B鎖
■11
loL一一
59
鎖 鎖A B
4
イh
T
毛h
・T
予昏
ツ
Q R
5C
P23ch⁝田
V 一鎖 鎖B B
図H−18ペプチドT−5−2、T−6、 T−6−Th−1およびT−6−Th−3の構造
F︒﹂．●0︐・F ●ウ・﹂．︐O●・F 0 5る ︵ざ︾ZOn工O
o 10 20 30
溶出時間
図ll 一 19 逆相HPK）によるT−6のtherlnolysin消化物の分離
カラム：Vydac 218TP54（4．6 mm×250mm）、溶離液：A；5％C：H3CN（0．05％TFAを含む），B；
40％C：H3CN（0．05％TFAを含む）， A→B（30分、直線濃度勾配）、流速：11n1／min・検出：210 m1 の紫外吸光測定。 1
一29一
加・
表ll−1 ペプチドT−5−2、 T−6、 T一一6−Th−1およびT−6−Th−3のアミノ酸組成分析
Amino acids
T−5−2 T−6 T 6 Th 1 T 6 Th−3 Asx （B）Glx （Z）
Gly （G）
Arg （R）
Ala （A）
Pro （P）
Va皿（V）
IRe （1）
Leu （L）
Phe （F）
Cys （C）
5．4 （5）
3．6 （3）
2．5 （2）
1．0＊ （1）
2．5 （2）
2．0 （2）
1．9 （2）
（4）
1．4 （1）
2．3 （2）
1．1 （1）
3．5 （4）
1．0＊ （1）
2．8 （3）
2．ミ（35
1．0 （1）
1．3 （1）
O．7 （1）
（4）
1．4 （1）
2．2 （2）
1．5 （2）
1．0＊ （1）
O．9 （1）
（2）
1．4 （1）
1．1 （1）
1．9 （2）
1．7 （2）
1．0＊ （1）
（2）
Total （21） （22） （9） （9）
各アミノ酸は（＊）を1としたときの値。（）の値はマビンリンHのアミノ酸配列からの計算値。
表H−2ペプチドT−5−2、T−6−Th−1およびT−6−Th−3のアミノ酸配列分析
Cycle Amino acid
T−5−2 T 6eTh−1 T 6 Th 3
1
ヲロ
ヲ ロ ウ ウ ウ ウ ヲ
C
タ ウ
ロ
C ロ ー AC
一30一
錫」 一．．L
第川章 耐熱性甘味タンパク質マビンリン11の
cDNAクローニングおよび大腸菌における発現
二一1．序
これまでに行われてきた甘味タンパク質の研究は、モネリンおよびソーマチンの例があ
る。モネリンでは、有機化学的手法により合成したモネリンを用いて、B鎖の7番目の
アスパラギン酸が甘味活性部位である可能性が高いことが示されている（35）。ソーマチンで は、遺伝子工学的手法によりその発現・生産系の確立が試みられているが（36 43）、いずれも 活性を有するソーマチンは得られていない。また、これまでに知られている甘味タンパク 質（モネリン、ソーマチン、マビンリン、ブラゼイン）の間には、アミノ酸配列の相同性
はない。
前章においてタンパク質化学的手法によりマビンリン同族体の構造を明らかにした。さ らにマビンリンの甘味活性部位に関する研究を進めるためには、マビンリンを人工的に合 成することができる系を確立する必要がある。タンパク質を合成するには、有機化学的に 合成する方法および遺伝子工学的に合成する方法が考えられる。有機化学的手法では、
100残基程度のような長いポリペプチド鎖を合成することは難しい。そこで、遺伝子工学 的手法によりマビンリンの生産系の確立を試みた。
本章では、まずマビンリンll・cDNAのクローニングを行った（18）。 cDNAクローニング は、遺伝子工学的手法によるタンパク質の生産に用いるDNAを得るためだけでなく、タ ンパク質化学的手法では得られない前駆体タンパク質の構造を解明することができる。つ づいて、大腸菌を用いたマビンリンllの発現・生産系の確立を試みたα9）。
皿一2．材料および方法
皿一2−1．材料 A）材料
Cmasaikaiの果実は、中国雲南省地方に自生する植物体から収集し、実験に使用する まで一80℃以下で保存したものを用いた。
Oligotex−dT Super、各種酵素、 p U C 18；宝酒造（株）
cDNA synthesis kit； Bcehringer−Mannheim
（］bmpl et e rap id cloning sys tem 1−lybond N redlprime DNA labell ing system，
PeroXidase標識抗ウサギIg G血清、 ECL試薬；Arnersham
一一R1一
DNA合成；グライナージャパン（株）
pET−15b； Novagen
抗マビンリンII血清；Nakajoらの方法（11）により調製したもの RXフイルム；富士写真フイルム（株）
Chelating Sepharose， PD−10； Pharmacia LKB Biotechnology
その他の試薬は、すべて特級、生化学用または遺伝子工学用を使用した。
B）実験装置
：pOlymerase chain reaction（PCR）装置；DNA Thermal Cycler PJ2000、 Perkin Elmer
HPLC；PC8011、東ソー（株）
分光旋光計；Jasco J−720、日本分光（株）
アミノ酸配列自動分析計；PPSQ−10 Protein Sequencer、 Shimadzu
C）培地組成
Luria−Bertani（LB）培地；1％tryptone，0．5％yeast eXtract，0．5％NaC1
皿一2−2．cDNAライブラリーの作製
C㎜af1面の種子からpheno1−SDS法（44）により全RNAを抽出した。このRNAから
Ol igot ex−dT Sup erによりpoly（A）＋RNAを精製した（45）。このpoly（A）＋RNAを鋳型に
d）NA synthesis kitにより二本鎖cDNAを合成した（46）。得られた二本鎖cDNAは
（bmplete raPid cloning sys temによりファージベクターλgt 10に挿入したのち、バク テリオファージにパッケージングし、大腸菌中で増殖させた。
三一2−3．プローブの作製
C． mas aikal の種子から抽出した全RNAを鋳型として、 reverse t rans crip tion（RT）一
PCR法によりcD NAライブラリーをスクリーニングするためのプローブを作成した。ま ず、以下に示す2種類のオリゴヌクレオチド1およびllを合成した。オリゴヌクレオチド 1には、制限酵素Nde Iサイト、成熟マピンリンll A鎖N末端を、オリゴヌクレオチドII
には、成熟マビンリンll B th C末端、終止コドン、制限酵素denlH Iサイトをコードし た。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、盟一PCRを行った。 PCRは、
96℃、7分間につづいて、96℃、1分間、50℃、1分間、72℃、1分間を30回繰り返し
たのち、72℃、10分間行った。つぎに、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動に一32一
願■1■闘■■プー
より分離した。つついて、これを切り出して精製したのち、T4 DNA polymeras eを用い て平滑末端とした。さらに、これをプラスミドベクターpU C 18のSma Iサイトに挿入し・
pMABPCR 1を作成した。 Sangerらの方法（47）によりpMAB P（）R 1の塩基配列を分析した・
オリゴヌクレオチド1
5，一AG CATATG CARYT工TGGMGITGYCA−3
Nde l 成熟マビンリンll・A鎖N末端
オリゴヌクレオチドII