ズッキーニによる有症苦情事例の原因物質の解明－苦味成分ククルビタシン類の一斉分析法の検討及び定量分析－

(1)

兵庫県立健康生活科学研究所健康科学研究ンー研究報告第9号2018

- 11 -

［ノート］

ズッキーニによる有症苦情事例

原因物質

解明

－苦味成分ククルビタシン類

一斉分析法

検討及び定量分析－

岡

直樹

村

素行

Determination of Cucurbitacins and the Glycoside by LC/MS

in Food Poisoning Caused by Zucchini

Naoki Y

OSHIOKA

and Motoyuki N

OMURA

Health Science Research Division, Public Health Science Research Center, Hyogo Prefectural

Institute of Public Health and Consumer Sciences 2-1-29 Arata-cho Hyogo-ku Kobe 652-0032

Japan

A rapid LC/MS method was developed for determination of cucurbitacin B cucurbitacin D cucurbitacin E cucurbitacin I and elaterinide (cucurbitacin E 2-O-_-D-glucopyranoside) in zucchini. Cucurbitacins were extracted with methanol and diluted with 50% methanol, and the extract was passed through a syringe filter, and then analyzed by LC/MS The recoveries of cucurbitacins spiked into zucchini at 1 µg/g ranged from 96 to 102 % and the limits of quantitation (LOQ) were 0.1 µg/g (cucurbitacin B) 0.2 µg/g (cucurbitacin E and cucurbitacin I) 0.3 µg/g (cucurbitacin D) and 0.4 µg/g (elaterinide) This method was applied to the remaining zucchini samples from a food poisoning case Cucurbitacin B (0.19–2.3 µg/g) cucurbitacin E (0.22–1.5 µg/g) and elaterinide (650–1600 µg/g) were detected in the remaining samples

じめに

ウ科植物中苦味成あン

類を含こあ嘔や痢症状を引起ここ

知い国内過去ウオ1,2)

3,4)

ー 5)等中毒事例報告さ

兵庫県い成28 観賞用ウン誤

食中毒発生し 6)

今回成29 兵庫県内発生しー

症苦情事例いンB D E

I びエテンE 2-

O

--D- コ

健康科学部

別刷請求：〒652-0032 神戸市兵庫荒町2-1-29

兵庫県立健康生活科学研究所健康科学研究ンー

健康科学部岡直樹

LC/MSを用い析法を検討し喫食残品等

定析を行報告

材料と方法

1 事件概要

1.1 発生成29 6

1.2 喫食者数 6

1.3 症者数 5

1.4 発生状況

成29 6 兵庫県内福祉施設い昼食

しーぷを喫食し 6 うち5

(2)

- 12 -

2 試料

本事例喫食残品あーぷ (1)

び保存検食ーぷ (2) 並び調理

使用し残品あー (3) び未使用

ー (4)を試料し (3) いう

縦半断し部(3-U) 中央部(3-M) し (4)

い半断部(4-U) 中央部(4-M)

部(4-L) し点線部を中心試料ン

ンを行陰性対照し市販ー

を用い (Fig. 1)

3 試薬び試液

標準品しンB ンD,

ンE ンI ChromaDex製

びエテ Sigma-Aldrich製を用い (Fig.

2) ン 2 mg エテ 1 mgを

ノー溶解し 10 mL し 200 µg/mL

100 µg/mL 標準原液しこを混し 50%

v/v ノー希釈し 0.005 µg/mL～1 µg/mL

検線用混標準溶液を調製し

β- コーーン来東京成製

を用いノーび高速液体

用関東学製酸ンウ特級

和純薬製を用いンー GE

製Puradisc13 PVDF製 0.45 µm を使用し

4 装置

ホー IKA製ULTRA-TURRAX T8を使用

し遠心機日立工機製CF6RNを使用し LC-MS

Agilent製1200 Series LC び6210 TOF-MSDを用い

5 測定条件

LC-MS 測定条件を表示し (Table 1)

6 試験溶液調製

試料5 gを50 mL遠沈管入ノー 25 mLを加

え 1 間ホし抽出しホー

刃を水洗いこ洗液抽出液を併水 50 mL

しこ溶液一部を採し遠心

10000 rpm 3 間を行清をン

ー過しを試験溶液しこを50% v/v

ノー適宜希釈し LC/MS 析し

Fig.1 Pictures of remaining food samples of the case.

