2μL
☆PCR 条件
95℃ー2min. ↓ 95℃-1min. 47℃-1min. 35サイクル 72℃-90sec. ↓ 72℃-10min. うまくいかないときは，アニーリング温度の検討，酵素を換えてみる4. 制限酵素断片長多型による判別
増幅した DNA 断片をそれぞれバイオタイプを特異的に切断する制限酵素を用いて反応させて， 切断の有無でバイオタイプを判別する。
試薬： 制限酵素 EcoT14I (StyI) （タカラバイオ，東洋紡など） StuI （タカラバイオ，東洋紡など）
制限酵素： EcoT14I (StyI) StuI
バイオタイプ Q を切断 バイオタイプ B を切断 1 本 DDW 3.6μL １０X buffer 1μL 制限酵素 0.4μL PCR 反応液 5μL ――――――――――――――――― Total 10μL 反応液を 37℃，2 時間インキュベートする。
5. DNA 断片の電気泳動
PCR 産物をアガロースゲルで電気泳動して確認する。期待される PCR 産物のサイズは 819bp で ある。
試薬：Agarose, Type I Low EEO (Sigma)
DNA Ladder Markers （200 bp DNA Ladder，タカラバイオ） 機器：Mupid-exU （アドバンス)
プリントグラフ（アトー） ゲルの作成
Agarose 0.6g に TAE または TBE 緩衝液を 60ml 加え，電子レンジで加熱溶解。 人肌程度に冷めたら，エチジウムブロマイド（有害！注意） 3μL 加える ゲルトレイをセットしたゲルメーカーにゲル溶液を注ぎ，コームを挿す 固まるまで放置 PCR 産物の電気泳動 あらかじめ，ローディングバッファーを 1μL ずつ PCR チューブに分注しておく PCR 産物をローディングバッファーの入った PCR チューブに 2μL ずつ加える ピペッティングで撹拌した後，ゲルのウェルに注意深く入れる（両端はあける） 両端のウェルにマーカーを 1μL ずつ入れる 100V で電気泳動（20 分ぐらい？） プリントグラフで写真撮影
6. PCR 産物のクリーニング
シーケンスを行う場合（3 より続く）
PCR 産物をフィルターを用いて余剰のプライマーなどを除く。 機器：バキュームマニホールド （ミリポア） Montage PCR （ミリポア） 塩基泳動後の残りの PCR 反応液全量を Montage PCR にアプライ DW 120μL を加え，ピペッティングで撹拌 吸引濾過 (バキュームマニホールドを用いて) ↓ DDW 20μL を加える（DDW は必ずフィルターの上に注ぐ） ボルテックス 1～5min．（LOW からスタート次第に速度を上げる） DNA 溶液を 96 穴 PCR プレートに移す→保存7. シーケンス反応
増幅した DNA 断片を蛍光色素を結合させたダイデオキシ NTP を基質にサイクルシーケンス反 応を行い，様々な長さの蛍光色素で標識された DNA 断片が作成される。これをシーケンサでキ ャピラリ泳動し，レーザー光で読み取ることにより，DNA 配列を決定する。
試薬：BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit （AB 社） プライマー2 種（簡易カラムまたは HPLC 精製以上）
C1-J-2195 MTD-10 TTG ATT TTT TGG TCA TCC AGA AGT L2-N-3014 MTD-12 TCC AAT GCA CTA ATC TGC CAT ATT A 機器：サーマルサイクラー（Applied Biosystems 社の PCR System 9700 シリーズ） 遠心器（プレートを遠心できるもの） クリーニングした PCR 産物を AB 純正のプレートに 2μL アプライする 40℃のインキュベータ中で反応液を蒸発させる シーケンス用マスターミックスを 5μL ずつ分注する シーケンス反応（必ず，ABI 純正サーマルサイクラーを使用すること） 96℃－1min. ↓ 96℃－10sec.
