P. phosphoreum
とM. morganii
の 菌 体 抽 出 液 の ゲ ル ろ 過 の 結 果 を Fig.5-1 と Fig. 5-2 に 示 す 。
P. phosphoreum
の 構 成 的 HDC は ゲ ル ろ 過 で の 分 画 番 号 37〜 43（ ピ ー ク I 画 分 ）、 ま た 誘 導 性 HDC は 47〜 53（ ピ ー ク II 画 分 ） に 溶 出 し た 。 な お 、 分 画 番 号 67〜 75 の 範 囲 に ピ ー ク （ ピ ー ク III） を 認 め た が 、 こ れ に つ い て は そ の 分 子 量 か ら HDC で は な い 。 他 方 、M. morganii
の 菌 体 抽 出 液 の ゲ ル ろ 過 で 得 た HDC 活 性 の ピ ー ク は 1 つ だ け で 、 そ の 分 画 番 号 はP. phosphoreum
の ピ ー ク II の そ れ と 一 致 し た 。 こ の ピ ー ク II 画 分 は L-ヒ ス チ ジ ン 無 添 加 培 地 で 培 養 し たM. morganii
で は 確 認 で き な か っ た 。 し た が っ て 、M. morganii
が 産 生 す る HDC は 誘 導 酵 素 で あ り 、ま た こ の ピ ー ク II 画 分 が 誘 導 性 HDC で ある こ と は
P. phosphoreum
で も 認 め て い る 。
Fig. 5-1. Typical elution profile of Photobacterium phosphoreum histidine decarboxylase from a Sepharose CL-6B column. Crude extracts applied to the column were prepared from P. phosphoreum grown in SWYP broth containing 0.2% L-histidine at 20ÞC for 24 h under aerobic stationary conditions.
―, histidine decarboxylase activity; …, absorbance at 280 nm.
0 1 2
Absorbance at 280
Ⅱ
Ⅰ Ⅲ
0 20 40 60 80
0 1 2 3
Fraction number
Fig. 5-2. Typical elution profile of Morganella morganii histidine decarboxylase from a Sepharose CL-6B column. Crude extracts applied to the column was prepared from M. morganii grown in YP broth containing 0.2% L-histidine at 37ÞC for 24 h under aerobic stationary conditions.
―, histidine decarboxylase activity; …, absorbance at 280 nm .
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0 1 2
Absorbance at 280
Fraction number
0 8
0 1 2 3 4 5
0
様 々 な 培 養 条 件 で 生 育 し た
P. phosphoreum
の HDC 活 性様 々 な 温 度 、 pH お よ び NaCl 濃 度 下 で 培 養 し た
P. phosphoreum
の 菌 体 抽 出 液 の タ ン パ ク 質 含 量 、 HDC の 総 活 性 と 比 活 性 お よ び ゲ ル ろ 過 で 分 画 し た 構 成 的 HDC と 誘 導 的 HDC の 割 合 を 各 々 Table 5-1、 5-2 お よ び 5-3 に 示 す 。異 な る 温 度 下 で 培 養 し た 菌 体 か ら の 抽 出 液 に 関 し て は（ Table 5-1）、
HDC の 比 活 性 は 7˚C で 培 養 し た 菌 体 で は 最 も 高 く 、 15℃ 〜 25˚C 培 養 菌 体 が こ れ に 続 き 、 4˚C と 27˚C 培 養 菌 体 で は 極 め て 低 か っ た 。 ま た 構 成 的 HDC と 誘 導 性 HDC の 割 合 を 見 る と 、 7℃ 〜 25˚C 培 養 菌 体 で は 誘 導 性 HDC が 83〜 93％ を 占 め 誘 導 性 HDC の 割 合 は 7˚C 培 養 菌 体 で 最 も 高 く か っ た 。 な お 、 4 お よ び 27˚C 培 養 菌 体 で は 誘 導 性 HDC は そ れ ぞ れ 61%お よ び 37%に 低 下 し 、 4˚C 培 養 で は 生 育 速 度 の 低 下 お よ び 27˚C 培 養 で は 生 育 抑 制 が 示 唆 さ れ た 。
Crude extract % activity of HDC
4 9 24.2 7.1 0.29 39 61 60
7 3 25.7 37.9 1.47 7 93 65
15 1 27.3 17.5 0.64 11 89 64
20 1 26.3 16.3 0.62 17 83 54
25 1 25.8 17.2 0.67 11 89 55
27 1 19.4 5.0 0.26 63 37 64
Table 5-1 The effects of growth temperature on the formation of constitutive and inducible histidine decarboxylases from Photobacterium phosphoreum
Incu-bation period (days)
Tem- pera-ture (ÞC)
Protein content (mg)
Total HDC (units*)
Specific activity (units/mg)
* One unit is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmole of histamine at 25℃ for 1 h.
