戦略的創造研究推進事業 CREST

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戦略的創造研究推進事業ＣＲＥＳＴ

研究領域

「医療に向けた化学・生物系分子を利用した

バイオ素子・システムの創製」

研究課題

「生体分子間相互作用を連続的に検出するための

多機能型水晶発振子マルチセンサの設計と開発」

研究終了報告書

研究期間平成13年10月～平成19年３月

研究代表者：岡畑恵雄

（東京工業大学フロンティア創造共同研究

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１研究実施の概要

本プロジェクトでは、（Ａ）生体内での複雑で動的な分子間相互作用や反応の定量的解析、（Ｂ）そのための多機能でかつ高感度な水晶発振子マイクロバランス法の開発、を２本の柱として研究を推進した。水晶発振子は、電極上に物質が吸着することにより振動数が低下することが知られている。約 1 ng の物質が吸着すると 1 Hz 振動数が減少することからマイクロバランス（微量天秤）として、これまでは主に気相中でガスセンサーとして使われてきた。岡畑らは、１９９０年頃から水晶発振子マイクロバランス（QCM）を用いて水中で生体分子間相互作用を測定する研究を開始し、そのために水晶発振子の片面被覆や発振回路の改良を重ね、水中で±2 Hz の精度で測定できる装置を開発した。図１水晶発振子を用いる生体分子間相互作用の定量化この装置を用いて図１に示すように、細胞膜などの糖脂質から水面単分子膜を作製し、水晶発振子を水平に押しつけることによりタンパク質（レクチン）の結合が振動数減少（重量増加）として見られること、QCM 基板上に１本鎖 DNA を固定化すると相補的な DNA の結合（ハイブリダイゼーション）が見られること、二本鎖を固定化したときには塩基配列選択的なタンパク質（転写因子）の結合が見られること、ペプチドを固定化するとペプチドーペプチド間相互作用がナノグラムレベルの重量変化として追跡できること、などを明らかにしてきた。本研究プロジェクトでは、従来の研究成果を基にして、単純で静的な１：１の分子認識ではなく、（A）生体内での複雑で動的な分子間相互作用や反応の定量的な解析法を確立する、（B）そのための多機能でかつ高感度な水晶発振子マイクロバランス装置を開発する、という目標を掲げて研究を推進し、以下の成果を挙げた。（A）複雑で動的な分子間相互作用や反応の定量的な解析

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制限酵素などが使われてきたが、いずれもその生成物をＲＩラベルしたゲルシフトアッセイから検出する方法が主で、酵素反応過程を追跡した例はほとんどなかった。図２に示すように、ＤＮＡ固定化ＱＣＭを用いれば、ＤＮＡポリメラーゼによるテンプレート鎖に沿ったＤＮＡ伸長反応や、リガーゼによるＤＮＡ結合反応などが振動数減少（重量増加）として、観察できた。また、Ｅｘｏ型ヌクレアーゼによるＤＮＡ鎖先端からの加水分解反応や、制限酵素による部位特異的な切断反応が振動数増加（重量減少）として観察できた。いずれも経時変化から酵素のＤＮＡ鎖への結合、反応（伸長あるいは切断）、酵素の離脱の各反応速度を精度良く求めることが出来た。（２）糖鎖上での酵素反応の解析ＤＮＡ上での酵素反応は、ＤＮＡがポリアニオンであり、紫外領域に吸収を持つことからゲルシフトアッセイや分光法で反応追跡が可能である。しかし糖鎖は紫外吸収が弱く、酵素反応を連続的に追跡することは難しく、これまでは生成物を比色定量するぐらいしか方法がなかった。 QCM 上にアミロペクチン糖鎖を固定化し、糖加水分解酵素であるグルコアミラーゼを加えると図２下と同じように、振動数の増加（重量減少）が観察され糖鎖が切断されていく過程が追跡できた。振動数変化のカーブフィッティングを正確に行うことにより、酵素の糖鎖への結合と解離速度（ko nと ko ff）および解離定数（Kｄ）と糖鎖切断速度（kca t）が求められた。これらの動力学定数は従来の Michaelis-Menten 式では求められなかった値である。（３）タンパク質上での酵素反応の解析 QCM 基板上にタンパク質としてミオグロビンを固定化し、タンパク質の C 末側から切断できるカルボキシペプチダーゼを加えると、図２下側と同じような振動数変化が見られ、酵素による切断反応が観察できた。DNA 図３ QCM 上に固定化した KcSA カリウムイオンチャネルへのチャネルブロッカーペプチドの結合図２ＱＣＭに固定化したＤＮＡ上での酵素反応

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や糖鎖に比べてタンパク質は３次元構造があり、ｐH 変化などにより基質であるタンパク質の構造が変化すると反応性が大きく変化した。（３）膜タンパク質上での分子認識これまで膜タンパク質はリポソームなどに再構成してその反応を見るのが一般的であったが、QCM を用いれば平面基板上に脂質膜に可溶化した（安定化した）状態で固定化でき、膜タンパク質に対する各種リガンドの結合を重量変化として追跡できた（図３）。（４）リボソームでの翻訳過程の定量化 mRNA の遺伝情報に従ってリボソーム上でタンパク質に翻訳される。翻訳開始過程には１０種以上のタンパク質因子や酵素が関与し、複雑な分子間相互作用を行っている。QCM 上にｍRNA を固定化し、リボソームの結合過程や開始複合体の生成過程を観察した。従来は、７０S リボソームは一度３０S と５０S に解離して３０S がｍRNA の Shine-Dargalno（SD）配列に結合すると考えられていたが、別ルートとして、７０S が解離せずにそのまま SD 配列に結合して開始複合体を形成する経路があることが示唆された（図４）。これまでリボソーム翻訳過程は種々の分子が複雑に関与して定量的な議論がなされてこなかったが、QCM 法を用いることにより重量変化として翻訳過程が解明される日も近い。（５）生体分子の分子構造やコンフォメーション変化の定量化これまでの QCM は、水晶発振子を発振回路で強制発振させたときの振動数変化を追跡したものであったが、ネットワークアナライザー法を用いて周波数スキャンすることにより発振ピークを解析して、周波数シフト値（ΔF）とエネルギー損失値（ΔD）が同時に求められる。これらの値から基板上に固定化した分子の粘弾性や水和の状態が求められることがわかった。（B）多機能でかつ高感度な水晶発振子マイクロバランス装置の開発上で述べたような複雑で動的な生体分子間相互作用を定量的に解析するために、QCM 装置の安定化（ドリフトの低減）、高感度化（ノイズレベルの低減）、微量サンプルの測定に適した低容量化を実図４ mRNA 固定化 QCM 上での翻訳開始複合体の形成過程

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第３世代ではバッチ式ではあるがセル容量を８ mL から 0.5 mL にし、一度に４個測定できる４チャネル化した。第４世代ではマイクロ流路に QCM を組み込んで、セル容量を 10μL にしてフローセル化した。この事によりノイズレベルが１／２０になり、高感度化が達成できた。図５ QCM 装置開発の経緯

２研究構想及び実施体制

(1) 研究構想本研究プロジェクトをスタートする前に、我々は水晶発振子マイクロバランス法は水溶液中で DNA やタンパク質上での生体分子間相互作用を定量出来る優れた方法であることを見出していた。図１に示したように脂質膜−タンパク質間、DNA-DNA 間、DAN-タンパク質間などの静的で単純な分子認識がナノグラムレベルで定量できた。表１に、これまでの生体分子間相互作用を測定する手法をまとめた。従来のゲルシフトアッセイ法やＥＬＩＳＡ法は定性的で、なおかつ生体分子をＲＩや蛍光分子で修飾する必要があった。近年は被修飾で定量的に分子間相互作用が検出できる、マイクロカロリメトリ法や表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法が注目されるようになったが、ＱＣＭ法は、これらに比べて結合量をナノグラムレベルで定量出来る、経時変化から結合の動力学が求められるなどの特徴がある。すなわち結合の絶対量をナノグラムレベルで検出でき、結合の経時変化を追跡できるので、より複雑で動的な生体分子間相互作用を定量的に解析することが出来ると考えた。

