C‑1.
1996年 度 神 奈 川 大 学 総 合 理 学 研 究 所 共 同研 究 成 果 報 告
1.研 究 テ ー マ
細 菌 と高等植物 にお ける細胞分裂 の制御 機構 の分 子遺伝 学的解析11
2.代 表 者 名
応用生物科学科 助手 安積良隆
3.研 究 プ ロ ジ ェ ク トメ ン バ ー
学 内=神 奈川大学 理 学部 応用生物科 学科 助 手 安積良隆 神 奈川大学 理 学部 応用生物科 学科 教授 鈴木秀穂 学外:横 浜市立大 学 木 原生物 学研究所 遺伝進化 学部 門 助 手 川上直人
4.研 究 期 間
1996年4月 〜1997年3月
5.研 究 の 目 的
細 胞分裂 は生 き物が成長 ある いは増殖(単 細 胞生物の場合)を するの に必須の プロセスで ある。 しか しこの細 胞分裂 は適 した 時期、適 した環境下 で行 われな ければ、 この 目的を達成 する ことはできず、 む しろその個体 は死 に追 いや られ る ことにな る。細 胞分裂の 開始 や休 止 を制御 している しくみ は非 常 に複雑な ものであるが これ を 明 らか にする ことは生命 現象を理 解す る上 で大きな進歩 であ り、か つまた非常 に重要な 意義 を持 つ。昨年度 に引き続 き、細 胞 分裂 の制御 が深 く関与する3つ の現象 につ いて研究 を行 った。(計 画1)細 菌類 も栄養条件 な どの環境 の変化 に対応 するため細胞 分裂の休止や 再開 を行 うが 比較 的、細胞の構 成が単純 で ある にもかかわ らず、 この現象が どのよ うな遺伝子 によ って制 御 され ているのかあま り多 くの ことはわか っていない。 この 現象 に関わる遺伝子 を突然変 異体 を作 出する ことによ って 単離 する。(計 画2)高 等 植物 では細 胞周期 に関する研究者 も少な く、研究 は進 んで いな い。 特 に減数分裂 は材料 の調達が難 しいため減数 分裂 誘導 の しくみ はほとん ど何 もわか って いな い。そ こで変異 体の作 成 、変異遺 伝子の 同定が容 易な植物 シロイヌナズナを用 いる こと によ り卵の形成 時に起 こる減数分裂 の誘導機構 を分子遺伝 学の手法 を用 いて解 明する。(計 画3)植 物 は受粉後 、胚形成 を行 った後、種子 と呼ばれ る状 態で季節が来 るまで休 眠 に入
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る。 そ して環境が整 うと細 胞分裂 を始 め、発芽 し発生 を開始 す る。 この休 眠 と発芽 を支 配 し て いる遺 伝子 を解析 する。
6.成 果
計 画1に 関 しては、大腸菌W3110株 を用 いて増殖期 か ら休止期 への移行(細 胞分裂の休 止)と 休 止期か ら増殖 期への移行(細 胞分裂の再 開)の 制御機 構 を調 べた。 まず休止期 か ら 抜 け出せな い(増 殖期 への移行 に必要な遺 伝子の)変 異 体を作 出するためW3110を ニ トロ ソグアニ ジンで処理 し、制限温度下 で増殖 で きな い温度 感受性突然変異体 を得た。 これ らは 単 に制 限温 度下 では細 胞分裂で きな い もの と休止期か ら増殖 期へ移行 できな いもの を含ん で いる と考 え られ る。 それで得 られた変異 体を許容温度 で培 養 し増殖期 に入 った後 、温度 を制 限温度 に上 げた。増殖 が停止す るもの は一般的な細胞分裂 の変異体 で、影 響 を受 けな いの も の は増殖 への移行 に変異 がある もの と考 え られる。繰 り返 し確認の 実験 を行 い、TSG11
1が その よ うな変異体 である ことを確認 した。 また休止期 に移 行で きな い変異体 を単離 する ため 、増殖 期 に入れな い変異体TSG111を 利用す る こと に した。TSG111に トラ ン スポ ゾ ンTn10を 導 入 し突然変異 を誘発 した後、休止期 に入る まで増殖 させ制限温度下 に 移 して プ レー ト上 で培養 した。休 止期 には行 ったTSG111は 増殖期 に入れな いので コ ロ ニ ーを形成 で きな い。 コロニー を形成 する ものはTn10の 挿入 によ り休止 期 に移行で きな くな った変異体で あると考 え られる。 この よ うな変異体TlM1、TlM2,TlM3、
