低温好塩性発光細菌Photobacterium phosphoreumの

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Title 低温好塩性発光細菌Photobacterium phosphoreumのヒスタミン生成に_{関する研究}

Author(s) 笠間, 憲太郎

Citation (2007-02-21)

Issue Date 2007-02-21

URL http://hdl.handle.net/10069/9253

Right

第 1 章 緒 論 サ バ 科 魚 類 な ど 、 い わ ゆ る 赤 身 魚 の 摂 食 に よ る ア レ ル ギ ー 様 食 中 毒 が 知 ら れ て お り 、 そ の 主 要 原 因 食 か ら サ バ 中 毒 と 呼 ば れ て い る 。 そ の 主 要 な 起 因 物 質 は ヒ ス タ ミ ン で あ り 、 ヒ ス タ ミ ン 中 毒 と も 呼 ば れ る 。 ヒ ス タ ミ ン は 動 物 、 植 物 お よ び 細 菌 に 広 く 分 布 す る 生 理 活 性 ア ミ ン の 1 つ で あ り 、 生 体 内 で つ く ら れ る 。 よ っ て 、 魚 自 身 も ヒ ス タ ミ ン を 産 生 す る 。 し か し な が ら 、 新 鮮 な 魚 肉 の ヒ ス タ ミ ン 含 量 は サ バ や カ ツ オ で も ご く 僅 か で６ 、 ６ ２ ）_{、中 毒 を 起 こ す 基 準 と さ れ て い る 50 mg%}２ ２ 、 ３ ８ ） 以 上 の ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 に は 細 菌 が 関 与 す る 。 と こ ろ で 、 こ れ ら ヒ ス タ ミ ン は ヒ ス チ ジ ン 脱 炭 酸 酵 素（ HDC）に よ る ヒ ス チ ジ ン か ら の 一 段 階 の 反 応 で 生 成 さ れ る 。 他 方 、 こ れ ら 生 成 さ れ た ヒ ス タ ミ ン は 分 解 さ れ る で あ ろ う１ ８ ）_{。 つ ま り 、 魚 肉 中 の ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 量 は 魚 肉 中 に 含} ま れ る 遊 離 ヒ ス チ ジ ン 量 、 汚 染 細 菌 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 、 お よ び 生 成 さ れ た ヒ ス タ ミ ン の 分 解 能 に よ っ て 定 ま る 。 魚 肉 中 に 含 ま れ る 遊 離 ヒ ス チ ジ ン 含 量 は 魚 種 に よ り 異 な る１ ４ ）_{。 ま} た 遊 離 ヒ ス チ ジ ン は 腐 敗 や 発 酵 に よ る タ ン パ ク 質 の 分 解 で も 増 加 す る 。 ヒ ス タ ミ ン は か っ て 腐 敗 毒 の 一 つ と 見 ら れ て い た が 、 こ れ は 腐 敗 に よ る 遊 離 ヒ ス チ ジ ン の 増 加 と 関 連 付 け ら れ る 。 し か し な が ら 、 ほ と ん ど の ヒ ス タ ミ ン 中 毒 が サ バ 科 魚 類 の よ う な 遊 離 ヒ ス チ ジ ン を も と も と 多 量 に 含 む 魚 の 摂 食 で 発 生 し て い る 。 ま た 、 遊 離 ヒ ス チ ジ ン を 多 量 に 含 む 魚 で は 腐 敗 が 認 め ら れ る 以 前 に 、 中 毒 発 症 量 を 超 え る ヒ ス タ ミ ン が 生 成 さ れ る 場 合 も 知 ら れ て い る１ ５ ）_。 汚 染 細 菌 に よ る 魚 肉 中 で の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 、 す な わ ち ヒ ス チ ジ ン 脱 炭 酸 酵 素（ HDC）の 産 生 能 お よ び 活 性 は 汚 染 細 菌 の 生 育 環 境 に 影 響 さ れ る 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 に つ い て は 多 く の 報 告 が あ る が 、 細 菌 の 種 類 と 生 育 環 境 と い う 観 点 か ら 腸 内 細 菌 を 主 体 と し た 中 温 性 の 陸 生 細 菌 、 低 温 性 好 塩 細 菌 お よ び 中 温 性 好 塩 細 菌 の 3 つ に 区 分 す る こ と が で き 、 後 の 2 つ 菌 群 は 海 水 環 境 に 分 布 し て い る 。 と こ ろ で 、 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 に 関 す る 初 期 の 報 告 は 全 て が 陸 生 細 菌 で あ り 、 Mellandby ら４ ２ ）