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（A）動的な酵素反応の解析動的な生体分子間相互作用として、酵素反応を選んだ。下式に示すように酵素は基質を取り込んで分子内で反応し、基質を放出する。酵素反応はこれまでは、反応中間体である酵素・基質（ES）複合体の濃度を直接に求めるのが困難であったことから、生成物（ P1 と P2 ）の生成速度から Michaelis-Menten 式を用いた反応解析を行ってきた。生成物の追跡にはゲルシフトアッセイや分光学的方法が主に用いられてきたが、早い反応や正確な動力学を求めることは困難であった。QCM 法を用いて基板上に基質を固定化すれば、酵素の基質への結合過程は重量増加として検出でき、ＥＳ複合体内での基質の分解反応は重量減少として、反応後の酵素の脱離も重量減少として追跡できるので、酵素反応の各過程を定量的に解析する方法として適していると考えた。基質としてＤＮＡ、糖鎖、タンパク質を選べば各基質上での酵素反応が解析できる（森グループ）。（B）膜タンパク質上での分子認識生体分子間相互作用の大半は細胞膜上の膜タンパク質でおこっているが、膜タンパク質を界面活性剤を用いて単離することの困難さや脂質膜との再構成の困難さなどのために、その機能解析はほとんど進行していない。水晶発振子基板上に膜タンパク質を脂質膜に可溶化して安定に固定化できれば、シグナル分子の結合が重量変化として検出できる。この場合、ＱＣＭ基板上への膜タンパク質の

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（C）タンパク質翻訳系での複雑な分子認識ｍＲＮＡの遺伝上を基にしたタンパク質翻訳系は分子レベルでも解析されるようになり、最近は細胞を用いずに細胞からの抽出成分のみの pure な系でタンパク質の発現が可能になってきた。ｍＲＮＡにリボソームと多くの開始因子が結合して開始複合体が作製されて翻訳が進行するのであるが、開始複合体の形成メカニズムもまだ分子レベルで解明されてはいない。複雑な分子間相互作用の解析として、リボソーム翻訳系に注目した。ｍＲＮＡを発振子上に固定化すれば、リボソームや種々の開始複合体の結合過程を重量変化として解析できると考えた。これまでの教科書的な開始経路以外の経路も発見できることを期待している（古澤グループ）。（D）生体分子の粘弾性の測定これまでのＱＣＭ装置は発振回路を用いて発振子を強制発振させ、物質が吸着したときの振動数変化から物質の化癒着量を測定してきた。水晶発振子はネットワークアナライザーにつないで周波数スキャンすると共振周波数でコンダクタンスが最大になる。発振子上に硬い膜が乗った場合にはピーク形状を変えずに低周波数側にシフトするだけであるが（図６左）、柔らかい膜が乗った場合には、柔らかい膜は発振子と一緒に振動しないのでエネルギー損失がおこる。このときにピーク幅が広がって低周波数側にシフトする（図６右）。この事を利用すれば、発振子上の乗った分子の硬さ・柔らかさ（粘弾性）や反応に伴うタンパク質のコンフォメーション変化が定量化できる。ネットワークアナライザー法を用いることにより、質量変化のみならず分子のコンフォメーション変化も追跡できることになる（川崎グループ）。（E）水晶発振子測定装置の開発酵素反応や複雑な生体分子間相互作用を解明するためには、高感度で安定性の高い水晶発振子測定装置が必要である。ＡＴカットの水晶発振子はズレ振動していることから温度に対しては敏感で、これがしばしば発振子の安定性に影響を与えてきた。温度に対する安定性は水晶のカット角で決まり、これまでは AT カット発振子は 35°15′のものが使われてきた。しかしこのカット角は空気中での温度安定性に優れたカット角ではあるが、水中では必ずしも温度安定性が良いわけではない。しかし発振子は数十万個単位で生産され、カット角を変えるのは数百万円のコストがかかり、これまでは 35°15′のカット角の発振子を水中でだましだまし使ってきたのが現状である。水中でより安定な水晶発振子を得るためには水中の粘度と図６ネットワークアナライザーを用いた水晶発振子の周波数スキャン

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密度の温度係数を考慮した発振子を設計することが必要である。コンピュータ解析により水中で安定なカット角が 35°59′付近にあることが予想できるようになったので、発振子メーカーの協力を得て、35° 30′から 35°60′のカット角の異なる発振子を試作する事を計画した（吉嶺グループ）。装置としては、これまで発振回路やセル回りの温度制御などが手作りであったために、安定性やドリフトなどに問題があった。発振回路をワンチップ化する、周波数カウンターを基盤にして装置内に組み込む、温度制御を±０．1°C から±０．０１°C に向上させる、セル容量を８ mL から 0.5 mL に低容量化する、などの改良を計画した。また、これまでのバッチ式から、マイクロ流路に組み込んだフローセル型の作成も計画した（吉嶺グループ）。 (2) 実施体制 ※このグループは、共同研究者（ＪＳＴの定義による）ではない。当チームは、ＪＳＴの定義上は１グループ編成である。森俊明グループ東京工業大学生命理工学部水晶発振子上での酵素反応を担当川崎剛美グループ東京工業大学生命理工学部生体分子の粘弾性測定を担当古澤宏幸グループ東京工業大学フロンティア研究センター複雑な生体分子間相互作用の測定担研究代表者岡畑恵雄水晶発振子測定装置の開発を担吉嶺浩司グループ東京工業大学フロンティア研究センター（科技振研究員）

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３研究実施内容及び成果

３．１水晶発振子上での酵素反応の解析（森俊明グループ） (1) 研究実施内容及び成果

（A）DNA 上での酵素反応解析：DNA ポリメラーゼの場合＜目的＞

これまで DNA ポリメラーゼの反応は DNA を RI ラベルして伸長した DNA をゲルシフトアッセイで分析してきた。しあこれでは生成物を追跡しているだけなので、酵素反応の反応機構は観察できていない。水晶発振子は電極上でのナノグラムレベルの重量変化を振動数変化として追跡できるので、基板上に突出末端をもつＤＮＡ二本鎖を固定化し、ポリメラーゼとモノマーを加えたときの振動数の経時変化から酵素の結合とＤＮＡ鎖の伸長反応と酵素の伸長鎖からの脱離の各過程を追跡できる。＜実験方法＞ 27MHz 水晶発振子の金電極表面にビオチン - アビジン法を用いて図７に示す突出末端をもつ DNA 二本鎖を 120 ng(6 pmol /cm2_{)を電極面積の 15%に固定} 化した。大腸菌由来のポリメラーゼ（ Klenow fragment ）、ついでモノマー（dATP と dGTP ）を水溶液中に加えた時の振動数の経時的変化を追跡した。＜結果と考察＞突出末端をもつＤＮＡを固定化した水晶発振子の入った水溶液中にポリメラーゼを、ついでモノマーを添加したときに典型的な振動数変化を図８に示した。酵素を添加したときの振動数の減少(重量増加、step A)とモノマーを加えたときの振動数の減少 (重量増加、step B)とそれに続く振動数上昇 (重量減少、step C)の 3 段階が観察できた。これらの挙動は以下のように解析でき、それを模式的に図９に示した。

図８ポリメラーゼ、ついでモノマー（dATP と dGTP）加えたときの振動数の経時変化（ 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl2, 40 mM KCl, 30 ℃）