Fig.1 Zucchini tempura (1)(2) and zucchini (3)(4)

(3-U)

(3-M)

(3)

(1)

(2)

(4)

(4-U)

(4-M)

(4-L)

Cucurbitacin B (1) O

O CH3 O

H3C CH3

H3C CH3 O HO H CH3 H CH3 OH H CH3

Cucurbitacin D (2) HO

CH3

O CH3

H3C CH3 O HO H CH3 H CH3 OH H CH3

Cucurbitacin E (3) O

O CH3 O

H3C CH3

H3C CH3 O HO H CH3 H CH3 OH H HOCH3O CH3

Cucurbitacin I (4) HO

CH3

O CH3

H3C CH3 O HO H CH3 H CH3 OH H HO CH3 O CH3

Elaterinide (Cucurbitacin E 2-O--D-glucopyranoside) (5) O

O CH3 O

H3C CH3

H3C CH3 O O H CH3 H CH3 OH H HO CH3 O CH3 O H HO H HO H H OH H OH

Fig.2 Chemical structures of cucurbitacins and

(3)

- 13 -

7. 試験溶液酵素加水解

50 mL し調理残品ー試料

(3-U) 抽出液を5 mL採ーーエバー

濃縮水を5 mL加え溶解し溶媒を置換しこ

容器をコ 2 mL 採 β- コ

ーを20 mg添加し添加しい対照

を37℃ 恒温槽入 24時間放置し応

ーーエバー ― 濃縮し 50% v/v

ノーを2 mL加え溶解しをン

ー過し LC/MS用試験溶液し

結果及び考察

1. 析法検討

試験溶液調製法以前報告しウン中

ンB 析様方法6)を用いノー

抽出を行を水希釈定容しン

ー過しを試験溶液し LC/MS 析

い今回ン類複数成時

析あ前報用いテ

く - 酸ンウ系エン

溶出を用い

定び確認用いオンい

ンB E ンウ付加体 [M NH4]+ を定オ

ンし基脱し [M OCOCH3]+ を確

認オンし用いンD I

[M H H2O]+ を定オンしさ H2O 脱し

[M H 2H2O]+ を確認オンしエテ

い糖び基脱し [M

C6H10O5 OCOCH3]+ を定オンしンウ

付加体 [M NH4]+ を確認オンし用い

5種ン類い検線 0.02

µg/mL ンB E 0.005 µg/mL ～1 µg/mL

範良好直線性 R2≧0.999 得

2. 試験溶液酵素加水解

喫食残品び調理残品中ンB D E

Iを予試験析しこンD I 検出

さンB E 1 µg/g程度過去中

毒事例比べ非常い値あししこ

LC/MS 約5 付近精密質

ン配糖体ンB コ：

738.4059 [M+NH4]+ ンE コ：

736.3903 [M+NH4]+ 推定さー確認さ

LC parameters Column GL sciences Inertsil ODS-3 (150 mm×3.0 mm, 3 µm)

Mobile phase A: 10 mmol/L ammonium formate

B: acetonitrile

Gradient elution _{A:B = 60:40 (0 min)}

→ 60:40 (3 min) → 30:70 (10 min) → 30:70 (20 min)

→ 60:40 (20.01 min)

Flow rate 0.4 mL/min

Column temperature 40℃

Injection volume 5 µL

MS conditions Ionization mode ESI (Positive)

Capillary voltage 4000 V

Nebulizer pressure 50 psi

Drying gas 10 L/min (350℃)

Fragmentor voltage 100 V

Scan range (m/z) 40-1050

Cucurbitacin B：576.3531 [M+NH₄]

+_{and 499.3054 [M-OCOCH}

3]+

Cucurbitacin D：499.3054 [M+H‐H₂O]

+_{and 481.2949 [M+H}

‐2H₂O] +

Cucurbitacin E：574.3374 [M+NH₄]

+_{and 497.2898 [M-OCOCH}

3]+ Cucurbitacin I：497.2898 [M+H‐H₂O]

+_{and 479.2792 [M +H}

‐2H₂O] +

Elaterinide：497.2898 [M‐C₆H₁₀O₅‐OCOCH₃]

+_{and 736.3903 [M+NH}

4]+

Reference mass (m/z) 121.0509 (purine) and 922.0098 (hexakis (1H,1H,3H

-tetrafluoropropoxy)phosphazine) Target and qualifier

(4)

- 14 -

抽出液を機溶媒酵素失活を防

溶媒を濃縮乾固し水再溶解し水溶液

し Kawahara 条件7)を参考 β- コーを

用い加水解を行

LC/MS 析結果酵素加水解を行方 β

-コーを添加し対照比較し

ンB 約7倍ン E 約190倍増加

しこンE コ推定さ

ー 736.3903 [M+NH4]+ 明減少見

こンB E β- コ

含推定さ (Fig.3 Table 2)