Inducible enzyme
(%) Constitutive
enzyme (%)
HDC recovery
(%)
HDC, histidine decarboxylase.
異 な る pH で 培 養 し た 菌 体 か ら の 抽 出 液 に 関 し て は（ Table 5-2）、HDC の 比 活 性 は pH 6.0 で の 培 養 菌 体 で 最 も 高 く 、 そ れ 以 下 の pH で の 培 養 菌 体 で は 急 激 に 低 下 し 、そ れ 以 上 の pH で の 培 養 菌 体 で は 徐 々 に 低 下 し た 。こ れ は 供 試 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 が pH 6.0 で 最 も 高 く 、そ れ 以 下 で は 急 激 に 低 下 し 、 そ れ 以 上 で は 徐 々 に 低 下 す る こ と を 示 し て い る 。 pH 5.0 〜 8.0 で の 培 養 で は 、pH の 上 昇 に 伴 い 誘 導 性 HDC の 割 合 が 増 加 し 、 pH の 低 下 に 伴 い そ の 割 合 は 減 少 し た 。
Crude extract % activity of HDC
5.0 22.0 1.0 0.05 27 73 60
5.5 30.3 6.8 0.22 25 75 56
6.0 33.4 20.7 0.62 17 83 54
6.5 29.5 12.4 0.42 17 83 60
7.0 28.3 10.2 0.36 19 81 59
7.5 27.6 6.7 0.24 3 97 58
8.0 28.0 5.0 0.18 6 94 55
* One unit is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmole of histamine at 25℃ for 1 h.
Table 5-2. The effects of initial medium pH level on the formation of constitutive and inducible histidine decarboxylases from Phtobacterium phosphoreum
Protein content (mg)
Total HDC (units*)
Specific activity (units/mg)
Constitutive enzyme
(%)
Inducible enzyme
(%)
HDC recocery
(%) pH
HDC, histidine decarboxylase.
異 な る NaCl 濃 度 で 培 養 し た 菌 体 か ら の 抽 出 液 に 関 し て は （ Table 5-3）、HDC の 比 活 性 は 5% NaCl で の 培 養 菌 体 で 特 に 高 く 、1% お よ び 3%
NaCl 培 養 菌 体 が こ れ に 続 い だ 。ま た 、構 成 的 HDC と 誘 導 性 HDC の 割 合 を 見 る と 、培 地 の NaCl 濃 度 が 上 昇 す る に つ れ て 誘 導 性 HDC の 割 合 は 急 激 に 増 加 し 、 つ ま り 誘 導 性 HDC の 割 合 は 1% NaCl 培 養 菌 体 で は 6%で あ っ た が 、 5% NaCl 培 養 菌 体 で は 97%で あ っ た 。 ま た 、 海 水 の 代 わ り に NaCl を 用 い た 培 地 で 培 養 し た 菌 体 か ら の 抽 出 液 で は 、 ゲ ル ろ 過 で の HDC の 回 収 率 が 著 し く 高 か っ た 。な お 、3% NaCl 存 在 下 で 最 も 良 い 生 育 を 示 し 、 1%お よ び 5% NaCl で は 若 干 生 育 は 低 下 し た 。
Crude extract % activity of HDC
1 16.9 7.1 0.42 94 6 84
3 25.5 8.2 0.32 40 60 89
5 20.3 22.1 1.09 3 97 86
* One unit is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmole of histamine at 25℃ for 1 h.
Constitutive enzyme
(%)
Inducible enzyme
(%)
HDC recovery
(%)
HDC, histidine decarboxylase.