Polymerase, then monomers , dATP / dGTP

DNA = 120 ng cm -2_{( 6 pmol cm} -2₎

c.a. 15% Area Coverage

C G T T T GA T T A C T G G C C T T GC G A T C T T TT C T T T T C T TT T C G C A A A CT A A T G A C C G G A A CG C T A G

図７水晶発振子上への固定化と実験方法

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Step A（酵素の結合過程）：ポリメラーゼを加えたときの経時的な振動数の減少は酵素のＤＮＡ鎖への結合過程を反映している。平行に達したときの結合量は 140 ng cm- 2_{= 2 pmol であり、固定化してい} たＤＮＡ鎖が 6 pmol であったのでＤＮＡ鎖 3 本あたり 1 個の酵素が結合したことになる。突出末端の塩基配列を変化させたときの酵素の結合と脱着の速度定数を求めた。突出末端をすべて G にしたとき以外は塩基配列を変えても酵素の結合と脱離の速度定数はほとんど変化しなかった。これは酵素の結合過程は突出末端の塩基配列には依存しないことを表している。すべて G にしたときは突出末端が会合しているために酵素の結合が妨げられていると考えられる。 Step B（伸長反応の動力学）：モノマーを加えたときの重量変化はポリメラーゼによる伸長反応を反映しており、30 ng cm- 2_{= 6 pmol の重量増加が観察された。固定化されたＤＮＡ鎖と同じモル数の重量} 増加が観察されたことからＤＮＡ鎖はすべて伸長していることがわかる。ＤＮＡ鎖の伸長反応における突出末端の塩基配列の効果を調べた。突出末端の長さを 15 mer から 50 mer に長くすると伸長反応による重量増加（Dm）は 3.5 に増加した。濃度変化から求めた Michaelis-Menten 定数（kcatと Kｍ）は塩基配列には依存せずにほぼ一定であった。このことは伸長反応も突出末端の塩基配列には依存していないことを示している。 Step C（酵素の脱離過程）：伸長が終了した直後から振動数が上昇(重量の減少)が観察され、これは酵素が重合の終わったＤＮＡから脱離していく過程と考えられる。このときの重量減少は 140 ng cm-2 = 2 pmol であり、結合した酵素量と同じであった。酵素が脱離した後に残った重量(D)は 30 ng cm- 2₌ 6 pmol であり、これは固定化しておいたＤＮＡと同じモル数であり、反応後はＤＮＡ鎖の伸長による重量増加だけが残ることになる。各素過程の動力学的解析

Binding to PrimerTerminus

DNA : Polymeras e = 3:1 140 ng cm-2 = 2 pmol cm-2ofPolymerase

A

120ngcm-2=6pmolcm-2 ofDNA D:Polymerized Amounts 30ngcm-2=6pmolcm-2 d A T P / d G T P

B

Dissociation from DNA 140 ng cm-2 = 2 pmol cm-2 of Polymerase

C

DNAPolymerization

30ngcm-2= 6 pmolcm-2

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と求められ，その結果，結合定数 Ka = 108 M- 1となった。一方，伸長が終わった DNA 鎖から酵素が離

れていく Step Ｃでは，それぞれkon = 104 M- 1 s- 1，koff’ = 10- 2 M-1 s- 1，Ka = 106 M- 1と求められた。結

合過程の方が 102_{も結合定数が大きいことは，酵素が重合が終わったＤＮＡ鎖から 10}2_{倍も離れやす}

いことを表しており，図８の Step Ｃで酵素が離れていくこともよく理解できる。この 102_{倍の差は，酵素}

の突出末端への結合は平滑末端への結合に比べて kon で 10 倍大きく koff で 10 倍小さいことで説明

できる。また，Step ＢのＤＮＡ鎖の伸長反応はモノマー（dATP/dGTP）に対して Michaelis-Menten 式に従い，Km = 10- 5 M，kcat/Km = 106 M- 1 s- 1という値が得られ，これらの値はテンプレート部の塩基配列には依存しなかった。すなわち，基質モノマーの選択的はテンプレート部との相補的塩基対の形成で行われ，ポリメラーゼは基質特異性がなくテンプレート部に沿って重合していくことを反映している。 DNA ポリメラーゼの反応はこれまではゲルシフトアッセイを用いて行われており、酵素反応の各素過程を定量的に１つのデバイスで測定できたのは初めてである。（Ｂ）ＤＮＡ上での酵素反応： ATP 依存型ＤＮＡヌクレアーゼの場合 27MHz 水晶発振子の金電極表面にビオチン-アビジン法を用いて DNA 二本鎖を 120 ng(6 pmol/cm2₎

を電極面積の 15%に固定化した。DNA ヌクレアーゼ（Dnase）、ついで ATP を水溶液中に加えた時の振動数の経時的変化を追跡した。＜反応の経時変化＞二本鎖ＤＮＡを固定化した水晶発振子の入った水溶液中に DNase 、ついで ATP を添加したときの典型的な振動数変化を図 10 に示した。酵素を添加したときの振動数の減少(重量増加、step A)と ATP を加えたときの最初の振動数の上昇(重量減少、step B)とそれに続く振動数の上昇(step C)の 3 段階が観察できた。これらの挙動は以下のように解析でき、それを模式的に図 11 に示した。 Step A＜酵素の結合過程>：Dase を加えたときの経時的な振動数の減少は酵素のＤＮＡ鎖への結合過程を反映している。平行に達したときの結合量は 280 ng cm- 2_{= 1.7 pmol であり、固定化していた} ＤＮＡ鎖が 60 ng cm-2_{= 1.9 pmol であったのでＤＮＡ鎖 1 本あたり 1 個の酵素が結合したことになる。} Step B と C<加水分解と酵素の脱離過程>：ATP を加えたときの最初の急激な重量減少はあＴＰが図 10 ＤＮＡ固定化発振子にヌクレアーゼ(DNase)、次いで ATP を添加したときの振動数変化

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酵素に取り込まれて DNA 鎖の３’末端から加水分解が起こり、反応が終了すると酵素が一本鎖 DNA から離れる過程を反映している。反応終了後は開始時に比べて 30 ng cm- 2_{= 1.9 pmol 分振動数が上}

昇（重量減少、Ｄ）した。これは最初に固定化した DNA 鎖の半分であることから、Dnase は DNA の３’ 側のみを切断し結果的に一本鎖のみが発振子上に残ったことを反映している。

図 11 ATP 依存型 DNase の DNA 加水分解の反応機構

＜反応の動力学>

最初の酵素結合過程では、DNase の濃度変化をして酵素の結合速度定数（ko n）と脱離速度定数

（ko ff）求めた。加水分解過程では ATP 濃度変化を行い、Michaelis-Menten 式から DNA 鎖に結合し

ている酵素に第二の基質として ATP が取り込まれるときの Km値と加水分解速度定数 kcat値を求めて図１２にまとめた。図 12 DNase 加水分解反応における各反応過程の動力学定数これまで、ＤＮＡ上での酵素反応はゲルシフトアッセイなどの定性的な方法に限られていたが、水晶発振子マイクロバランス法を用いれば、動力学を正確に求めることができ、これからの酵素反応解析に新しい手法を提供できる。

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（C）ＤＮＡ上での酵素反応の解析：EcoRV 制限酵素の場合＜目的＞ＤＮＡの部位特異的に切断する制限酵素の反応はこれまではゲル電気泳動などの方法で解析されてきたが、酵素のＤＮＡ鎖への結合、ＤＮＡ鎖の切断反応は個別にかなりの手間をかけて行われてきた。ＤＮＡ固定化水晶発振子を用いることにより、ＤＮＡ鎖への酵素の結合と切断を重量変化として経時的に連続して追跡できると考えられる。＜実験方法＞ 27 MHz 水晶発振子の金電極上にビオチンアビジン法を用いて EcoRV の認識サイトを分子の中程に持つ 55 base pair のＤＮＡ二本鎖を固定化した。ＤＮＡの固定化量は酵素の結合に影響を与えないように基板表面積の約７％に抑えた。25 ℃, pH 7.5 (10 mM Tris buffer), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2

