RANKL 処理 RAW264.7 細胞の NFATc1 発現に対する Palmatine 抑制効果

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RANKL 処理 RAW264.7 細胞の NFATc1 発現に対する Palmatine 抑制効果

■

Palmatine _ʼ s Suppression on NFATc1 for RANKL treated RAW264.7 Cells

■

金木清美石川慎太郎張夢小林善之樋口毅史金田祥明池本英志砂川正隆久光正

ABSTRACT

Objectives Isoquinoline alkaloid palmatine isolated from plants, such as Coptidis rhizoma, has long been known as a natural yellow pigment. Previously, we have reported that palmatine inhibited bone loss in an osteoporosis model, and mentioned the effect of palmatine for apopto- sis_︱induction and resorption_︱depression on osteoclast. However, there is no concrete evidence about an effect of palmatine for differentiation of osteoclast.

Methods This study investigated whether the effect of palmatine could reflect osteoclast activation via Nuclear factor of activated T︱cells, cytoplasmic 1（NFATc1）, the genetic transcrip- tion factor on osteoclast differentiation, or not.

Results Palmatine decreased receptor activator of nuclear factor kappa︱B ligand（RANKL）︱

induced bone resorption in RAW264.7cells like osteoclast cell. The mRNA expression and protein of NFATc1 in RANKL_︱treated RAW264.7cells were inhibited by palmatine treatment.

Conclusions These results demonstrated that palmatine inhibited RANKL_︱mediated osteoclast differentiation in RAW264.7cells in a dose_︱dependent manner. In conclusion, palmatine may have therapeutic potential in preventing bone loss.

（Jpn Pharmacol Ther 2016；44：997 1004）

KEY WORDS RAW264.7 cell_，Differentiation of osteoclast_，Bone resorption_，Nuclear factor of activated T︱cells，cytoplasmic 1（NFATc1），Receptor activator of nuclear factor kappa︱B ligand（RANKL），Palmatine

昭和大学医学部生理学講座生体制御学部門

Kiyomi Kaneki, Shintaro Ishikawa, Meng Zhang, Yoshiyuki Kobayashi, Takeshi Higuchi, Yasuaki Kanada, Hideshi Ikemoto, Masataka Suna- gawa, and Tadashi Hisamitsu: Department of Physiology, School of Medicine, Showa University

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はじめに

骨はリン酸カルシウムの一種であるヒドロキシアパタイトとⅠ型コラーゲンを主成分とした組織である。骨内部では破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成がつねに繰り返されている。この骨代謝は「骨リモデリング」とよばれ，骨の強度の維持や血清カルシウム濃度の調節における重要な役割を果たしている。しかしこの骨代謝のバランスが崩れ，

破骨細胞による骨吸収が亢進すると骨損失を招き，

骨粗鬆症，関節リウマチ，歯周炎などに伴う骨破壊が発生する¹^～³^）。

単球╱マクロファージ系細胞の融合から生じる多核巨細胞である破骨細胞は石灰化した骨を再吸収できる唯一の細胞である^4,5^）。破骨細胞の成熟および分化は骨芽細胞╱ストローマ細胞上で発現されるmac- rophage colony_︱stimulating factor_（M_︱CSF_），receptor activator of nuclear factor kappa︱B ligand（RANKL），

osteoprotegerin（OPG）などがおもな調節因子である⁵^～⁷^）。腫瘍壊死因子（tumor nercrosis factor: TNF_）スーパーファミリーに属するRANKLは，破骨細胞の前駆細胞に発現するNF_︱κF活性化受容体

（RANK）に結合すると，RANKの細胞内ドメインにTNF receptor︱associated factor（TRAF）︱6などのアダプター分子が会合し，各種の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（MKK，ERK，JNK，p38など）が活性化され，最終的にc_︱Fos_やnuclear factor of activated T cell c1（NFATc1），PU.1などの転写因子の発現が調節されることによって破骨細胞分化が進行する^1,5^）。とくに破骨細胞分化初期にRANK_シグナルによってNFATc1の発現レベルが劇的に上昇し，破骨細胞の前駆細胞にNFATc1を強制的に発現