Table 5-3. The effects of medium NaCl concentration on the formation of constitutive and inducible histidine decarboxylases from Photobacterium phosphoreum
NaCl
(%) Protein content (mg)
Total HDC (units*)
Specific activity (units/mg)
P. phosphoreum
か ら 調 製 し た 構 成 的 HDC と 誘 導 性 HDC の 活 性 に 及 ぼ す 温 度 、 pH お よ び NaCl 濃 度 の 影 響P. phosphoreum
か ら 調 製 し た 構 成 的 HDC と 誘 導 性 HDC の 活 性 に 及 ぼ す 温 度 、pH お よ び NaCl 濃 度 の 影 響 を 調 べ た 結 果 を 、そ れ ぞ れ Fig. 5-3、5-4 お よ び 5-5 に 示 す 。
Fig. 5-3 に 示 す よ う に 、 誘 導 性 HDC と 構 成 的 HDC の 至 適 温 度 は 各 々 30˚C と 40˚C で あ っ た 。ま た 、構 成 的 HDC は 誘 導 性 HDC に 比 べ よ り 高 温 で 、誘 導 性 HDC は 構 成 的 HDC に 比 べ よ り 低 温 で 作 用 し 、特 に 誘 導 性 HDC は 0℃ で も 最 大 値 の 25％ の 活 性 を 示 し た 。
Fig. 5-4 に 示 す よ う に 、構 成 的 HDC お よ び 誘 導 性 HDC の 至 適 pH は 各 々 6.0 と 6.5 で あ っ た 。 ま た 、 pH 5.0 で は 誘 導 性 HDC が 全 く 活 性 を 示 さ な か っ た が 、構 成 的 HDC は 最 大 値 の 約 40％ の 活 性 を 示 し 、逆 に pH 8.0 で は 構 成 的 HDC は 全 く 活 性 を 示 さ な か っ た が 、 誘 導 性 HDC は 最 大 値 の 50％ 程 度 の 活 性 を 示 し た 。
0 10 20 30 40 50 60
0 25 50 75 100
Temperature (ÞC)
Fig. 5-3. The effects of reaction temperatures on the activity of constitutive and inducible histidine decarboxylases from Photobacterium phosphoreum.
○, constitutive histidine decarboxylase; ●, inducible histidine decarboxylase.
5 6 7 8
0 25 50 75 100
Relative activity
pH
Fig. 5-4. The effects of reaction pH levels on the activity of constitutive and inducible histidine decarboxylases from Photobacterium phosphoreum.
○, constitutive histidine decarboxylase; ●, inducible histidine decarboxylase.
Fig. 5-5 に 示 す よ う に 、 構 成 的 HDC お よ び 誘 導 性 HDC と も NaCl が 存 在 し な い 状 態 で 活 性 は 最 も 高 く 、NaCl 濃 度 の 増 加 に 伴 い そ れ ら の 活 性 は 低 下 し た 。
0 0.5 1 1.5 2 2.5
0 25 50 75 100
NaCl (%)
Fig. 5-5. The effects of reaction NaCl concentrations on the activity of constitutive and inducible histidine decarboxylases from
Photobacterium phosphoreum.
○, constitutive histidine decarboxylase; ●, inducible histidine decarboxylase.