の条件下で EcoRV を加えたときの振動数変化を図１3 に示した。

図 13 ＤＮＡ二本鎖固定化水晶発振子に制限酵素 EcoRV を加えたときの振動数変化（25℃, pH 7.5, 10 mM Tris buffer, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2）

＜結果と考察＞図１3 の酵素を加えた直後の振動数の減少（重量増加）は酵素のＤＮＡ鎖への結合課程を表している。それに続く振動数の上昇（重量減少）はＤＮＡ鎖の加水分解反応を反映している。最初のＤＮＡ鎖の固定化量は 129 ng cm- 2_{(3.5 pmol cm}- 2_{) であり、結果的に 60 ng cm}-2_{(3.5 pmol cm}-2_{) の重量減} 少は固定化したＤＮＡ鎖のすべてが切断部位で切断されていることを反映している。振動数変化は，酵素の結合、加水分解反応、酵素の脱離という連続的に進行する反応を重量変化として表している。

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酵素—基質複合体の生成量は式（１）で表され、加水分解による生成物量は式（２）で表される。

[ES]

= [ES]

_max

(1

− e

−tτ

₎

_{+ [P](1− e}

−t τ

₎

_（１）

[P]

=

k

cat

D

_p

∫

[ES]dt

（２）式（１）と（２）の連立方程式を解くことによって実際の反応の経時変化をカーブフィッティングできる。図１4 には、式（１）と（２）の経時変化と（赤と青色の実線）、実際の反応の経時変化（黒線）と、それにフィットするように酵素の糖鎖への結合速度定数（k１）、解離速度定数（k- 1）、結合定数（Ka）、ＥＳ複合体内での加水分解速度定数（kcat）の各パラメーターを算出して求めた曲線を緑色で示した。計算式は実際の経時変化によくフィットしたので、これらの酵素反応の各反応パラメータ-を表２にまとめた。表２に示すように、水晶発振子法を用いると、酵素の糖鎖への結合と脱離の速度（k_１と k_-1）および結合定数（Ka = k1/k-1）、さらには切断速度定数（kcat）が同時に求まる。EcoRV は Mg2+イオン存在下では切断反応まで触媒するが、Ca2 +_{イオン存在下では酵素の結合のみが起こることが知られている。} Ca2 +_{イオン存在下で酵素の結合過程だけを追跡したときの}_k 1, k- 1およびKaの値は Mg2 +イオン存在下の加水分解過程までを含めた求めた値と良い一致を示した。これまではゲル電気泳動などでＤＮＡ鎖に放射性ラベルを施して観察していたのに比べ遙かに定量的に動力学定数が求まることがわかった。図 14 EcoRV によるＤＮＡ切断の振動数変化のカーブフィッティングとその解析

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表２ EcoRV によるＤＮＡ鎖切断の動力学定数（D）糖鎖上での酵素反応：アミロペペクチンのグルコアミラーゼによる加水分解＜目的＞糖関連酵素は、古くから食品産業などを中心としてその加水分解反応について検討されてきたが、反応を追跡する手段が発色法や液体クロマトグラフなどに限られてきたためにその反応メカニズムについてはよくわかっていない場合が多い。反応を解析する手段としての Michaelis-Menten 法では、酵素／基質複合体の生成量が追跡できないことが一つの理由である。水晶発振子マイクロバランス法を用いれば、酵素／基質複合体の生成量を直接重量変化として追跡できるので、これまでに求められなかった正確な動力学解析ができると考えられ、新しい手段になることが期待される。＜実験方法＞ 27 MHz 水晶発振子の金電極表面にビオチン-アビジン法を用いてアミロペクチン糖鎖を固定化した（図１５）。アミロペクチンの固定化量は、酵素の結合に影響を与えないように基板面積の１８％（0.46 pmol/0.049 cm2_{）に抑えた。} 図 15 アミロペクチンの固定化水晶発振子にグルコアミラーゼを添加したときの振動数変化（ 25 °C, 20 mM 酢酸緩衝液 , pH 4.8, 100 mM NaCl, [amylopectin] =0.46 pmol/0.049 cm2, [glucoamilase] = 0.1 unit

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図 16 酵素反応課程の反応解析とカーブフィッティング＜結果と考察＞ 25 °C, 20 mM 酢酸緩衝液, pH 4.8, 100 mM NaCl の条件で、0.1 unit のグルコアミラーゼを加えたときの振動数変化を図１5 に示した。酵素を加えた直後の振動数の減少（重量増加）は酵素の糖鎖への結合課程を表している。それに続く振動数の上昇（重量減少）は糖鎖の加水分解反応を反映している。結果的に 140 ng/cm2_{の重量減少は、固定化したアミロペクチンがほとんど加水分解したことを} 反映している。振動数変化は，酵素の結合、加水分解反応、酵素の脱離という連続的に進行する反応を重量変化として表している。反応のパターンとしては、上述のＥｃｏＲＶによるＤＮＡ鎖の切断過程と良く似ている。酵素 -基質複合体の生成量は先に述べた式（１）で表され、加水分解による生成物量は式（２）で表される。先に述べたように、式（１）と（２）の連立方程式を解くことによって実際の反応の経時変化をカーブフィッティングできる（図 16）。カーブフィッティングから求めた酵素の糖鎖への結合速度定数（kon）、解離速度定数（kof f）、解離定数（Kd）、ＥＳ複合体内での加水分解速度定数（kca t）を表３にまとめた。表３に示すように、水晶発振子法を用いると、酵素の糖鎖への結合と脱離の速度（kon とkoff）および解離定数（K_d = k_off/k_on）、さらには加水分解定数（k_cat）が同時に求まる。これまでは水溶液中で Michaelis-Menten 式を用いて解析してきた。マルトペンタオースを基質にしたときのKm値とkcat値を表 3 にあわせて示した。Michaelis-Menten 式から求めたKm＝1.2 x 10- 4 M と水晶発振子で求めたKd = 4 x 10- 9_{M は 10}5_{倍も異なった。これは、Michaelis-Menten 式では、ＥＳ複合体の生成量を追跡できない}

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仮定をおいて Km値を算出している。水晶発振子法で求めた koffとkcatは各々、koff =9.3 x 10- 5 s- 1と

kcat =93 s- 1であり、あきらかにkoff < kcatであり、Michaelis-Menten 式が成り立たないことになる。すなわ

ちアミロペクチンのグルコアミラーゼによる加水分解反応では、koff > kcat の仮定が成り立たなくて Michaelis-Menten 式では解離定数が求められないことになる。ちなみに k_cat 値は両者で求めた値は 54 s- 1_{と 93 s}- 1_{でほぼ一致した。すなわち、水晶発振子法を用いることによりこれまで Michaelis-Menten} 法だけで解析してきた酵素反応の動力学に新しい方法論を展開できる可能性がある。表３アミロペクチンのグルコアミラーゼによる加水分解の反応強力学定数（E）糖鎖上での酵素反応：デキストランスクラーゼによる糖鎖伸長反応＜目的＞デキストランスクラーゼはスクロースを基質にしてグルコースをデキストランの還元末端に結合させて糖鎖を伸長させることが出来る糖転移酵素の１種である。デキストランを水晶発振子基板上に固定化すれば、ショ糖を基質にして基板上で糖鎖伸長過程を重量増加として観察できる。図 17 デキストラン固定化発振子上でのデキストランスクラーゼ添加による糖鎖伸長反応の観察（ [Dextransucrase]=18 nM, 10 mM Acetate Buffer (pH: 5.2), 25℃）