ンコうち標準品入手可

能あエテンE 2-

O

-β

-D-コびンB D E I い

市販ー 1 µg/g相当添加し回試験

n=5 を行結果回率 96%以良好

結果得ンびエテ保

持時間付近妨害ー認 (Table

3 Fig.4)

Fig.3 Extracted ion chromatograms obtained from negative control (A) and zucchini extract incubated with -glucosidse (B). 1: cucurbitacin B, 3: cucurbitacin E

Table 2 Contents of cucurbitacins in zucchini after enzymatic

Table 2 hydrolysis

Compound Recovery

(%)

Cucurbitacin B 100.9 1.4

Cucurbitacin D 102.1 2.6

Cucurbitacin E 101.7 2.3

Cucurbitacin I 96.3 4.1

Elaterinide 100.3 4.9

(n=5) RSD

(%) Incubated with

-glucosidase

Cucurbitacin B 12

Cucurbitacin E 210

Compound

Concentration (µg/g)

1.8 1.1 Negative control

Table 3 Recoveries of cucurbitacins spiked into zucchini

Table 3 at 1 µg/g 0

1 2 3

0 1 2 3

0 5

0 1

0 1 0

1 2

x105

0 1 2

0 5 10 15 20 25 30

m/z 738.4059±0.01

Retention Time (min)

m/z 736.3903±0.01

0 5 10 15 20 25 30

x105

m/z 574.3374±0.01

0 5 10 15 20 25 30

x105

m/z 576.3531±0.01

x104

0 5 10 15 20 25 30

x105

m/z 736.3903±0.01

x105

m/z 738.4059±0.01

x105

m/z 574.3374±0.01

0 5 10 15 20 25 30

x104

m/z 576.3531±0.01

1

3

1 A

B

(5)

- 15 -

陰性対照ーこ物

定限界未満あ

定限界(

S/N

=10) ー 1 µg/g相当添加し

試験溶液 0.1 µg/g

ンB 0.2 µg/g ンE, I 0.3 µg/g

ンD 0.4 µg/g エテ算出

さ

4. 喫食び調理残品等析結果

本中毒事例喫食び調理残品等析結果い

喫食残品ーぷ (1) エテ

を790 µg/g 保存検食ーぷ

(2) ンEを0.22 µg/g エテを

1200 µg/g検出し他ン類い

定限界未満あ保存検食ー

ぷ (2) LC/MS を示し

(Fig.5)

調理使用し残品あー (3) び未

使用ー (4) ンBを0.19～

2.3 µg/g ンEを0.70～1.5 µg/g検出しほ

エテを650～1600 µg/g検出しこ

含をー採部別調べ部(3-U

4-U) び中央部(3-M, 4-M) 特含差見

部(4-L) い部び中央部

い傾あ推測さ (Table 4)

Fig.4 Typical extracted ion chromatograms obtained from zucchini spiked with cucurbitacins at 1 µg/g (A) and

Fig.4 blank zucchini (B). 1: cucurbitacin B, 2: cucurbitacin D, 3: cucurbitacin E, 4: cucurbitacin I, 5: elaterinide

x103

0 1 2 3

0 5 10 15 20 25 30

m/z 576.3531±0.01 m/z 576.3531±0.01

x103

0 1 2 3

0 5 10 15 20 25 30

x103

0 1 2

0 5 10 15 20 25 30

m/z 499.3054±0.01 x103

0 1

2 m/z 499.3054±0.01

0 5 10 15 20 25 30

1

2

x103

0 0.5

1 _{m/z 574.3374}±0.01

0 5 10 15 20 25 30

x103

0 0.5

1 _{m/z 574.3374}±0.01

0 5 10 15 20 25 30

3

x103

0 1

0 5 10 15 20 25 30

m/z 497.2898±0.01 x103

0 1

m/z 497.2898±0.01

0 5 10 15 20 25 30

5

4

Retention Time (min) Retention Time (min)

A

B

Cucurbitacin B ND ND

Cucurbitacin D ND ND ND ND ND ND ND

Cucurbitacin E ND ND

Cucurbitacin I ND ND ND ND ND ND ND Elaterinide 790 1200 1500 1600 1000 1600 650

0.75

4-U 4-M 2.3

0.94 4-L

0.19

0.22

1.9

1.5

3-M 0.35

0.70 Zucchini

tempura (2) Compound

Concentration (µg/g)