考 察
M. morganii
な ど の 既 報 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 の HDC は 誘 導 性 と 考 え ら れ て い る２ ６ 、 ２ ７ ）。今 回 供 試 し たM. morganii
も 誘 導 性 の HDC を 産 生 し た 。M.morganii
な ど の ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 が 構 成 的 な HDC を 産 生 し な い と い う 報 告 は 見 当 た ら な い が 、 今 回 供 試 し たM. morganii
は そ れ を 産 生 し な か っ た 。 し か し な が ら 今 回 、P. phosphoreum
は 構 成 的 な HDC を 産 生 し 、 そ の 特 異 性 が 示 唆 さ れ た 。今 回 、
P. phosphoreum
は 15℃ 〜 25˚C 付 近 で 生 育 は 良 く 、 そ れ 以 下 で は 生 育 は 抑 制 さ れ た 。 し か し な が ら 、P. phosphoreum
か ら の 菌 体 抽 出 液 の HDC 活 性 は 、 7˚C 培 養 菌 体 は 15℃ 〜 25˚C 培 養 菌 体 に 比 べ 極 め て 高 い 値 を 示 し た 。 こ の よ う な 結 果 は 他 の 菌 に つ い て も 知 ら れ て い る 。 例 え ば 、 Gale２ ５ ）はE. coli
菌 体 の HDC 活 性 は 37˚C 培 養 よ り 27℃ 培 養 の 方 が 高 い こ と を 報 告 し て い る 。ま た 、
M. morganii
８ 、 ２ ０ 、 ３ ２ 、 ３ ３ ）お よ びPhotobacterium
株９ ）の 洗 浄 菌 体 の HDC 活 性 は 各 々 20〜 25˚C お よ び 15〜 20˚C 培 養 菌 体 で 最 大 値 を 得 て い る 。 ま た 今 回 、P. phosphoreum
の 7 ˚C 培 養 菌 体 は 他 の 温 度 で の 培 養 菌 体 に 比 べ 、 誘 導 性 HDC を 最 も 高 い 割 合 で 産 生 し た 。 こ れ ら の 結 果 は 、 7˚C 培 養 で 誘 導 性 HDC の 産 生 が 促 進 さ れ る こ と を 示 唆 す る 。 こ の 示 唆 は 、 低 温 貯 蔵 魚 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 関 連 し 、 極 め て 重 要 で あ る 。Allin１ ８ ）は 、 酸 性 培 地 が
Escherichia coli
とSalmonella
の HDC 産 生 を 促 進 す る と し た 。 Ienistea２ ９ ）は 洗 浄 菌 体 を 用 い た 実 験 で 、 多 く の 細 菌 の HDC 産 生 の た め の 至 適 pH は 5.0〜 5.5 で あ る と し た 。ま た 、 栗 原 ら９ ）に よ る とPhotobcerium
の HDC 活 性 が pH 4.5 で 最 大 で あ っ た と し て い る 。し か し な が ら 、供 試P. phosphoreum
か ら の 菌 体 抽 出 液 の HDC 活 性 は 、 pH 6.0 で 培 養 し た 菌 体 で 最 大 と な り 、 サ バ 科 魚 類 の 魚 肉 の pH 範 囲 が 5.5〜 6.5 で あ る１ １ 、 １ ２ 、 １ ３ ）こ と を 考 え る と 、 食 品 衛 生 学 的 見 地 か ら は 注 意 を 要 す る 。と こ ろ で 今 回 、培 地 の pH が 上 昇 す る に つ れ て 、 そ れ ら の 菌 体 中 の 誘 導 性 HDC の 割 合 が 高 く な り 、 こ の こ とは 誘 導 性 HDC が pH 8.0 で も 高 い 活 性 を 維 持 す る こ と と 関 連 が あ る と 思 わ れ る 。
供 試
P. phosphoreum
か ら の 菌 体 抽 出 液 の HDC 活 性 は 、 NaCl 濃 度 が 高 く な る に つ れ て 誘 導 性 HDC の 割 合 が 高 く な っ た こ と か ら 、NaCl 濃 度 の 上 昇 がP.phosphoreum
の HDC の 産 生 を 促 進 す る こ と を 示 唆 す る 。 と こ ろ で 、海 水 の 代 わ り に NaCl を 用 い た 培 地 で 培 養 し た 菌 体 か ら の 抽 出 液 で は 、 ゲ ル ろ 過 で の HDC の 回 収 率 が 著 し く 高 か っ た が 、 こ れ は 用 い た 培 地 で 代 謝 産 物 が 異 な っ た た め と 考 え る 。ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 温 度 は 、 洗 浄 菌 体 を 用 い た 実 験 で は 中 温 細 菌 で 37˚C２ ０ ）や 40˚C２ ５ ）な ど 、 低 温 細 菌 の
P. phosphoreum