TlM4を 得た。 これ らの変異体は長期 間培 養 した とき生存率 が野生型 に比 べ著 しく低下 す る。 これ は休止期 に入れ ず細 胞が休 止期の細 胞が持っ耐性 を獲 得する ことが できなか った め と考え られ る。 これ らの変異 体の変異 を起 こ した遺伝子 を同定するため 、変異 体の染色体
DNAの ライ ブラ リーを作製 し、 これか らTn10の 配列 をプ ロー ブと してスク リ〇ニ ング を行 った。得 られた ク ロー ンpHI1に は ごく小 さな断片 であるが変異体 の染色 体断片が含 まれて いた。今度 は この断片の配列を プローブ と し、野生型のW3110の 染色 体DNAに 対 して サザ ンハ イブ リダイゼー シ ョンを行 った ところ、 この 断片 に相 当す る断片が野生型大 腸 菌 に存在 する ことが 判明 した。 この領域 に存在 し、Tn10に よ って破壊 され た遺 伝子が
休止期へ の移行 に関与 している可能 性が非常 に強 い。
計画2で は シロイヌナズナを用 いて高等真 核生物 にお ける体細 胞分裂か ら減数 分裂 への転 換の機構 を調べる。 この ため に減数 分裂への移行 に関す る突然 変異体 を作成 し、その変異 し た遺伝子 を単離 し解析 する ことによ って 、減 数分裂 への細胞分裂様 式の転換期 には細 胞 内で どの様な ことが起 こ り、それ が どの様 に調節 されて いるか を明 らか にする。 この計画の第一 段階 と して卵で発現す る遺伝子 を単離する ことに した。 この 目的でデ ィフ ァレンシャルデ ィ ス プ レイ法 を行 った。 まず 、シ ロイヌナズ ナの葉 と開花後の花全体 と開花前の若 いつ ぼみか ら摘 出 した雌 しべか らRNAを 抽出 した。3種 類の1次 プライマーを用 いて、それぞれの
RNAか ら逆 転写 を行 いPCRの 鋳 型 を用意 した。 これ らの鋳 型を もとに3種 類 の1次 プラ イマ ーと16種 類の2次 プライマーの48種 類 の組み合わせ でPCR反 応 を行 った。 これ ら のPCR産 物 を シークエ ンスゲル電 気泳動 によ って分離 しそれ ぞれ のPCR産 物 の組織 特異
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性 を調 べ て み た 。 最 初 の デ ィ フ ァ レンシ ャル デ ィス プ レイ で 全 部 で2582の 産 物 を確 認 す る こ とが で きた が 、そ の 中で 若 い雌 しべ に特 異 的 と考 え られ る もの は242個 で あ った 。 こ れ らの産 物 の 組織 特 異 性 を確 認 す る た め に82個 を 選抜 し、デ ィフ ァ レン シ ャル サザ ンハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョン を行 った。82個 の うち 有 力 と考 え られ る もの10個 につ い て 、 さ らに 組織 特 異 性 を確 認 す る た め に ノ ーザ ンハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ンの実 験 を行 った 。 この 中のA‑
10‑1、A‑13‑2、C‑1‑6、C‑9‑1、C‑12‑1の5個 の 産 物 に 関 して は 雌 しべ の み に特 異 的 で あ る こ とが 確 認 され た 。 残 りの5個 の もの に 関 して は ノー ザ ンハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョンの 感度 以 下 で確 認 す る こ とが で きな か った 。先 の5個 に 関 して は そ のPCR断 片 をpCR‑