が モ ル モ ッ ト の 腸 内 容 物 か ら ヒ ス チ ジ ン を ヒ ス タ ミ ン に 変 換 す る 細 菌 を 分 離 し て 以 来 、 多 く の 陸 生 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 が 報 告 さ れ て い る１ 、 ５ 、 ３ ０ 、 ３ ３ 、 ５ ８ 、 ６ ０ ）_{。中 で も 1950 年 代 の 前 半 に 日 本 で 頻 発 し た ア レ ル} ギ ー 様 食 中 毒 の 原 因 菌 と し て 分 離 さ れ たProteus morganiiは 多 量 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 し た５ 、 ３ ０ 、 ３ ３ ）_{。 ま た 、 相 磯 ら}１ ）_{は 79 株 の ヒ ス タ ミ ン} 生 成 菌 （Escherichia、Aerobacter、P. mirabilis、P. vulgaris、P.

morganii、 Pseudomonas、Achromobacter お よ び Micrococcus）の ヒ ス

タ ミ ン 生 成 能 を 調 べ 、P. morganii が 種 特 異 的 に 多 量 の ヒ ス タ ミ ン を

生 成 す る こ と を 明 ら か に し た 。P. morganii は Morganella morganii

と 改 名 さ れ て い る が 、 現 在 も 代 表 的 な ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 と し て 知 ら れ て い る 。 Taylor ら６ ０ ）_{は 食 中 毒 の 原 因 試 料 （ マ グ ロ の 刺 身 ） か ら} Klebsiella pneumonia を 分 離 し 、 同 菌 が 食 中 毒 を 起 こ す の に 充 分 な 量 の ヒ ス タ ミ ン （ 442 mg/100 g） を 産 生 す る こ と を 観 察 し た 。 海 洋 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 、 特 に 低 温 細 菌 は Photobacterium phosphoreum に 限 定 さ れ て い る 様 で あ る 。飯 田２ ）_{は ヒ ス タ ミ ン を 生 成} す る P. phosphoreum を 分 離 し 、 同 菌 が 10℃ 以 下 で も 良 く 生 育 す る こ と か ら 食 品 衛 生 上 重 要 で あ る と し て い る 。van Spreekens６ １ ）_{は 少 量 の} 発 光 細 菌 で 汚 染 さ せ た 真 空 パ ッ ク の 塩 付 け ニ シ ン で 多 量 の ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 を 観 察 し た 。 Okuzumi ら４ ７ 、 ４ ８ ）_{は 5℃ お よ び 20℃ に 貯 蔵 し た} サ バ 肉 ホ モ ジ ネ ー ト 試 料 か ら 低 温 好 塩 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 を 分 離 し N 菌 群 細 菌 と 称 し た 。N 菌 群 細 菌 は 発 光 と チ ト ク ロ ム オ キ シ ダ ー ゼ の 有 無 に よ り I 型（ 発 光 +／ チ ト ク ロ ム オ キ シ ダ ー ゼ +）、II 型（ +／ -）、III 型 （ -／ +） お よ び IV 型 （ -／ -） に 分 か れ 、 II 型 は P. phosphoreum と し た 。 な お 、 N 菌 群 細 菌 は 後 に 遺 伝 型 お よ び 表 現 型 分 析 に よ り P. phosphoreum に 分 類 さ れ た２ ４ ）_{。 Morii ら}４ ４ 、 ４ ５ ）_{は サ バ と ニ シ ン の 氷} 冷 と 10℃ 貯 蔵 を 行 い 、 皮 と 内 臓 か ら 分 離 し た 90 株 の 発 光 細 菌 の う ち 85 株 が P. phosphoreum で こ れ ら 全 て に ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 が 見 ら れ 、 残 り 5 株 の 発 光 細 菌 Vibrio logeiと 他 の 非 発 光 細 菌 に は ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は な か っ た と 報 告 し て い る 。 ま た 、 低 温 貯 蔵 し た サ バ 肉 中 の ヒ ス タ ミ ン 量 と P. phosphoreum の 生 育 と の 相 関 性 か ら 、低 温 貯 蔵 魚 に お け