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＜結果と考察＞デキストラン固定化基板にデキストランスクラーゼを添加すると、デキストランへの酵素の結合に伴う微少の重量増加（振動数の減少）が観察された（図１7）。平衡に達した後にモノマー基質であるスクロースを添加すると大きな重量増加が認められ、重合の進行を観察することができた。糖鎖加水分解反応と同じように、カーブフィッティングを行うことにより、動力学的解析を行ったところ、プライマーであるデキストランへの酵素の解離定数は Kd = 2.7 mM、スクロースに対するKm値は 0.11 mM，伸長の kcat値は 51 s- 1と求められた。酵素を基板に固定化して，同様な実験を行い、その結果をまとめて図 18 に示した。酵素を固定してプライマーとモノマー基質を添加した系の場合にも動力学的パラメータ（Km値は 0.54 mM，kcat値は 10 s- 1_{）の大きな差異はなかったことから、いずれの方法での酵素反応が追跡できることもわかった。これは} 酵素を基板上に固定化し生成物である糖鎖の伸長反応を直接観察した最初の例である。（F）糖鎖上での酵素反応の解析：フォスフォリラーゼによる糖鎖の可逆的な分解と伸長反応の解析＜目的＞フォスフォリラーゼは下式に示すようにリン酸存在下でα-１，４グルカン鎖を過リン酸分解できる酵素であると同時に、グルコース-６-リン酸存在下ではリン酸基を脱離しながら糖鎖の伸長がおこるという興味深い酵素である。糖鎖の分解と伸長はいずれも質量変化を伴う反応であるので、QCM 法ではその反応過程を追跡できる。 + OH CH2OH O O H OH P O OH OH O OH CH2OH O OH O OH n-1 H OH CH2OH O OH O H OH CH2OH O OH O OH n-1 P HO OH OH O + ( -1,4-D-glucosyl)_n Pi G1P ( -1,4-D-glucosyl)_n-1 Phosphorolysis Polym erization 図 18 発振子上に基質を固定化したときと酵素を固定化したときの、デキストランスクラーゼによる糖鎖伸長反応の動力学定数

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＜結果と考察＞水晶発振子の金基板の表面にアビヂンを固定化し還元末端をビオチン化したアミロペクチンを固定化した。図１９に示すように、フォスフォリラーゼを添加すると振動数の減少（重量の増加）が観察され、酵素が基質に結合する過程が観察できた。さらにリン酸を加えると大きな振動数の減少（質量の増加）が見られた。これは基板上の糖鎖の分解（加リン酸分解）を反映している。酵素が結合した時点でリン酸の代わりにグルコース-６−リン酸を加えると、重量の増加が観察され、基板上での糖鎖の伸長反応が観察された。振動数の経時変化から酵素の糖鎖への結合時における結合速度定数 (ko n)、解離速度定数 (ko f f) および解離定数 (Kd)が求められた。さらに、加リン酸分解反応での触媒速度定数 (kcat)、リン酸基質の解離定数 (Kｍ)とみかけの二次速度定数 (kcat／Kｍ)、さらには、糖鎖伸長反応における触媒速度定数 (kcat)、グルコース-6-リン酸基質の解離定数 (Kｍ)とみかけの二次速度定数 (kcat／Kｍ)が求められた。結果を表４にまとめた。酵素の基質への親和性(Kd= 3.2 x 10- 7 M) は通常の糖鎖関連酵素とよく似た値であるが、興味深いのは、過リン酸分解速度における各速度定数と糖鎖伸長反応における速度定数がほぼ同じである点である。フォスフォリラーゼは酵素分類上は分解酵素として分類されているが、じつは縮合活性が分解活性と同程度持っており、糖転移酵素として分類されてもおかしくないことがわかった。これまでに、同じ反応条件でフォスフォリラーゼの加リン酸分解活性と糖鎖伸長活性を定量的に求めた例はなかったので、QCM 法により定量的にかつ網羅的に酵素触媒反応が求められて初めて明らかになった。表４フォスフォリラーゼによるアミロペクチンの加リン酸分解と糖鎖伸長反応の動力学定数図 19 アミロペクチン固定化水晶発振子上でのフォスフォリラーゼによる可逆的な糖鎖の分解（青線）と伸長（赤線）反応

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（G）糖鎖上での酵素反応の解析：点変異イソマルトデキストラナーゼの反応解析＜目的＞糖加水分解酵素の活性の定量的評価法として，古くから Michaelis-Menten 速度論が用いられ、反応生成物を定量することで，K_mと k_cat値を算出している。近年，アミノ酸残基の役割についてより詳細な知見を得るために変異型酵素を作製し，その活性評価や X 線結晶構造解析などが盛んに検討されるようになってきているが，その際に酵素活性が消失してしまった場合には、生成物が得られないので Michaelis-Menten 法では解析が出来ない。そのために変異導入の影響についても議論できないことが多い。しかし、QCM 法を用いれば、酵素・基質複合体の生成量を振動数変化として追跡できるので、酵素への点変異が基質結合過程か触媒過程に働いているのか、あるいは両者に有効なのかが解析できると考えられる。＜結果と考察＞イソマルトデキストラナーゼの X 線結晶構造解析はまだ行われていないので、基質の結合や触媒作用に関与する残基をガラクトース加水分解酵素（GH）ファミリー27 に属する酵素のアミノ酸配列，結晶構造などをもとに分子モデリングを参考にして、活性中心近傍に存在すると推測される酸性アミノ酸残基 Asp198，266 および 313 に注目し，これらの残基をアスパラギンに変換した変異型酵素をそれぞれ作製した。変異型酵素は，各種カラムクロマトを順次行なうことにより，電気泳動的に均一になるまで精製した。水晶発振子基板上にデキストランを固定化し、イソマルトデキストラナーゼのワイルドタイプ（WT）、 D313N, D198N, D266N を加えたときの振動数変化を図 20 に示した。Wild Type の時は酵素の添加と共に振動数が上昇（重量が減少）し、基質が分解していることがわかる。一方、変異を入れたいずれの酵素も振動数が減少（重量が増加）し、酵素が基質に結合するが加水分解反応が起こっていないことがわかる。振動数変化をカーブフィッティングして動力学解析したときの結果を表 5 にまとめた。

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触媒活性 (kcat 値 )についてはいずれのアスパラギン酸（D）も重要な役割をしていることがわかった。 D198 および D313 に関しては，アスパラギン（N）に変換することで，結合活性が低下していることが振動数変化や Kd からわかる。特に D313N では親和力の低下が顕著であり，本残基は触媒よりむしろ基質との結合に関与していることが推察される。反応速度パラメータと、詳細な研究がなされているファミリー13 の Taka-アミラーゼの反応メカニズムをもとに，これら残基の役割を推察すると，D198 は基質との結合とオキソカルベニウムカチオン中間体の安定化に、D266 は一般酸塩基触媒に，D313 は基質との結合・固定にそれぞれ寄与しているものと推察される。このように QCM による反応速度解析と部位特異的変異導入法を組み合わせることにより，アミノ酸残基の役割，さらには触媒反応メカニズムの解明につながるものと考えられ、ＱＣＭは酵素の点変異解析に有効な武器になることが期待される。（H）タンパク質の加水分解反応の解析＜目的＞ DNA や糖鎖と異なり、タンパク質は３次元構造があり基質としては酵素反応の制約を受けると考えられる。ここでは、タンパク質基質としてミオグロビン（１７ kDa）を選んだ。ミオグロビンは分子内に SS 結合がなく８本のαヘリックスのみからなる構造の単純なタンパク質であり、プロテアーゼによる加水分解には適した基質である。プロテアーゼとしては、C 末側からアミノ酸を１つずつ加水分解できる Exo 型のカルボキシペプチダーゼ P（CPP）を選んだ。Endo 型のプロテアーゼではタンパク質のどこを切断したのかが不明であり、水晶発振子上での重量減少から反応を追跡するには解析が困難であるという理由で Exo 型酵素を選んだ。＜実験方法＞ミオグロビンをビオチン化してアビジンで被覆した QCM 基板上に固定化し、カルボキシペプチダーゼを添加したときの振動数変化を追跡した。＜結果と考察＞ミオグロビンを固定化した水晶発振子に、カルボキシペプチダーゼ P（CPP）を添加したときの振動数変化を図２１に示した。CPP を添加すると基質への酵素の結合による振動数減少（重量増加）と、それに引き続いておこる振動数増加（重量減少）が見られた（赤線）。一方、CPP の活性中心の Ser-OH 基表 5 点変異イソマルトデキストラナーゼによるデキストラン加水分解反応の動力学定数