scriptと 呼 ば れ る プ ラス ミ ドにク ローニ ング す るの に成 功 した 。 ま た これ らのPCR産 物 が 由来 したmRNAの 完全 長 のcDNAを 得 る た め に、 シ ロイ ヌナ ズ ナ の 花 器 官全 て を含 む
cDNAラ イ ブ ラ リー を作 製 した。 この ライ ブ ラ リーの ス ク リー』ニン グ を行 った 結 果 、A‑
7‑4に つ いて は約1300塩 基 対 のcDNAを 含 む ク ロー ンを得 る こ とが で き た 。 この ク ロ0ン は雌 しべ 特 異 的 と考 え られ 、 これ を解 析 す る こ と によ って雌 しべ 形 成 過 程 の 一端 を 知 る こ とが で き る と考 え られ る 。 そ して も しこれ が 卵 で 特 異 的 に発 現 す る もの で あれ ば 当初 の
目的 で あ る卵 の 形 成 過 程 の 減 数 分裂 の機 構 を解 明 す る に非 常 に役 立 っ もの と考 え られ る 。 計 画3で は 、休 眠 を す る正 常 な 系統 の 小 麦 と休 眠 を しな くな った 突然 変 異 株 を用 いて 、 休 眠 をす る しくみ につ い て調 べて いる 。休 眠 し完 熟 した種 子 で 発 現 す る遺 伝 子 に これ らの 小 麦 の 間で 差 異 が 認 め られ る か ど うか を、 無細 胞 翻 訳 系 を 用 い てmRNAか らタ ンパ ク質 を合 成 し2次 元 電 気 泳 動 によ って 分析 した と こ ろ、 変 異 体 で は種 子 の 完熟 時 に蓄積 しな い タ ンパ ク 質 が い く つか 存 在 す る こ とが確 認 され た。 これ らの タ ンパ ク質 が休 眠 を引 き起 こすの に 関係 して い る可 能 性 が 考 え られ る 。 これ らの タ ンパ ク質 の 遺 伝 子 を デ ィフ ァ レン シ ャル ス ク リー ニ ング法 を用 い る こと に よ って ク ロー ニ ング す る こ と に成 功 した 。 その1っ をpE24と 名 付 けた 。 この ク ロー ンの 由来 した 遺伝 子 のmRNAの 蓄積 量 を経 時 的 に調 べ てみ た と ころ 、 こ の 遺 伝 子 のmRNAは 正 常な 小 麦 で は種 が熟 す る につれ て 蓄積 量 が 増加 して い たが 、休 眠 し な い変 異 株 で は や は り蓄積 が 認 め られ な か った 。 この ク ロー ンの 持 つcDNAの 大 き さ は約 1000塩 基 対 で 、 これ に コー ドされ て いる タ ンパ ク 質 の大 き さ は約32kDaで あ る ことが わ か った。 この ク ロ ー ンの 塩 基 配 列 と似 た 配 列 が 既 知 の遺 伝 子 にな い か調 べ て み た が 相 同 生 の 高 い もの は存 在 しな か った 。 この遺 伝 子 の 機 能 を調 べ る た め この遺 伝 子 を シ ロ イヌ ナ ズ ナ に 形質 導 入 してみ た と ころ 、多 くの 形質 転 換 体 で 子 葉 と い った 種 子 中 で見 られ る器 官 にお い て 異 常 が認 め られ た 。 この こと は この遺 伝 子 が 種 子 形 成 に何 らか の 働 き を して い る こ と を示 唆
して いる もの と考 え られ る。
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7.成 果 発 表
日本植物生理 学会1996年 度年会
1996年3月27日 〜29日 、鹿児島 、鹿 児島大学教養部 コムギ種子発 達過 程 における休 眠関連遺伝子 の発現
川上直人 、野 田和 彦
穂 発 芽 研 究 会 第2回 ワー ク シ ョツプ
1997年1月27日 〜28日 、 北海 道 河 西 郡 芽 室 町 種 子 休 眠 に関 す る 分 子 生 物 学 的 ア プ ロー チ
川 上 直 人
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