九州大学学術情報リポジトリ
Kyushu University Institutional Repository
黄麹菌Aspergillus oryzaeにおける糖タンパク質分 泌に関する研究
李, 秋実
http://hdl.handle.net/2324/4060238
出版情報：Kyushu University, 2019, 博士（農学）, 課程博士 バージョン：
権利関係：Public access to the fulltext file is restricted for unavoidable reason (3)
氏 名 ： 李 秋実
論文題名 ： 黄麹菌Aspergillus oryzaeにおける糖タンパク質分泌に関する研究 区 分 ： 甲
論 文 内 容 の 要 旨
バイオ医薬品は、少ない副作用で高い薬効が得られることから、需要が拡大している。しかし、
現在の哺乳動物細胞での生産系では、コストの高さや生産されたバイオ医薬品糖タンパク質の糖鎖 部分が不均一であることが課題となっている。また、異なる生物種によって生産された糖タンパク 質は、その宿主特有の糖鎖が修飾されることで薬効が発揮されないばかりか副作用のリスクも存在 する。そのため、均一な糖鎖構造を持つ糖タンパク質の生産方法が求められている。現在、均一な 糖鎖構造を持つ糖タンパク質を酵素化学学的に調製するため、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダ
ーゼ(ENGase)を利用する方法が主に用いられている。この方法では、不均一な糖鎖を有する糖タン
パク質を ENGase により N-結合型糖鎖を切断し、N-アセチルグルコサミン (GlcNAc)が 1分子残存 したGlcNAc-タンパク質を調製後、均一な糖鎖をENGaseにより転移させる。そこで、直接GlcNAc- タンパク質を大量生産する新たな手法として、異種タンパク質分泌生産の宿主によく利用されてい
る黄麹菌Aspergillus oryzaeに着目した。黄麹菌は古くから日本において日本酒、味噌、醬油といっ
た醸造産業に使用されてきた有用な微生物であり、安全性が確認されている。糸状菌 Hypocrea jecorina由来のENGase (EndoT) を黄麹菌のゴルジ体膜に発現させることで、GlcNAc-タンパク質を 分泌生産することが期待できる(Fig. 1)。本研究は、黄麹菌におけるN結合型糖鎖欠損糖タンパク質 を分泌生産することを目的とし、その生産株（AoGlycoDelete 株）の作製および諸性質の解析を行 った。
1) 黄麹菌におけるGlcNAc-タンパク質生産(AoGlycoDelete)株の作製
まず、黄麹菌のゴルジ体膜に局在すると推定される膜タンパク質4種類を選抜した。それらの膜 貫通領域（TM 領域）と黄麹菌用にコドン最適化したEndoT を発現するプラスミドを構築し、4種 類の AoGlycoDelete 候補株を作製した。これらの 4種類の AoGlycoDelete候補株を野生株とともに DPY 液体培地で培養し、培養上清を SDS-PAGE に供した結果、野生株由来の一つの N 結合型糖鎖 を持つα-アミラーゼのバンドサイズに比べて4種類のAoGlycoDelete候補株由来のα-アミラーゼの 分子量が減少したことが確認された。このことから、作製した 4 種類のAoGlycoDelete候補株は N 結合型糖鎖を欠損したα-アミラーゼを分泌生産することが示された。
2) AoGlycoDelete株の生育およびEndoTの局在解析
野生株および4種類のAoGlycoDelete候補株をDPY寒天培地に植菌し、30℃と37℃で48時間培 養 し た 。 そ の 結 果 、4 種 類 の AoGlycoDelete 候 補 株 の 内 、 分 裂 酵 母 Omh1 オ ル ソ ロ グ で あ る AO090102000391のTM領域を使用したTM391-EndoT発現株において、野生株に比べてコロニー形 態の異常が観察された。これは細胞表面の糖タンパク質糖鎖がEndoT によって切断され、正常な細 胞形態の維持ができなくなったためと考えられた。また、AoGlycoDelete 株における EndoT の細胞 内局在を観察するために、EndoT のEGFP融合型発現株を作製した。蛍光顕微鏡解析により、いず れ の AoGlycoDelete 候 補 株 で も EndoT-EGFP は ド ッ ド 状 の 蛍 光 と し て 観 察 さ れ 、 さ ら に 、
TM391-EndoT-EGFP発現株にゴルジ体マーカーを共発現することでEndoTがゴルジ体に局在するこ
とを確認した。そこで以降の実験には、TM391-EndoT株をAoGlycoDelete株として解析を行った。
3) AoGlycoDelete株を用いたAmyB-HA、GlaA-HAの分泌生産
野生株および TM391-EndoT 株を用いて、α-アミラーゼである AmyB、グルコアミラーゼである GlaAのHAタグ融合発現株を作製し、分泌生産されたAmyB-HA、GlaA-HAを精製した後、Intact MS およびN-glycan解析に供した。その結果、AoGlycoDelete株由来のAmyB-HA、GlaA-HAではGlcNAc が1分子残存し、さらにN-結合型糖鎖が検出されなかった。以上の結果からAoGlycoDelete株はN- 結合型糖鎖を欠損したGlcNAc-AmyB、GlcNAc-GlaAを生産することが示された。
以上の結果から、AoGlycoDelete株を用いた GlcNAcアミラーゼの分泌生産が確認され、今後様々 な有用糖タンパク質由来のGlcNAcタンパク質を分泌生産する宿主としての利用が期待される。