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を共有結合型阻害剤でつぶした酵素では、基質への結合だけが見られ、加水分解反応は見られなかった（青線）。CPP による加水分解では固定化したミオグロビンの約４０％が加水分解された。これまでの酵素反応と同様に振動数変化のカーブフィッティングから、CPP の基質への結合速度定数（ko n）、解離速度定数（ko ff）、加水分解速度定数（kcat）を求めた。タンパク質基質の場合は基質の３次元構造が加水分解速度に大きな影響を与えると考え、加水分解速度のｐH 依存性についても調べた。各ｐH におけるそれぞれの動力学パラメーターを図２２右にまとめた。図２２左には同条件での Z-Phe-Try ジペプチド基質の加水分解反応をニンヒドリン反応で追跡し、Michaelis-Menten 式で解析し、Km値とkcat値を求めてその pH 依存性を示した。ジペプチドの CPP による加水分解においては、Km値、kcat値ともにほとんどｐH 依存性はなかった。一方、QCM 法では基質への結合速度ではko ffはほとんどｐH 依存性を示さなかったが、ko nはｐH 3.7 付近で最大値を示した。また kcatはｐH の低下と共に増大した。図２２右下の青線に示したように基質であるミオグロビンのαヘリックス含量はｐH の低下と共に減少する。すなわち、CPP 酵素の kcatにはほとんど pH 依存性はないが、ｐH が低下してミオグロビンの構造がランダムコイルになって行くに従い、見かけ上kcat値が増加するように見える。CPP のkcatにｐH 依存性がないことは図２２左のジペプチドのkcat

のｐH 依存性からもわかる。すなわちこの酵素のｐH 依存性は酵素の基質への結合速度 kcatに表れて

いる。QCM 法ではko n、ko ff、Kd＝ko ff/ko n、kcatのすべての動力学パラメーターが個別に求められる特徴

がある。Michaelis-Menten 式から求められるKm値は[（kcat + ko ff）/ko n]で表され、kon、ko ff、kcat値から逆

算して図２２右の黒線の pH 依存性で示した。ジペプチドの Km値のｐH 依存性がないのに対して、ミオグロビンの場合は低ｐH になるに従って Km値が増加するのは、基質のコンフォメーションが崩れるに従って kcat値が増加するためである。結局、タンパク質の加水分解では、基質の３次元構造が加水分解速度に大きく影響することがわかった。これまで水溶液中での Michaelis-Menten 式を用いての加水分解反応では、基質のコンフォメーシ図 21 ミオグロビン固定化水晶発振子にカルボキシペプチダーゼ P（CPP）を添加したときの振動数変化（CPP の活性中心を阻害した酵素では基質への結合のみが見られた）

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Kd＝ko ff/ko n 値と加水分解速度のパラメーターkcat 値を分けて求められるので、タンパク質加水分解における基質のコンフォメーションの影響が詳細に議論できる特徴がある。図 22 （右）ミオグロビンの水晶発振子上での加水分解速度のｐH 依存性、（左） Z-Phe-Try ジペプチドの水溶液中での加水分解速度のｐH 依存性 (2) 研究成果の今後期待される効果水晶発振子法の大きな特徴は酵素反応における反応中間体である ES コンプレックスの生成と分解速度を重量変化として求めることにある。そのために、これまで測定することが困難であった、酵素の基質への結合性のパラメーターである ko n、ko ff、Kd＝ko ff/ko n値と触媒速度定数 kcat値を同時に求められる。従来の生成物を追跡して Michaelis-Menten 式で Km値と kcat値を求める方法に取って代わると考えられる。反応としても核酸分解、糖鎖分解と伸長、タンパク質の分解などいろいろな反応に適用できることも大きなメリットである。３．２膜タンパク質の固定化とシグナル分子の結合（古澤グループ） (1)研究実施内容及び成果生体内のタンパク質の４０％は生体膜上にあると言われ、様々な認識や反応が行われている。膜タンパク質上でおこる認識や反応を解析するためには基板上に脂質膜内に固定化された膜タンパク質

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を構築することが必要である。そのためには水晶発振子の金基板上を利用する方法が適している。膜タンパク質としては、細菌 Streptomyces lividans 由来のＫ＋_{イオンチャネルタンパク質であるＫｃｓ} Ａを選んだ。KcsA は図 23 に示すように、158 個のアミノ酸からなる２本の膜貫通型αヘリックスの４量体から構成され、内部にカリウムイオンが通る穴が存在する。KcsA は細菌由来であるので、164 番目のリジンをアスパラギン酸に変えた R64D にはサソリ毒由来の Agitoxin2 ペプチドがチャネルブロッカーとして結合することが知られている。＜膜タンパク質の基板上への固定化＞膜タンパクを基板上に固定化する方法としてリポソームに再構成して基板上に吸着させる方法が知られているが、この方法では、膜タンパクの固定化量が少ない、膜タンパクの配向が制御できない、などの欠点がある。本研究では図２4 に示すように、ＫｃｓＡのＣ末端側に遺伝子操作によりシステインを導入し、大腸菌で発現した。界面活性剤で可溶化したＫｃｓＡの C 末端の SH 基をビオチン化試薬（PEO-Iodoacetyl Biotin）でビオチン化し、アビジンを固定化したＱＣＭ基板上に固定化した。これを基板上で混合ミセル法を用いてリン脂質膜（DOPE と DOPC）と置換した。これらの操作をＱＣＭ法で重さの変化として追跡し、KcsA の固定化量と脂質膜で置換されたかどうかを確認した。ほかにも、ビオチン化脂質を一部導入したときには脂質膜の表面がアビジンで１層覆われること、蛍光脂質を導入したときには基盤全体が蛍光で光ることから、KcsA の周りが脂質膜で置き換わったことを確認した。図 24 QCM 基板上への膜タンパク質 KcsA の固定化と脂質膜置換による膜タンパク質の再構成の模式図＜KcsA への Agitoxin2 ペプチドの結合過程の解析＞ QCM 基板上に脂質二分子膜と共に固定化した Agitoxin2 チャネルブロッカーペプチドの結合は KcsA タンパク質に対してペプチドの分子量が小さいこともあって、これまで使っていた装置（AFFINIX 図 23 膜タンパク質としての KcｓA イオンチャネルと R64D 変異体へのチャネルブロッカー Agitoxin2 の結合の模式図

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Hz、ドリフトを 0.5 Hz/h に低下した装置を作製した（図２５）。