50℃－5sec. 25サイクル 60℃－4min. ↓ 4℃－∞
☆シーケンス用マスターミックス (フォワード） for 48 本 for 48 本 for 1 本 10×BigDye 40 Buffer 22.8 0.475 MilliQ 水 208.32 4.34 Primer（Mtd10） 7.68 0.16 BigDye 9.6 0.2 --- Total 248.4μL ☆シーケンス用マスターミックス (リバース） for 48 本 for 48 本 for 1 本 10×BigDye 40 Buffer 22.8 0.475 MilliQ 水 208.32 4.34 Primer（Mtd12） 7.68 0.16 BigDye 9.6 0.2 --- Total 248.4μL
●シーケンス前処理
マジックソリューションを反応液の 2.5 Vol.（12.5μL）ずつ分注する 遠心機で遠沈する（8000rpm，30min.） ↓ キムタオルを敷き，裏返して遠心(1000rpm，45sec.) ↓ 40℃のインキュベータ中でマジックソリューションを蒸発させる ↓ Formamide を 10μL ずつ分注する シーケンサで解析する。８．シーケンス解析方法
準備編
1.シーケンス結果をネットワーク上のシーケンス室のパソコン(Seqcenter)から落としてくる。 2.ATGC を起動
3.File-Wave convert
Add from folder で落としてきたシーケンス結果を指定 適当なフォルダーを作成して Output folder に指定する 解析編 1.ATGC を起動 2.File－New project 新しいプロジェクトに適当な名前を付けて適当な場所に保存する 3.File-Add sequence
Add from folder で準備編で変換したシーケンスの入ったフォルダーを指定 4.Analyze-Assemble all お好みで Preference をいじった後，Execute 5.Config が表示される 各 Config.の前の＋をクリックして，アセンブルの結果を表示させる 上に表示されている Consensus Sequence の信頼性の高いところ部分をコピー 6.新しい Text File を作成して，名前を付けて，ペースト 書式 >配列名 1 配列データ 1 >配列名 2 配列データ 2 Blast 編 1. ブラウザで DDBJ を立ち上げる 2. 検索解析の Blast をクリック (ア) File Upload から解析編で作成したシーケンスのテキストファイルをアップロード (イ) 検索結果の受信用にメールアドレスを指定して→入力内容の送信 (ウ) メールで解析結果の URL が送られてくる
９．コナジラミのマルチプレックスPCR
（2から続く） 使用するプライマー ミトコンドリア16S フォワード側 16S-Fsimon（コナジラミ用）CCGGTTTGAACTCAGATCATGT（65℃） 16S-FSPTV（オンシツコナジラミ） GTGATGTTAATTGTTGGCG (59℃) 16S-FSPQ（タバコQ 系統）ATTAACTAAATGATATTAAATC(46℃) リバース側 16S-Rsimon（コナジラミ用） CGCCTGTTTAACAAAAACAT（59.1℃） ミトコンドリアCO1 フォワード側 CO1-FSPB (タバコB 系統) CACTATAATTATTGCTGTTCCC(56.8℃) リバース側 L2-N-3014（コナジラミ用）TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA(64.9℃) 調整例（10 本分） 数量（ul）（プライマーの比率）☆Master Mix (Ex Taq version for 96 PCR plate)
1 本 100 本 □蒸留水 8.0μL 800μL □Taq Buffer 2μL 200μL □2.5 mM dNTP Mixture 1. 6μL 160μL □16S-Fsimon 0.35μL 35μL □16S-SPTV 0.7μL 70μL □16S-FSPQ 1.4μL 140μL □16S-Rsimon 2.45μL 245μL □CO1-FSPB 0.7μL 70μL □L2-N-3014 0.7μL 70μL □TaKaRa Ex Taq 0. 1μL 10μL --- Total 18μL 1800μL
☆PCR 条件
96℃-10min. ↓ 92℃-1min. 46℃-1min. 35サイクル 72℃-90sec. ↓ 72℃-10min. うまくいかないときは，アニーリング温度の検討，酵素を換えてみる 5.と同様に電気泳動 電気泳動パターン1
平成 20 年度 革新的農業技術習得支援研修
野菜の難防除病害虫の同定・診断技術