で は 35〜 40˚C４ ）が 報 告 さ れ て い る 。こ れ ら と 比 べ 、今 回 の 誘 導 性 HDC の 反 応 至 適 温 度 は 30℃ で 、 こ れ ま で の 報 告 と 比 べ る と や や 低 い よ う で あ る 。 特 に 誘 導 性 HDC が 0℃ で 最 大 値 の 25％ の 活 性 を 示 し た こ と は 特 徴 的 で あ る 。 と こ ろ で 第 ３ 章 で 、
P. phosphoreum
の 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 温 度 は 40˚C と 報 告 し た が 、同 実 験 は ジ チ オ ト レ イ ト ー ル (DTT)無 添 加 で 行 っ て い る 。DTT 無 添 加 で は 誘 導 性 HDC は 分 解 さ れ る こ と 、ま た 今 回 の 実 験 で 構 成 的 HDC の 至 適 温 度 は 40℃ で あ っ た こ と か ら 、第 ３ 章 で 述 べ た 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 温 度 40˚C は 構 成 的 HDC の 活 性 を 反 映 し て い る と い え る 。ヒ ス タ ミ ン の 生 成 反 応 の 至 適 pH は 低 温 好 塩 性 菌 で pH 5.4４ ）、 中 温 性 細 菌 の
Proteus morganii
７ 、 ２ ０ ）やProteus vulagaris
２ ０ ）で p H 6.0〜 6.5 と 報 告 さ れ て い る 。 一 方 、 中 温 細 菌 は ア ル カ リ 側 で HDC 活 性 は 急 減 し て い る が 、 低 温 好 塩 菌 は ア ル カ リ 側 で の HDC 活 性 の 低 下 が 緩 慢 で あ る 。 供 試
P. phosphoreum
の 構 成 的 HDC の 至 適 pH は 6.0 で 、 誘 導 性 HDC の そ れ は 6.5 で あ り 、 既 報 の 菌 株 と ほ ぼ 同 様 で あ っ た 。 ま た 、 供 試 菌 の 誘 導 性 HDC は 低 温 好 塩 菌 と 同 様 に ア ル カ リ 域 で も そ の 活 性 が 高 か っ た 。 な お 、 中 温 性 細 菌 は 陸 生 細 菌 で 、 低 温 好 塩 性 細 菌 と 供 試 菌 は 海 洋 性 細 菌 で あ る 。 と こ ろ で 第 ３ 章 で 、P. phosphoreum
の 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 pH は 6.0 付 近 で あ っ た が 、 同 実 験 は DTT 無 添 加 で 行 っ て い る 。DTT 無 添 加 で は 誘 導 性 HDC は 分 解 さ れ る こ と 、ま た 今 回 の 実 験 で 構 成 的 HDC の 至 適 pH は 6.0 で あ っ た こ と か ら 、第 ３ 章 で 述 べ た 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 pH 6.0 は 構 成 的 HDC の 活 性 を 反 映 し て い る と い え る 。
ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 に 関 す る 研 究 の 多 く は 陸 棲 細 菌 に 関 し て 行 わ れ て お り 、し た が っ て ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 及 ぼ す NaCl の 影 響 に 関 し て 調 べ た 研 究 は ほ と ん ど 見 ら れ な い 。奥 積 ら４ ）は 低 温 好 塩 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 の 洗 浄 菌 体 を 用 い た 実 験 で 、ヒ ス タ ミ ン 生 成 に は NaCl の 濃 度 の 影 響 は ほ と ん ど 無 い と し て い る 。 と こ ろ が 今 回 、 供 試
P. phosphoreum
の 構 成 的 お よ び 誘 導 性 HDC と も NaCl の 存 在 し な い 状 態 で 最 も 高 く 、 NaCl 濃 度 の 増 加 に 伴 い そ れ ら の 活 性 は 低 下 し た 。ま た 第 ３ 章 で は 、P.
phhosphoreum
の 菌 体 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 活 性 は 2〜 4％ NaCl 存 在 下 で 極 め て 高 く 0、1 お よ び 5% NaCl で は 急 減 す る こ と 、ま た 菌 体 抽 出 液 で は NaCl 無 添 加 で 最 も 高 く NaCl 濃 度 の 増 加 に 伴 い そ の 活 性 が 低 下 す る こ と を 報 告 し 、 い ず れ の 結 果 も 奥 積 ら の 結 果 と 異 な っ た 。要 約
異 な る 温 度 、 pH お よ び NaCl 濃 度 で 培 養 し た