3-U

1.3

Zucchini (4) Zucchini (3)

Zucchini tempura (1)

(6)

- 16 -

ン類急性毒性いウ経

口投与い LD10 ンB 5 mg/kg体

LD50 ンE 340 mg/kg体エテ

40 mg/kg体あほンB び

ンE 5 mg/kg体投与エテ

2 mg/kg体投与ウ緩作用(laxative

activity)を示しいう報告8) あ今回検出さ

ン類中エテ緩作用最

高さエテ薬品療機器

等品質効性び安全性確保等関法

劇薬指定さいコン実ウ科植物

コンウ果実あ強い瀉作用を示

主成いう報告9) あ

けー入ー中毒事

例調理残品び生体試料析例報告さい

10)

本報告中死亡事例い調理残品生

ーンB 28 µg/g E 221 µg/g

I 63 µg/g びエテ 8.9 µg/g 検出さ

患者血清エテ尿

ンI びエテ検出さい別中毒

事例生存い調理済ー

ンB 118 µg/g E 681 µg/g I 74 µg/g

エテ尿ンB びエ

テ検出さー中毒析

いン加えエテ析

要あ思わ

今回うン類濃度あ検体

いエテ等ン配糖体を

高濃度含例あ中毒事例析い

注意必要あこ

結

論

ウ科植物苦味成あンB D E

I びエテ一斉析法を検討し成29

兵庫県発生しー症苦情事例喫食

び調理残品等ンBを0.19～2.3 µg/g ンEを0.22～1.5 µg/g検出しほエテを650～1600 µg/g検出し

謝

辞

試料採情報し頂し県生活衛生課関

係者方々深謝致し

文

献

1) 村行弘真木俊観公子永山敏廣直井家壽：

学物質び自然毒食中毒等事件例第1報

昭和55 ～昭和57 東京衛研報 34

171-177 (1983)

2) 菊池哲藤嗣佐藤幸小寺誠藤泰久

井義博：出血性腸炎をしン中毒

一例中毒研究 30 334-335 (2017)

3) 大城直佐久川さ：沖縄県け学物質

自然毒食中毒び苦情事例成20 度

沖縄県衛生環境研究所報 43 181-184 (2009)

4) 中佳代子秋谷人渡邉和彦辻亜子坂実

穗山﨑匠子：苦情事例け中

ン検査い杉並衛試報 34 40-42

(2016)

5) 岡敏行赤木章村美浅幸男波順子：

食品薬品等含害学物質等析技

術開発関研究ウ科植物含苦味

Fig.5 Extracted ion chromatograms obtained from the remaining food sample, zucchini tempura (2) 1: cucurbitacin B (< LOQ) , 3: cucurbitacin E, 5: elaterinide

x106

0 0.5 1 x103

0 0.5 1 1.5 x102

0 0.5 1

m/z 574.3374±0.01

m/z 497.2898±0.01

m/z 576.3531±0.01

0 5 10 15 20 25 30

1

3

(7)

- 17 -

成ン析法検討岡山県環境保健

ンー報 39 153-157 (2015)

6) 岡直樹昌史：観賞用ウン中毒

原因物質推定さ苦味成ンB

析兵庫県立健康生活科学研究所健康科学研究ン

ー研究報告 8 26-29 (2017)

7)Kawahara, N., Kurata, A., Hakamatsuka, T., Sekita, S. and Satake, M. : Two new cucurbitacin glucosides, opercurins A and B, from the Brazilian

folk medicine “Buchinha” (

Luffa operculata

). Chem. Pharm. Bull., 52, 1018-1020 (2004)

8) Le Men, J., Buffard, G., Provost, J., Tiberghien, R., Forgacs, P., Lagrange, E., Albert, O., Aurousseau, M. : Relations entre la structure de quelques

cucurbitacines, leur toxicité et leur activité laxative. Chimie Thérapeutique, 6, 459-465 (1969) 9) Yoshikawa, M., Morikawa, T., Kobayashi, H.,

Nakamura, A., Matsuhira, K., Nakamura, S. and Matsuda, H. : Bioactive saponins and glycosides. XXVII. Structures of new cucurbitane-type triterpene glycosides and antiallergic constituents from

Citrullus colocynthis

. Chem. Pharm. Bull., 55, 428-434 (2007)

10)Bajcsik, N., Pfab, R. and Pietsch, J. : Simultaneous determination of cucurbitacin B, E, I and E-glucoside in plant material and body fluids by HPLC–MS. J. Chrom. B, 1052, 128-134 (2017)