平成 20 年 10 月 15 日（水）～17 日（金）
＊PCR 法によるトマト黄化葉巻病の診断
＊ティッシュプリント法によるトマト黄化葉巻病の診断
野菜茶業研究所・野菜 IPM 研究チーム2
１. PCR 法によるトマト黄化葉巻病の診断
PCR 法を用いてトマト黄化葉巻病の病原ウイルス
Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCV)のトマト葉からの検出を行い、本病の診断を行う。TYLCV は一本鎖の DNA をゲノムとして持ち、 感染細胞中では多量のゲノム DNA を複製することより、PCR 法ではウイルス DNA を標的として特 異的なプライマーを用いて検出を行う。本診断法では、①植物サンプルからの DNA 抽出、② TYLCV に特異的なプライマーを用いた PCR、③電気泳動法による PCR 診断結果の判定を行う。 （参考文献など） トマト黄化葉巻病の簡易診断：平成 11 年度九州農業研究成果情報（九州農業試験場・ 地域基盤 研究部・病害遺伝子制御研） ① 植物サンプルからの DNA 抽出 ＜試薬・消耗品・備品など＞ ◆DNA 抽出用緩衝液 (500 mM NaCl, 50 mM EDTA, 0.1%メルカプトエタノール,pH の調整は必要ない) ◆10% SDS ◆5Ｍ 酢酸カリウム ◆1.5 mL チューブ ◆ピペットマン(200μL、1000μL)同等品 ◆イソプロパノール ◆70% エタノール ◆滅菌蒸留水 ◆ボルテックスミキサー同等品 ◆ホモジナイザー ◆65℃の恒温機 ◆微量高速遠心機
3 ＜手順＞ ＜手順＞ 1 1.5 mL チューブに、葉片入れる*1 *１ チューブのふたでピンチしても可。 ふたの内側は素手で触らないこと。 葉片の大きさは、チューブの口径く らい(～0.5cm2)が適しているが、～３ cm2まで OK。 2 ビーズと DNA 抽出用緩衝液 500μL を入れる*２ 3 10%SDS を 50μL 加え、よく混ぜる（ボルテックスなど） 4 スピンダウンして、ふた内側についた液をチューブ底に落す *２ ビーズは各チューブとも、ほぼ同数 入れること。 5 葉片を破砕する*３ 6 65℃で 10 分間反応 *３ ホモジナイザーまたは、乳鉢で葉を 破砕してもよい。 7 5Ｍ酢酸カリウムを 160μL 加え、よく混ぜる（ボルテックスなど） 8 クロロフォルムを 10～20μL 加える *４ この時点で、白く濁ってくることを確 認する。 濁らない場合は⇒ ＊酢酸カリウム添加後の混合が足 りない。 ＊氷上での静置時間を延ばす。 9 氷上に 5 分間程度静置*４ 10 10,000 x g、10 分間遠心、４℃*５ 11 上澄み約 450～500μL をピペットマンを使って、新しいチューブに移す 12 同量(450～500μL)のイソプロパノールを入れ、よく混ぜる 13 10,000 x g、5 分間遠心 *５ 冷却しながらの方が、沈殿がよくパ ックされる。 14 上澄みを捨て、沈殿に 500μL の 70%エタノールを加え、軽く混ぜる 15 10,000 x g、5 分間遠心 *６ 減圧乾燥または、37～50℃程度で 加熱乾燥 16 上澄みを捨て、沈殿を乾燥させる*６ 17 50-200μL の滅菌蒸留水に溶解*７ *７ 加熱しながら１～２時間程度溶解、 または４℃で over night でも可。 18 -20℃で保存 ＜各手順における Tips＞ 1-3. 植物組織は多すぎると、DNA の回収率及び精製度が下がるので、少なめの方がよい。 PCR による増幅を行うので、高濃度な DNA でなくとも検出が可能である。
3. 消泡剤（Antiform Y-30, sigma, カタログ番号：A5758 など）を使用する場合は、予め必要量の SDS を抽出緩衝液に加えてもよい。
8. クロロフォルムを加えると、タンパク質・多糖類などの沈殿がきれいにパックされる。
12. イソプロパノールの持ち越しがあると、PCR がうまくいかないことがあるので、ここでは 70%エタ ノールによるリンスを入れている。この操作で、イソプロパノール、塩などが除去される。
4 ② TYLCV に特異的なプライマーを用いた PCR TYLCV 検出用のプライマーは、その目的に応じて幾つかのものが報告されている。 下記の３種類のプライマーを用いた PCR 検定により、系統判別までの診断が可能であるが、 TYLCV の検出のみを目的とする場合には、１種類のプライマーにより概ね判定することができる。 ＜試薬・消耗品・備品など＞
◆PCR 用酵素：TaKaRa Ex Taq HS polymerase
