CGCAAAGACAATGGCGGCCAAGTTTCTTCTCACCATTCTTGTCACCTTTGCGGCCGTCGC M A A KF L L TrLV TF A A V A
N末端延長ペプチド
07r◎−⊥
TAGCCTTGGCATGGCCGACAATGTCCTGCTCTCCGGGCAAACTCTGCATGCCGACCACTC 120
今成熟タルクリン
TCTCCAGGCGGGCGCCTATACCTTAACCATACAAAACAAGTGCAACCTGGTGAAATACCA 180
GAACGGGAGGCAGATCTGGGCTAGCAACACTGACAGGCGGGGCTCCGGCTGCCGCCTCAC 240
ATTGCTGAGTGACGGGAACCTCGTTATCTACGACCACAACAACAACGACGTGTGGGGGAG 300 L L S D G N L V Z Y D H N N N D V W G S 97
i
CGCCTGCTGGGGGGACAACGGCAAGTATGCTCTTGTTCTT（AGAAGGATGGCAGATTTGT 360 A C W G D N G K Y A L V L Q K D G R F V 117 CATCTATGGCCCGGTTTTGTGGTCCCTTGGCCCTAATGGGTGCCGCCGTGTTAATGGTGG 420
{G 137
AATCACAGTTGCTAAGGATTCTACTGAACCACAACATGAGGATATTAAGATGGTGATTAA 480 Z T V A K D S T E P Q H E D 1 K M V 1 N 157
C末端延長ペプチド
タルクリンcDNA ↓PCR
PCR産物
コ
↓pUC18に クローニング EcoR I
Sa 1 、
pCUR−m 3．1Kb EcoR I Sa／1
pMAL−p2
6．7Kb
マルトース結合 タンパク質
EcoR I
Sai 1
マルトース結合 タンパク質
EcoR I■■■■Sa／I
T4DNAリガーゼ
図V−2 マルトース結合タンパク質一タルクリン融合タンパク質発現プラスミドの構築
kD 1 2 3
49．5一獄『『
32．5 一
27．5−
1 8e5
図V−3 マルトース結合タンパク質一タルクリン融合タンパク質の発現（イムノブロッティン
グ）
レーン1，2；大腸菌BL21／pMCU−m罪体破砕液上清、レーン3；大腸菌BL21／pMCU−m菌体
破砕液沈殿。
一67一
kD 1 Q 3 4 5
94．0 ×一 一 i
l；：8：＝き繋舞
30．0 一一一 e
20．1 一一 sis
14．4 一一一 t ・蝋
図V−4 マルト・・ 一一 ス結合タンパク質一タルクリン融合タンパク質のFactor Xa protease消
化物のSDS−PAGE
レーン1；分子量マーカr、レーン2−4；融合タンパク質のFactor Xa protease消化物、レ ーン5；天然タルクリン。Factor Xa protease消化により得られたタルクリン部分を矢印で示
した。
v
V−3−2．チオレドキシンークルクリン融合タンパク質の大腸菌における発現
天然タルクリン（二量体）は、分子内に1つ、分子間に2つのジスルフィド結合が存在 する。組換えタルクリンが天然タルクリンと同じ立体構造を形成し、活性を発現するため
には、これらのジスルフィド結合を正しい位置に結合させることが重要であると考えられ る。ここでは、外来タンパク質の発現系として、チオレドキシンとの融合タンパク質の系
（pET−32a）を用いた。この系では、菌体内でのジスルフィド結合形成が可能になる。
まず、pCU R−mよりタルクリンをコードするDNA断片を切り出し、 pET−32aのもつ チオレドキシン遺伝子の下流に挿入した。これにより、チオレドキシンークルクリン融合
タンパク質発現プラスミドpTCU−mを構築した（図V−5）。
つぎに、pTCU−mを用いて大腸菌AD494を形質転換し、形質転換菌
AD494／pTCU−mを得た。これを用いてチオレドキシンークルクリン融合タンパク質を試 みたところ、菌体破砕液の上清および沈殿に、約1：1の割合で、分子量約35，000のタ
ンパク質の発現を確認した（図V−6）。また、このタンパク質は抗タルクリン血清と交差 反応を示すことから（図V一一 6）、目的タンパク質であることを確認した。さらに、還元剤 の入っていない菌体破砕液上清では、融合タンパク質の二量体（分子量約70，000）のバ
ンドが認められた（図V−6）。
一68一
今回確立したチオレドキシンとの融合タンパク質の系では、可溶性タンパク質としてタ ルクリンを得ることができた。さらに、融合タンパク質の二量体が存在していることから、
タルクリン部分の分子間ジスルフィド結合が形成されていると考えられる。このことから、
組換えタルクリンが天然タルクリンと同様な立体構造を形成し、活性を有するタルクリン が得られることを期待している。
EcoR I
Sal I