させるとRANKLの刺激なしで破骨細胞分化が誘導

されることなどの事実からNFATc1は破骨細胞分化に必須な転写因子であると考えられている^1,8^～¹⁰^）。

Palmatineは黄連（Coptis Rhizoma）や黄柏（Phel- lodendri Cortex）などの植物から単離されるプロトベルベリン系のアルカロイドである^11,12^）。Palmatine の逆転写酵素活性に対する阻害作用は炎症あるいは腫瘍に対して有効であるとの報告がある^4,13^～¹⁵^）。ま

たpalmatineに近い構造をもつイソキノリン・アル

カロイドは骨粗鬆症モデルにおいて骨損失を阻害す

ると報告されている¹⁶^）。われわれは以前，palmatine が骨粗鬆症モデルにおいて骨量の減少を抑制すること¹¹^），また破骨細胞のアポトーシスを誘導する可能性について報告した¹⁷^）。しかしながらpalmatine_の破骨細胞分化に対する効果について本質的な証拠はない。そこで本研究では，RANKL処理された

RAW264.7細胞を用いて，破骨細胞マスター転写因

子であるNFATc1に対するpalmatineの影響を検討した。

Ⅰ 材料と方法

1 _{細胞の培養}

本実験で使用したRAW264.7_{細胞は，大日本住友} 製薬㈱（大阪）から購入した。細胞株に10％牛胎児血清（Fetal bovine serum; Flow Laboratories，North Ride_，Australia_）を含むD_︱MEM_（SIGMA JAPAN_，東京）培地を用い，37℃，5％CO2条件で培養し，実験に用いた。なお，すべての測定はtriplicateにて行った。

2 _{培養細胞への薬物投与}

Palmatine_（Palmatine Chloride_，10605_︱02_︱4_；和光純薬工業㈱（大阪））はPBSで溶解後に培地に溶解され終濃度が1，5，10，40および100μMになるように調整された^18,19^）。またRAW264.7_{細胞の分化} を誘導する目的で50 ng╱mLのRANKL（recombinant mouse RANKL_，462_︱TEC_︱010; R & D systems_，Inc.

Minneapolis，MN，USA）とともに培地に添加された⁵^）。

3 _{細胞生存率の測定}

細胞生存率は，Cell Counting Kit︱8（CCK︱8;

Dojindo，熊本）を使用して測定された²⁰^）。細胞は，

96_︱well_︱plate_に5_⊠10³_╱well_{の割合で播種され，}24 時間後にpalmatineおよびRANKLを含んだ調整培地に置換された。24_{時間後あるいは}5_{日後，細胞は} 3回PBSで洗浄，10％CCK︱8試薬含有培地に置換し，さらに1時間37℃で静置，450 nmの吸光度を測定した。細胞生存率は得られた吸光度から以下の公式に従って算出された。

細胞生存率（％）＝［OD_（experimental sample_）－OD

（blank）］╱［OD（control）－OD

（blank）］⊠100％

(3)

4 _{骨吸収活性の測定}

RAW264.7細胞は，骨吸収活性評価用プレート

（Bone Resorption Assay kit 24; PG research，東京）に 5_⊠10⁴_╱wellになるように播種され，24_時間後に palmatineおよびRANKL含有培地に置換された。5 日間培養後，培養上清100μLが96 wellプレートに移され，50_μLの骨吸収試薬を添加後，蛍光強度測定プレートリーダー（Twinkle LB970; Berthold Japan_{，東京）を用いて}excitation: 485 nm_，emission:

535 nmで測定された。さらに骨吸収活性評価用プ

レートの骨吸収像は，5％次亜塩素酸ナトリウムで処理後，光学顕微鏡（BX53_，DP21_{；オリンパス社，}

東京）によって撮影された。

5 NFATc1_の測定

NFATc1 発現はNuclear Factor Of Activated T︱ Cells，Cytoplasmic 1，ELISA Kit（SEL941MU;

Cloud_︱Clone Corp., Houston_，TX_，USA_{）を用いて} 測定された。RAW264.7細胞は，24 wellプレートに 5⊠10⁴╱wellになるように播種され，37℃，5％CO2