図 25 高感度フローセル型 QCM 装置の模式図

測定結果を図２６に示した。Wild type (WT)の細菌由来の KｃｓA にはサソリ毒の Agitoxin2 はほとんど結合しないが、変異を入れた R64D 体を脂質膜に可溶化した系では Agitoxin2 は KcsA に対して１：１で結合した。一方、R64D を界面活性剤で可溶化しただけの系では Agitoxin2 は過剰に結合した。これは界面活性剤で可溶化しただけでは KcsA は変性しやすく、Agitoxin2 が非特異吸着してしまうためである。振動数変化のカーブフィッティングから求めた結合のパラメーターはko n = 2.7 x 104_M- 1_s- 1_、k o ff = 5.7 x 10- 4_s- 1_、_K a= 4.4 x 106 M- 1 _{であった。類似の測定} 値がないので得られた値を直接比較することは出来ないが、Ka= 106 M- 1という結合定数はチャネルブロッカーの結合定数としては妥当な値である。 (2)研究成果の今後期待される効果 QCM 基板上に膜タンパク質を脂質二分子膜と共に高密度に配向を保ちながら固定化でき、シグナル分子の結合の動力学解析が出来たことは、今後の膜レセプターへの種々の薬物の結合挙動を解析する上に有用であり、今後の創薬分野への応用が期待できる。図 26 QCM 上に固定化した WT の KcsA、脂質膜に固定化した R64D の KcsA、界面活性剤に可溶化した R64D-KcsA への Agitoxin2 の結合挙動（50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 µM EDTA, 100 mM NaCl, 50 mM KCl, 0.1% DDM, 25 ℃, Flow Rate 25 mL/min）

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３．３リボソームでの翻訳過程の定量化（古澤グループ） (1)研究実施内容及び成果＜目的＞ mRNA の遺伝情報に基づきタンパク質に翻訳される過程は、近年リボソームの X 線結晶解析がなされたことにより急速に進み、無細胞翻訳系などに実用化されつつある。しかし、分子レベルでのメカニズムなどまだまだ解明しなければならない課題は多い。例えば、翻訳が開始されるためには開始複合体が形成されなければならないが、その過程すら不明な点が多い。図２７に示すように、教科書的には７０S リボソームは開始因子 IF3 の作用により３０S リボソームと５０S リボソームに解離し、SD 配列を認識できる３０S が最初に mRNA に結合し、ついで５０S リボソームや fMet-tRNAi が結合して開始複合体が作製されると提唱されている。リボソームは RNA とタンパク質の巨大な複合体であり、質量も大きく QCM 法で測定するには適したターゲットである。

図 27 mRNA にリボソームが開始因子（IF1, IF2, IF3）や fMet-tRNA と共に結合して開始複合体が形成される過程の予想図

＜実験方法＞

リボソームが特異的に結合する Shine-Dalgalno (SD)配列と tRNAi が結合する AUG 開始コドンを持つｍRNA を cDAN から逆転写により作製した。３’末端にビオチンを導入し、アビジン固定化 QCM 上に固定化した。70S、５０S、30S リボソームを添加した時の振動数変化を測定した。＜結果と考察＞図２８にｍRNA 固定化 QCM へのリボソームの結合挙動を示した。SD 配列を認識できる３０S リボソームは mRNA に結合するが、５０S リボソームにはほとんど結合しない。しかしこれまで結合しないと考えられていた７０S リボソームが予想外にも mRNA に解離することなく結合することがわかった。結合過程の振動数変化から結合速度定数（ko n）、解離速度定数（ko f f）、結合定数（Ka）を求めて表６にまとめた。５０S リボソームはｍRNA にほとんど結合しないが、７０S は３０S と同じような結合定数と結合・解離速

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異的な結合であることがわかる（Run 4 と 5）。mRNA の５’末端を anti-UTR でブロックした mRNA には７０S が結合できないことから、７０リボソームは５’末端から滑りながら mRNA に結合するのではなく、横方向から結合すると考えられる。 AUG 開始コドンを認識する fMet-tRNAi 共存下では７０S リボソームの結合定数（Ka）は２倍ほど上昇したが、AUG を

UUG に置き換えた mRNA へのKaは１／３に低下した（Run 7

と 8）。リボソームの片方を架橋して解離しないようにした７０S は SD 配列を持つ mRNA には結合できなかった (Run 9)。しかし、AUG 開始コドンを５‘末端に持つ mRNA には結合速度は遅くなるが、結合することがわかった(Run 10)。表６種々の mRNA へのリボソームの結合パラメーターa 図 28 （A）ｍRNA 固定化 QCM への(a)70S、 (b)30S、(c)50S リボソームの結合挙動と（B） (a)70S 、(b)30S リボソームの飽和結合挙動（ 10 mM HEPES-KOH, pH 7.3, 100 mM NH4Cl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, 25 °C）

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これらの結果は、７０S リボソームは解離することなくｍRNA の SD 配列に横から結合して、開始複合体を形成できることを示している。これまで、７０S は一度３０S と５０S に解離してから mRNA に結合すると考えられていたが、こういう通常の経路のほかにも解離しないでそのまま mRNA に結合する経路もあり得るのではないかと言うことがわかった（図４参照）。 (2)研究成果の今後期待される効果翻訳過程は多くの因子が複雑に絡み合ってｍRNA の遺伝情報からタンパク質を発現している。これまで知られていなかった新しいルートで開始複合体が形成されることが重量変化として追跡することで明らかになった。今後、リボソームの伸長過程、解離過程についても検討する必要がある。３．４生体分子の粘弾性と水和の評価（川崎グループ） (1)研究実施内容及び成果＜目的＞これまでの研究では水晶発振子を発振回路を用いて強制発振させ、物質が吸着したときの重量増加を振動数減少として検出していた。これとは別に水晶発振子をネットワークアナライザーに接続して周波数を掃引すると共振周波数がコンダクタンスの最大値（Fs）として表れる（図２９）。基板上に弾性体が吸着するとピークトップが低波数側にシフトし、このシフト量は発振回路での振動数変化と対応する。一方、基板上に粘性体が吸着すると振動エネルギーが粘性体に伝わりにくいためにエネルギー散逸が起こり、ピークはブロード化して低波数側にシフトする。エネルギー散逸の程度は D = (F2-F1)/Fs のピークの広がりの度合いで表される。タンパク質や DNA 鎖のような生体分子を QCM 基板上に固定化すれば、生体分子の水和により空気中に比べて大きな振動数減少（ΔF）と、生体分子の柔らかさのためにエネルギー損失（ΔD）が大きくなることが予測される。すなわち水中で種々の生体分子が基板上に結合したときのΔF 値とΔD 値を測定すれば、生体分子の水和の度合いと柔らかさが予測できる。

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＜実験方法＞図３０に示すように、QCM の振動数 F とエネルギー損失値 D を、空気中、水中に浸けた時、物質が結合した時、吸気中に取り出して乾燥した時に測定し、空気中で物質が結合したときの振動数変化ΔFai r、水中で結合したときの振動数変化ΔFwate rとエネルギー損失値ΔDwaterを求めた。＜結果と考察＞ QCM 基板上にポリスチレン高分子（PS）、BSA タンパク質、二本鎖 DNA の固定化量を変化させたときの結果を図３１にまとめた。PS はΔFairに対するΔFwate r の変化量は同じ、すなわちΔFwater/ΔFai r の傾きは１であり、空気中と水中での振動数変化は同じであり、疎水的な膜なので水和していないことがわかる。また、単位質量あたりのエネルギー損失値 ΔDwater/ΔFai rはほとんど０であり、PS は硬い膜であることが

わかる。また、タンパク質である BSA を固定したときは、ΔFwate r/ΔFair＝2.5 であり、空気中に比べて

2.5 倍も水中で振動数変化が大きく、これは自重の[（ΔFwater/ΔFair）−１]＝1.5 倍も水和していることを

表している。ΔDwater/ΔFai r＝1.6 x 10- 6と少しエネルギ−損失があるが、このエネルギー損失は水和水

を振っているためである。一方、DAN 鎖を固定化したときは、ΔFwater/ΔFa ir＝6.3 と共にΔDwater/ΔFair

＝19 x 10- 6_{も非常に大きくなり、DNA 鎖は柔らかくて水和していることがわかった。}

図 31 QCM 基板上にポリスチレン（PS）、BSA タンパク質、二本鎖 DNA を固定化量（ΔFair）を変化させて結合し

たときの（左）ΔFwate r と（右）ΔDwate r の変化の度合い。各々の直線の傾きはそれぞれ水和量とエネルギー損失量を表す。図 30 QCM 基板上に物質が結合したときの空気中での振動数変化（Δ Fair）、水中での振動数変化（ Δ Fwate r）とエネルギー損失値（ Δ Dwate r）の測定方法