同等品でも可能だが、事前に反応条件の検討が必要。 ◆PCR 装置 ◆PCR 用チューブ ◆検出用プライマー プライマー 配列 Tm 値 増幅サイズ TY v CTCGAAGGTTCGCCGAAGG 60.4 1.3 kbp TY c TTGAAAAATTGG(A/G)CTCTCAA 48.0 NTG v CTCAAAGCTCTATGGCAATC 54.2 2.7 kbp NTG c GACTTCATTGATTTTGGAGT 50.2 STG v TGACCAAGATTTTTACACTTA 48.7 2.7 kbp STG c AAACACCGTCGACTGGGGTGA 60.5 TY v/c: 国内で発生している TYLCV を概ね検出可能 NTG v/c: イスラエル系統判別用 STG v/c イスラエル・マイルド系統判別用 PCR 反応液組成 １tube DNA 1μL 10 X Ex Taq HS buffer 2μL 2.5mM dNTP mixture 1.6μL 10μM primer 1μL 10μM primer 1μL TaKaRa Ex Taq HS polymerase 0.1μL
H2O 13.3μL
5 PCR 反応条件
TY プライマーの場合 NTG/STG プライマーの場合 94℃, 180 sec 95℃, 180 sec
94℃, 30 sec 94℃, 60 sec
55℃, 30 sec 35-40 cycles 58℃, 60 sec 35-40 cycles 72℃, 90 sec 72℃, 180 sec 72℃, 7 min 72℃, 10 min 4℃ 4℃ ＜Tips＞ 葉片から抽出された DNA 量は十分量あるのに、PCR で目的とするバンドが出ないことがある。こ の原因は、PCR 反応が抽出 DNA に含まれる阻害物質等により妨げられていることが多い。PCR に加えるテンプレート DNA を 100 倍程度希釈して用いると、PCR 反応が改善される場合がある ③ 電気泳動法による PCR 診断結果の判定 上記で得られた PCR 産物をアガロースゲル電気泳動により確認する。 20μL の PCR 反応液より、1-2μL 取りサンプル緩衝液を混合し電気泳動を行う。 ＜試薬・消耗品・備品など＞
◆アガロース（電気泳動用 Sigma Type II-A など）
◆ゲル作成器及び、泳動装置
◆泳動緩衝液：50 x TAE（2M Tris, 0.05M EDTA, 2M 酢酸）
◆エチジウムブロマイド：10mg/ml の水溶液を作成し、ゲル染色時に 2 μg/ml に希釈する。 ◆分子量マーカー（安価なものでかまわない。東洋紡の 200bp ラダー等は、6 x Loading Dye が添付されている） ＜手順＞ 1. アガロースゲルの作成 0.8-1%(w/v)の濃度になるように、泳動用緩衝液（1 x TAE）中に溶かし、ゲル作成器にてアガ ロースを固める。 2. ゲルが固まったら、1 x TAE 緩衝液を満たした泳動装置にゲルを設置 3. PCR 産物を 2μL 取り、同量（2μL）の 2 x Loading Dye と混合し、ゲルのレーンへサンプルを のせる。 3. 100V で 30~40 分間泳動 4. エチジウムブロマイド溶液（2 μg/ml）にてゲルを染色後、バンドを観察する。
6 ２. ティッシュプリント法によるトマト黄化葉巻病の診断 診断の正確性と位置づけ 現在入手可能な TYLCV に対する市販抗体は、近縁なタバコ巻葉ウイルスとも反応することより ウイルス種を判定するには正確性が低い。診断を進めて行く上での本法の位置づけは、「ジェ ミニウイルス属(TYLCV 及びバコ巻葉ウイルスなど)による感染の有無」を確認する手法とする のが最も妥当性があることより、１次スクリーニングとして導入することが望ましい。診断の確 定には、本法のみではなく他の診断法による結果を考慮し、総合的に判定することが必要。 １次スクリーニング （TPI 法または LAMP 法） 陽性反応 2 次スクリーニング （遺伝子診断） 陰性反応 陽性反応 診断確定
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ティッシュプリント法（Tissue Print-Immunoblotting：TIP）は、抗体持つ特異性を利用して検 定試料中のウイルスタンパク質を直接検出する血清学的手法である。安価に同時処理でき、 簡易迅速な診断が可能な方法である。トマト黄化葉巻病の病原ウイルス Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)の罹病トマトからの検出・本病の診断を行う簡易迅速診断法として、現在 (2008/10/15)入手可能な市販抗体を用いてティッシュプリント法を行う。
＜試薬・消耗品・備品など＞
◆１次抗体：抗 TYLCV 抗体
TYLCV reagent set, Neogen Europe(旧 Adgen), 500 units, 品番 1072-05, \67,000 ◆２次抗体：アルカリフォスファターゼ(AP)標識抗マウス IgG ヤギ抗体