の環境下で培養された。24時間後にパルマチンおよ

びRANKL含有培地に置換された。24時間培養後，

細胞を回収して，付属のマニュアルに従って細胞質分画のライセートを作製し，ELISAの測定に用いた。なおNFATc1の測定限界は63 pg╱mLであった。

6 NFATc1 mRNA_の発現

RAW264.7細胞は1⊠10⁴╱wellとなるように24 well_{プレートに播種され，}24_時間後にpalmatine_お

よびRANKL含有培地に置換し，さらに24時間培

養した。細胞におけるNFATc1の遺伝子発現についてreal_︱time RT_︱PCRによる相対的定量法により解析を行った²¹^）。total RNAの抽出とcDNA合成には TaqMan^® Gene Expression Cells︱to︱CT^TM Kit

（Applied Biosystems_，CA_，USA_{）を使用した。細} 胞をLysis Solution（P╱N4383583）で溶解してtotal RNAを抽出後，逆転写酵素（RTEnzyme Mix; P_╱ N438358）と混合し，T100 Thermal Cycler（Bio︱Rad Co., Hercules，CA，USA）を用いてcDNAを合成し

た^22,23^）。PCR_{プライマーには}TaqMan Gene Expres-

sion Assayを使用し，ターゲット遺伝子として NFATc1_（Assay ID: Mm00479445_m1; Applied Bio- sysytem，CA，USA）を，内在性コントロールには 18S ribosomal RNA（Assay ID: Mm03928990_g1;

Applied Biosysytem_，CA_，USA_{）を選択した。}ABI- PRISM 7900HT Fast Real︱Time PCR System

（Applied Biosysytem，CA，USA）を用いて，95℃ で10_{分間留置した後，}95_℃で15_分および60_℃で1 分を1サイクルとして40サイクルの増幅反応を行い^22,23^），ABI PRISM 7900HT Sequence︱Detection System_（SDS_）sofyware 2.3_（Applied Biosystem_， CA，USA）を用いて解析し^22,23^），相対定量値（rela- tive quantification: RQ_{値）を求めた}²⁴^）_。

7 _{統計学的解析}

各測定項目の値は，平均値±標準偏差（mean± SD）で示した。得られた値の有意差検定は一元配置の分散分析（ANOVA）ならびにpost hoc︱testとしてScheffe testを用い，統計的有意水準は1_％，5_％未満とした。

Ⅱ 結果

1 _{骨吸収活性に対する}palmatine_の影響

骨吸収活性評価プレートにRAW264.7_細胞を5_⊠ 10⁴╱wellで播種し，24時間後にRANKL 50 ng╱mL およびpalmatineを含む培地に置換した。5_日間の培養後，5％次亜塩素酸ナトリウムで処理してカルシウム固層化プレートに形成された骨吸収窩（pit）を光学顕微鏡にて観察した。その結果，RANKL_添加群はcontrol群にくらべてpitが多く形成された。またpalmatine_{濃度依存性に}pit_{の数が減少し，吸収窩} は小さくなった（図1）。また当該プレートの培養上清中に溶出した蛍光標識リン酸カルシウム量を測定したところ，pit_{の結果と同様に}RANKL_{で有意に増} 大する蛍光強度がpalmatine濃度依存性に有意な減少を認めた（図2）。

2 _{細胞の生存率に対する}palmatine_の影響

RAW264.7細胞を96 wellプレートに5⊠10³╱well で播種し，24_時間後にRANKL 50 ng_╱mL_および palmatineを含む培地に置換した。24時間あるいは 5日間の培養後，Cell Counting Kit︱8（CCK︱8）を用いて細胞生存率を測定した。24_{時間培養では，}40 μM以上のpalmatine濃度で生存率が有意に減少した（図3A）。また5_{日間培養では，}control_群にくらべてRANKL添加群（0μM）で有意に増加するのに対して，10μM以上のpalmatineの添加で細胞生存

(4)

率は有意に減少した（図3B）。

3 _転写因子NFATc1_に対するpalmatine_の影響 RAW264.7_細胞を24 well_{プレートに}5_×10⁴_/well で播種し，24時間後にRANKL 50 ng/mLおよび palmatineを含む培地に置換した。24_{時間の培養後，}

培養細胞を回収して市販のELISAキットにて細胞内のNFATc1濃度を測定した。その結果，control群にくらべてRANKL_添加群（0_μM_{）で有意に増加す} るのに対して，10μM以上のpalmatineの添加で NFATc1量は有意に減少した（図4）。