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種々の生体高分子を QCM 基板上に固定化し、ΔFwater/ΔFai r とΔDwater/ΔFai r を求め、水和量

[（ΔF_water/ΔF_air）−１]に対してエネルギー損失量ΔD_water/ΔF_{ai r}をプロットし、図 32 にまとめた。ポリスチレン（１．PS）や金ナノ粒子（２．AuNP）は原点付近にプロットされ、水和していなくて、エネルギー損失のない硬い物質であることがよくわかる。ポリジメチルシロキサン（３．PDMS）は疎水的なゴムであり、水和はしていないが、少しエネルギー損失のある柔らかい膜であることがわかる。

ニュートラアビジン（４）、グルコースオキシダーゼ（５）、ミオシン（６）、ビオチン化カルモジュリン（７． Bio−Calmodulin）、ビオチン化 BSA（８. Bio-BSA）は一本の直線上にプロットされた。この直線は、硬い膜が水和したときにそのエネルギー損失が水和水を振動させるときのみにおこると仮定した理論式である。すなわち、タンパク質は各々水和量は多少異なるが、エネルギー損失のない硬い物質であることがわかる。一方、ポリエチレングリコール鎖（１０，１１．PEG）、DNA 鎖（１２．ssDNA、１３．ｄｓDNA）、プルラン糖鎖（１４−１７）は直線から右側に大きく外れ（エネルギー損失が大きくなり）、その度合いは分子量（長さ）と共に大きくなった。すなわち、DNA 鎖や糖鎖のようにひも状の分子は柔らかく、水中で振動させたときにはエネルギー損失も大きく、水和量も多いことがわかった。図 32 種々の生体高分子の水和量とエネルギー損失の相関関係。図中の直線は硬い膜のエネルギー損失がその水和量だけでおこると考えたときの理論式から求めたもの。 ΔF 値とΔD 値を同時に測定することにより基板上の物質の水和量やそれに伴う分子の硬さ・柔らかさが予測できることがわかった。この事を利用すれば、分子のコンフォメーション変化が予測できる。

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り硬いコンフォメーション（直線上のプロット）から右上方向、すなわち水和量が増大しエネルギー損失も増大（柔らかくなる）する事がわかる。BSA の SS 結合をヨード酢酸と反応させて SS 結合を切断すると BSA は完全に変性し、直線上のプロットから大きく右上に外れる。図 33 （左）タンパク質のコンフォメーション変化（変性）と（右）DNA 鎖の伸縮に対する水和量とエネルギー損失値の変化 DNA 鎖はスペルミジンなどのオリゴカチオンが結合すると収縮するといわれている。図 33 右に示すように DNA にスペルミジンを加えるとそのプロットはタンパク質の直線上に乗るように変化した。すなわち DNA 鎖は伸びた構造をしているがオリゴカチオンが結合する事により収縮し、脱水和して硬い構造になり、結果的にはタンパク質と同じくらい硬くなることがわかる。二本鎖の dsDNA の方が一本鎖の ssDNA より伸びた構造をしており、収縮してもｄｓDNA の方が少し柔らかい構造になることもわかった。 (2) 研究成果の今後期待される効果ネットワークアナライザー法を用いてΔF とΔD を同時に測定することにより QCM 基板上に結合した生体分子の水和量と硬さが予測できることがわかった。この方法を展開すれば、分子の外部刺激によるコンフォメーション変化が追跡できる。また、タンパク質が DNA 鎖に結合する時にはそのコンフォメーションが大きく変化することが知られている。多くの酵素反応でも基質は反応の進行に伴い、酵素の形や柔らかさが変化するともいわれている。本法を発展させれば、反応の進行に伴うタンパク質や生体分子の構造変化と定量的に追跡することが出来る。３．５多機能で高感度な水晶発振子装置の開発（吉嶺グループ） (1) 研究実施内容及び成果酵素反応を動的に追跡したり、膜タンパク質上に小さなシグナル分子が結合するのを追跡したり、

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mRNA 上へのリボソームや開始因子の結合を観察したりするためには、高感度で安定な測定装置が必要である。＜装置の高感度化とフロー装置化＞我々はこれまで、図３４に示すように手作りの第１世代の装置、製品化した第２世代の装置（ AFFINIX Q 、セル容量８ｍ L ）、セル容量を 0.5 mL にして４チャネル化した第３世代の装置（AFFUINIX Q4）を開発してきた。いずれも水晶発振子を固定化したセルにサンプル溶液をインジェクションするバッチ式であり、測定時間が長くとれる、装置化が簡単である、などの長所を持つ反面、濃いサンプル溶液が必要、セルがオープンであるので外部からの影響を受けやすいなどの欠点がある。しかし、AFFINIX Q でも DNA 鎖へのタンパク質、酵素、リボソームのような比較的大きな分子の結合であれば十分に測定できた。一方、レセプタータンパク質への低分子薬物の結合などの測定をするためには、１０倍以上の高感度化が望まれる。前出の図２5 に示したように、セルと発振回路周辺の温度制御を±0.1℃から±0.001℃に精度を上げ、発振回路を光カップラーで外部ノイズから遮断し、セル容量が 10μL の微少フローセル化することで、従来のバッチ式の AFIINIX Q4 のノイズレベル±１ Hz、ドリフト巾 7 Hz/h が、ノイズレベル±0.05 Hz、ドリフト巾 0.5 Hz/h に大幅に向上した。３．２で述べた KcsA イオンチャネルへのチャネルブロッカーペプチチド Agitoxin2 の結合は、バッチ式の AFFINIX Q4 では正確に求められなかったが、新しく開発したフロー式で初めて正確に測定できるようになった。高感度化（実際は低ノイズ化）する事により、これまで測定が困難であった大きなタンパク質レセプターへの低分子シグナル分子の結合が測定でき、創薬化学に大きく貢献することが期待できる。現在は、図 35 に示すようなフローセルをマイクロ流路に組み込んだ装置を開発中である。

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＜水晶板のカット角の変更＞別紙参照 (2) 研究成果の今後期待される効果マイクロ流路型測定装置はノイズレベル±0.05 Hz の高感度なので、低分子薬物の結合が観察でき、創薬分野に利用できる。水晶発振子のカット角を改良する事により水中での温度依存性が 1/１００になったので、装置の小型化により手に持てるサイズになった。モバイル型のビオセンサとして利用価値は高い。

４研究参加者

① 森グループ（酵素反応の解析）氏名所属役職研究項目参加時期森俊明蒲池利章仁平高則西野秀和福所しのぶ中山元東工大・生命理工東工大・生命理工東工大・フロンティア東工大・生命理工東工大・生命理工東工大・生命理工助教授助教授 CREST 研究員大学院生大学院生大学院生糖鎖上での酵素反応大腸菌から酵素の調製糖関連酵素の発現と酵素反応の解析ＤＮＡ上での酵素反応ＤＮＡ上での酵素反応糖鎖上での酵素反応平成 13 年 10 月～平成 19 年 3 月平成 13 年 10 月～平成 16 年 3 月平成 14 年 4 月～平成 18 年 3 月平成 14 年 4 月～平成 16 年 3 月平成 14 年 4 月～平成 16 年 3 月平成 14 年 4 月～平成 16 年 3 月図 35 マイクロ流路化フローセル装置の試作機

戦略的創造研究推進事業 CREST

戦略的創造研究推進事業 ＣＲＥＳＴ