Sigma, 0.5mL, 品番:A9919, \21,200 ◆ブロッキング緩衝液：<Tips>２－２）を参照
◆TTBS：20mM Tris-HCl(pH7.4)-0.15M NaCl-0.1% Tween 20 ◆発色緩衝液：100mM Tris-HCl(pH9.5)-100mM NaCl
◆アルカリフォスファターゼ基質液（NBT/BCIP 溶液を使用直前に発色緩衝液にて調製） ◆ニトロセルロースメンブレン
GE ヘルスケア, Hybond-C Super, 1 roll(20 cm×3 m), 品番 RPN203G, \24,000 ◆パラフィルム
◆ピペットマン(200μL、1000μL)同等品 ◆メスまたはカミソリなど
8 ＜手順＞ １．サンプルのブロット １－１） メンブレンに鉛筆などで区画線を書き、サンプル ID が分かるようにする （メンブレンには指紋などがつかないようにする） １－２） カミソリなどを用いて、感染植物の小葉の茎などを切る （サンプルごとにカミソリは新しいものに交換する） １－３） 切断面をメンブレンに軽く押し当てる。 （必ず健全植物も同じメンブレンにブロットし、陰性コントロールとすること） （跡が付くくらい押し当てると、非特異反応が出る。極微量で十分に検出できる） １－４） 5 分程度乾燥させる ２．抗原抗体反応 ２－１） TTBS でメンブレンをすすぎ、表面のゴミや色素を出来る限り洗い流す ２－２） ブロッキング緩衝液にてメンブレンをブロッキング（室温・30-60 分間） ２－３） １次抗体をブロッキング緩衝液で希釈（10000 倍希釈）する ２－４） パラフィルム上に抗体液をとり、メンブレンを浸す（室温・30-60 分間） ２－５） メンブレンを TTBS 中で洗浄（5-10 分間・2-3 回） ２－６） ２次抗体をブロッキング緩衝液で希釈（10000 倍希釈）する ２－７） パラフィルム上に抗体液をとり、メンブレンを浸す（室温・30-60 分間） ２－８） メンブレンを TTBS 中で洗浄（5-10 分間・2-3 回） ３．発色反応・判定 ３－１） メンブレンを発色緩衝液で洗浄（5 分間・1 回） ３－２） 用時調整したアルカリフォスファターゼ基質液にて発色沈着反応（～30 分） ３－３） 蒸留水でメンブレンを洗浄し、発色反応を停止する ３－４） 判定 サンプルのブロット 洗浄 ブロッキング １次抗体反応 洗浄 ２次抗体反応 洗浄 発色 判定
9 ＜Tips＞ １－４） → 乾燥後に４℃乾燥状態で保存可能（経験的には１ヶ月程度） ２－２） → ブロッキングには様々な試薬がある。本演習では下記に示したブロッキン グ液を用いるが、参考の為に他の試薬も示す。 ＜ブロッキング液１：本演習で使用＞ ◆1% ブロック-TTBS (1% Block reagent-TTBS) 10% Block reagent のストック溶液を終濃度が 1%になるように、TTBS に溶かす。 ◆10% Block reagent ストックの調製
Block reagent(ロッシュ, 50g, \11700, Cat. No. 11 096 176 001)の粉末を終濃度が 10%とな るように 0.1M マレイン酸-0.15M NaCl, (pH7.5)に良く懸濁してから加熱して溶解。オートク レーブをして完全に溶解させる。分注して冷凍保存。 （長所）大抵の場合はこの方法で対応できる。 イムノグロブリン成分が入っていないか、酸加水分解さえているので非特異的 反応が低く、AP や POD など各種酵素活性を阻害しない。内容物が明らかでは ないが、カゼインと界面活性剤が入っていると思われる。 （短所）溶解しにくく、価格がやや高価。 ＜ブロッキング液２：参考用＞ ◆1-5%正常血清-TTBS ２次抗体を作った動物種の正常血清(Normal serum)を終濃度 1-5%となるように TTBS に て希釈する。例えば、２次抗体がヤギにて作製された抗体ならば、正常ヤギ血清を使用 する。 （長所）古典的な方法であるが、効果的。 （短所）高価な場合があるが、抗体を作製した経験のある機関では手に入りやすい。 イムノグロブリンが主成分であるために、抗原やサンプルによって非特異反応 が抑えられない場合がある。 ◆３－２） → 各メーカーより混合調製された基質液が販売されている。 自前で調製する場合は下記を参照のこと。
＊ 基質液Ａ：0.033% NBT(nitro blue tetrazolium: Sigma, 5g, N6876)となるように緩 衝液(100mM Tris-HCl(pH9.5)-100mM NaCl-5mM MgCl2)に溶解
＊ 基質液Ｂ：5% BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate: Sigma, 1g, B8503) と なるようジメチルホルムアミドに溶解