4 _転写因子NFATc1_のmRNA_に対するpalmatine_の影響

RAW264.7_細胞を24 well_{プレートに}1_×10⁴_/well で播種し，24時間後にRANKL 50 ng/mLおよび palmatineを含む培地に置換した。24時間の培養後，

Real time RT PCR_によるNFATc1 mRNA_を測定した。その結果，RQ値はcontrol群にくらべて RANKL_添加群（0_μM）で有意に増加するのに対して，1μM以上のpalmatineの添加でNFATc1 mRNA 発現は有意に減少した（図5）。

図 2 骨吸収活性評価プレートを用いた蛍光標識リン酸カルシウムの観察

RAW264.7細胞に対してRANKL（50 ng/mL）および palmatine（0, 1, 10, 40, 100 μM）を投与後，5日間培養した骨吸収活性評価プレートの培養上清中に溶出した蛍光標識リン酸カルシウム量をELISA法で測定した。

＊＊P＜0.01，^†P＜0.05 vs. control

図 1 骨吸収活性評価プレートにおける骨吸収窩の観察

RAW264.7細胞に対してRANKL（50 ng/mL）およびpalmatine（0, 1, 10, 40, 100μM）を投与後，5日間培養した骨吸収活性評価プレートの吸収像。

○印が吸収窩を，barは500μmを示す。

Control（0μM） 0μM 1μM

10μM 40μM 100μM

(5)

Ⅲ 考察

骨組織は骨リモデリングとよばれる骨芽細胞と破骨細胞との微妙なバランスによって維持され，骨格の形成だけでなく，筋や神経を含めた多くの生体機能の調節に寄与する体内カルシウムの貯蔵庫としての役割をもち，さまざまな生体機能に関与する^6,25^〜²⁹^）。骨組織の代表的な疾患である骨粗鬆症は，悪性腫瘍や脳血管障害，虚血性心疾患のように疾患自体が生命をおびやかす病気ではないが，二次

的に起こる骨折による疼痛や日常生活動作の制限による介護などQOLを著しく低下させる^30,31^）とともに社会的経済負担の大きい疾患の一つである³²^）。閉経後の骨粗鬆症は，破骨細胞による骨吸収がおもな要因である高回転型骨粗鬆症として知られ，破骨細胞や骨芽細胞の分化および機能にかかわる分子機構の解明および骨代謝を調節しうる物質の探索は高齢社会を迎える国々において解決すべき必須の課題である。われわれはこれまでにpalmatineが閉経後骨粗鬆症の進行を抑制する候補物質になりうること，

図 3 _{細胞の生存率に対する}palmatine_の影響

RAW264.7細胞に対してRANKL（50 ng/mL）およびpalmatine（0, 1, 10, 40, 100μM）を添加して24時間（A）あるいは5日間培養（B）した後の細胞生存率をCell Counting Kit 8により測定し，以下の式で算出した。

（式）細胞生存率（％）＝［OD（experimental sample）OD（blank）］/［OD（control）OD（blank）］×100％

＊＊P＜0.01，^†P＜0.05 vs. control

図 5 _転写因子NFATc1_のmRNA_に対するpalmatine の影響

RANKL（50 ng/mL）およびpalmatine（0, 1, 10, 40, 100 μM）を投与後，24時間培養したRAW264.7細胞におけ

るNFATc1 mRNAの発現を観察した。

＊＊P＜0.01，^†P＜0.05 vs. control 図 4 _転写因子NFATc1_に対するpalmatine_の影響

RANKL（50 ng/mL）およびpalmatine（0, 1, 10, 40, 100 μM）を投与後，24時間培養したRAW264.7細胞におけ

るNFATc1の発現を観察した。

＊P＜0.05，^†P＜0.05 vs. control

(6)

また破骨細胞の機能を抑制する可能性について報告

した^11,17^）。しかしながら破骨細胞における細胞内伝

達シグナルについての検討については行っていない。そこで本研究では，破骨細胞様細胞である RAW264.7細胞におけるRANKL誘導性分化機構に着目して，破骨細胞分化に対するpalmatineの影響を解明することを目的とした。