る ヒ ス タ ミ ン 生 成 に は も っ ぱ らP. phosphoreumが 関 与 す る と 述 べ て い

る 。 一 方 、 中 温 性 の 海 洋 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 と し て は Aeromonas

histaminum３ ）_{、Vibrio alginolyticus}６ ２ ）_{お よ び C 菌}１ ６ 、 １ ７ ）_{が 報 告}

さ れ て い る 。 与 口 ら は C 菌 が P. morganii に 匹 敵 す る ほ ど の 強 い ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 を も ち 、夏 場 の 海 水 や 魚 に 出 現 し 、海 水 が 20℃ 以 下 に な る と 減 少 す る こ と を 観 察 し て い る 。 な お 、 同 菌 は 遺 伝 型 お よ び 表 現 型 分 析 に よ り P. damsellae に 分 類 さ れ た３ ５ ）_。 ヒ ス タ ミ ン 産 生 に 関 す る 研 究 は ほ と ん ど が 陸 生 の 中 温 細 菌 を 対 象 と し た も の で 、 細 菌 培 養 や 洗 浄 菌 体 を 用 い て HDC 産 生 能 や HDC 活 性 が 調 べ ら れ て い る 。Koessler ら３ ６ ）_{は 腸 内 細 菌 を 用 い た 実 験 で 、ヒ ス タ ミ} ン 生 成 培 地 は 酸 性 で 、 グ リ セ ロ ー ル や グ ル コ ー ス の よ う な 容 易 に 利 用 さ れ る 炭 素 原 を 添 加 す る 必 要 が あ る と 報 告 し た 。 Gale２ ５ ）_{は E. coli} の HDC 産 生 の 至 適 温 度 は 20〜 26℃ で あ り 、37℃ で は 産 生 は 著 し く 抑 制 さ れ る と し て い る 。一 方 、Clostridium welchii１ ９ ）_{で は 25℃ よ り 37℃} の 方 が 良 い と し て い る 。 河 端 ら７ 、 ８ ）_{は P. morganii の 脱 炭 酸 酵 素 形} 成 に 関 す る 因 子 に つ い て 調 べ て い る 。 そ の 中 で 、P. morganii の 脱 炭 酸 酵 素 の 誘 導 は 基 質 濃 度 2×10- 3_{M（ 0.03％ 程 度 ） 以 上 、 pH 5.0 お よ び} ブ ド ウ 糖 濃 度 0.5〜 2.0％ で 最 大 と な っ た 。ま た 、同 酵 素 の 誘 導 は 25℃ で 最 も 高 く 、 37℃ で は 最 大 値 の 1/5 で あ っ た 。 さ ら に 、 酵 素 産 生 は 生 育 定 常 期 に 最 大 と な り 、以 降 は 減 少 し た 。Kimata ら３ ４ ）_{は P. morganii} お よ び そ の 洗 浄 菌 体 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は 酸 素 で 抑 制 さ れ た が 、 酸 素 の 影 響 は 酸 化 的 ア ミ ン 分 解 が 原 因 で は な い こ と 、 ま た E. coli の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は 酸 素 で 影 響 さ れ な い こ と を 示 し た 。Alin１ ８ ）_{は E. coli} お よ び Salmonella typhi は 若 干 異 な る も の の 比 較 的 低 い pH で ヒ ス チ