第一の検討では，RANKL誘導性破骨細胞による骨吸収活性を観察した。骨吸収窩の画像からcontrol 群に対してRANKLを添加すると多くの骨吸収の痕跡が認められ，今回のRANKL濃度（50 ng╱mL）が至適に破骨細胞の分化・成熟を促していることを示している。それに対してpalmatineを投与すると濃度依存的に骨吸収窩が減少し，破骨細胞による骨吸収能が低下していることが推察された（図1）。また骨吸収能を示す培養上清中の蛍光標識リン酸カルシウム量の検討においても骨吸収窩の結果と同様に RANKLで有意に増大する蛍光強度がpalmatine濃度依存性に有意に減少したことは（図2），骨吸収窩の結果を客観的に支持し，palmatine_{が破骨細胞の} 分化・成熟に直接影響することを示唆する。さらに RAW264.7_細胞のpalmatine_{に対する細胞生存率に} ついて検討したところ，5日間培養後の生存率は10 μM以上のpalmatine濃度で有意に減少しており，蛍光標識リン酸カルシウム量の検討の結果と一致した。これらの結果は先行研究であるIshikawaらの

palmatineが破骨細胞様細胞の初期にアポトーシス

を誘導する¹⁷^）という見解を支持している。

第二の検討では，RANKL誘導性破骨細胞による細胞内伝達シグナルを観察した。まずpalmatine_の 24時間刺激での細胞生存率を観察した結果，40μM 以上で有意な生存率の減少を認めた。次に破骨細胞分化のマスター転写因子であるNFATc1^6,33,34^）_がpal- matineに依存するか検討したところ，10μMの

palmatine添加で有意に減少することが判明した。

さらにNFATc1 mRNAについては1μMで発現量が有意に減少していた。これらの結果は，palmatineが転写因子であるNFATc1の遺伝子発現を抑制して破骨細胞の分化および成熟が制御されたことを示唆している。

破骨細胞は，骨基質の脱灰およびタンパク質の分解を行う唯一の細胞である³⁵^～³⁷^）。生体での破骨細

胞分化調節因子としてはM_︱CSF_とRANKL_に加え TNF︱αなど多種の生理活性物質が重要な役割を果たしている^25,27^）。われわれの検討では閉経後モデル動物にpalmatineを投与すると骨芽細胞由来の RANKL分泌²⁶^）を制御することが判明しており¹¹^），骨芽細胞や骨細胞を介した骨免疫学的な作用と破骨細胞への直接的作用をあわせもつ骨吸収抑制物質である可能性が示唆された。

結論

Palmatineは用量依存的に破骨細胞分化調節因子

であるRANKLの分泌を制御し，破骨細胞の分化お

よび成熟を抑制することから骨損失の予防に関与している可能性が推察される。

抄録

目的 palmatineは黄連などの生薬から分離される

イソキノリン・アルカロイドである。われわれはこ

れまでにpalmatineが骨粗鬆症モデルにおいて破骨

細胞を減少させること，またRAW264.7_{細胞を用い} て破骨細胞化の初期のアポトーシスを誘導する可能性を報告した。しかしながら，破骨細胞分化あるいは骨吸収において，palmatine_{がどのように関与し} ているか詳細は不明である。そこで本研究では

RAW264.7細胞を用いて，破骨細胞分化および骨吸

収に関わるNFATc1発現に着目してpalmatineの影響を検討した。

方法破骨細胞様細胞であるRAW264.7_細胞に RANKL（50 ng╱mL）およびPalmatine（0，1，5， 10，40，100μM）を添加し，骨吸収活性，細胞の生存率，転写因子NFATc1_発現，NFATc1 mRNA_発現について検討した。

結果 RAW264.7_細胞にRANKL_{を添加すると骨吸} 収，細胞増加，NFATc1発現，NFATc1 mRNA発現のいずれにおいても有意に増加した。しかしpalma- tineを添加群では濃度依存的にそれらのパラメーターの有意な減少が認められた。

考察 Palmatine_{は破骨細胞の転写因子}NFAIc1_を抑制し，破骨細胞の分化および成熟を制御することが推察された。

(7)

【利益相反】本研究に関し開示すべき利益相反はない。

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受理日（2016︱05︱18），採択日（2016︱06︱20）

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RANKL 処理 RAW264.7 細胞の NFATc1 発現に 対する Palmatine 抑制効果