ジ ン を 脱 炭 酸 す る が 、E. coli お よ び Pseudomonas aeruginosa は 中 性 お よ び ア ル カ リ 性 で ヒ ス タ ミ ン を 分 解 し た と 報 告 し て い る 。

低 温 性 細 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 関 し て は 、奥 積 ら４ ）_{の N 菌 群 細 菌 の} I 型（ 前 述 ）の 液 体 培 養 と 洗 浄 菌 体 を 用 い た 報 告 が あ る 。そ の 中 で 、I 型 菌 の 生 育 至 適 温 度 は 20℃ で あ っ た が 液 体 培 養 で の ヒ ス タ ミ ン 生 成 の 至 適 温 度 は 25℃ 以 上 、生 育 至 適 pH は 6〜 8 で あ っ た が 液 体 培 養 で の

ヒ ス タ ミ ン 生 成 の 至 適 pH は 5〜 6、お よ び 生 育 至 適 NaCl 濃 度 は 1〜 3％ で あ り 液 体 培 養 で の ヒ ス タ ミ ン 生 成 の 至 適 NaCl 濃 度 と 同 様 で あ っ た と し て い る 。 ま た 、 洗 浄 菌 体 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 至 適 温 度 は 35〜 40℃ 、 至 適 pH は 5.4 お よ び NaCl 濃 度 は ヒ ス タ ミ ン 生 成 と 無 関 係 で あ っ た と し て い る 。 捕 獲 後 の 魚 は 通 常 冷 凍 あ る い は 冷 蔵 さ れ る 。 冷 凍 で は 細 菌 の 生 育 は 実 際 上 阻 止 さ れ る 。 一 方 、 冷 蔵 で は 中 温 細 菌 は ほ ぼ 阻 止 で き る が 低 温 細 菌 は 生 育 し 得 る 。P. phosphoreum は 冷 蔵 下 で 生 育 で き る ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 で あ り 、 冷 蔵 魚 に お け る ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 に 主 体 的 な 役 割 を 果 た す 。 食 中 毒 を 引 き 起 こ す レ ベ ル の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 も 知 ら れ て い る 。と こ ろ で 、こ こ 10 年 間 の 日 本 の 厚 生 労 働 省 に よ る 食 中 毒 統 計 で は 、 ヒ ス タ ミ ン 中 毒 と 思 わ れ る も の は 年 間 数 件 か ら 10 件 程 度 で あ り 、低 温 細 菌 に 起 因 す る と 判 定 で き る も の は 見 当 た ら な い 。 し か し 、 ヒ ス タ ミ ン 中 毒 は 症 状 が 多 様 で 他 の 病 気 に 誤 診 さ れ て い る 可 能 性 が 指 摘 さ れ て い る 。ま た 、P. phosphoreum は 熱 に 弱 い が 、ヒ ス タ ミ ン は 加 熱 に 強 く 、 一 旦 生 成 さ れ る と 加 熱 調 理 後 も 残 存 す る 。 さ ら に 、 ヨ ー ロ ッ パ 共 同 体 で は サ バ 科 お よ び ニ シ ン 科 の 魚 類 に つ い て は ヒ ス タ ミ ン 含 量 が 平 均 100 ppm 以 下 と い う 輸 入 制 限 を 設 け て い る が 、こ の 量 は P. phosphoreum が 低 温 貯 蔵 魚 で 十 分 生 成 し 得 る 量 で あ る 。し た が っ て 、P. phosphoreum に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 条 件 の 把 握 は 食 中 毒 の 抑 制 の み な ら ず 水 産 物 の 商 品 価 値 を 維 持 す る た め に も 不 可 欠 で あ る 。 本 研 究 で は 低 温 貯 蔵 魚 で の ヒ ス タ ミ ン 生 成 と ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 と の 関 連 性 、低 温 貯 蔵 魚 か ら 分 離 し た P. phosphoreum の HDC 産 生 能 お よ び HDC 活 性 に 及 ぼ す 環 境 因 子 の 影 響 、 お よ び E ． coli へ 導 入 し た P. phosphoreum の HDC 遺 伝 子 の 発 現 に 関 す る 研 究 を 行 っ た 。 第 ２ 章 で は 氷 蔵 （ 氷 と 魚 体 が 直 接 に 接 触 す る ） お よ び 冷 氷 （ 氷 と 魚 体 が 直 接 に 接 触 し な い ）法 を 用 い て 保 存 し た サ バ に お け る P. phosphoreum の 消 長 と ヒ ス タ ミ ン 生 成 と の 関 連 性 を 調 べ た 。第 3 章 で は P. phosphoreum の 洗 浄 菌 体 と 菌 体 抽 出 液 を 用 い 、 ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 及 ぼ す 物 理 的 お よ び 化 学 的 因 子 の 影 響 を 調 べ た 。第 ４ 章 で は 異 な る 酸 素 分 圧 下 で 培 養 し た P.

phosphoreum の 菌 体 抽 出 液 を ゲ ル ろ 過 し 、 得 ら れ た HDC 画 分 の 活 性 と そ の 安 定 性 を 検 討 し た 。第 5 章 で は 培 養 温 度 、pH、NaCl 濃 度 お よ び 海 水 濃 度 が P. phosphoreum の HDC 産 生 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た 。第 ６ 章 で は P. phosphoreum の HDC 遺 伝 子 を 導 入 し た E. coli を 用 い 、P. phosphoreum の HDC 遺 伝 子 が 産 生 す る HDC の 機 能 を 調 べ た 。 加 え て 、 低 温 性 P. phosphoreum の HDC が M. morganii な ど の 中 温 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 の HDC と 進 化 的 に ど の よ う な 違 い が あ る の か を 分 子 系 統 樹 を 用 い て 調 べ た 。 第 ７ 章 で は こ れ ら を 総 括 し た 。 第 ２ 章 氷 蔵 お よ び 氷 冷 下 の サ バ に お け る ヒ ス タ ミ ン の 生 成

緒 言 低 温 貯 蔵 魚 に お け る ヒ ス タ ミ ン 生 成 に Photobacterium phosphoreum が 関 与 す る こ と は 多 く の 研 究 者 に よ り 認 め ら れ て い る 。飯 田２ ）_{は 海 洋} 性 の い わ ゆ る 低 温 性 発 光 細 菌P. phosphoreumが ヒ ス タ ミ ン を 生 成 す る こ と を 最 初 に 報 告 し て い る 。van Spreekens６ １ ）_{は 少 量 の ヒ ス タ ミ ン 生} 成 発 光 細 菌 で 汚 染 さ せ た 真 空 パ ッ ク の 塩 付 け ニ シ ン の 切 り 身 を 4℃ で ８ 日 目 保 存 し 、 103 _{mg/100 g の ヒ ス タ ミ ン が 蓄 積 さ れ る こ と を 観 察 し} て い る 。 Okuzumi ら４ ７ ）_{は 5℃ お よ び 20℃ に 貯 蔵 し た サ バ か ら 低 温 好} 塩 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 を 分 離 し 、N 菌 群 細 菌 と 称 し た 。こ れ ら 細 菌 は 4 つ の 菌 型 に 区 分 さ れ 、 II 型 は P. phosphoreum で あ ろ う と し 、 他 の 菌 型 の 分 類 学 的 位 置 は 不 明 で あ る と し た 。 ま た 、 同 氏 ら４ ８ ）_{は 2.5℃ に} 貯 蔵 し た サ バ 、 イ ワ シ お よ び サ ン マ の 魚 体 に は 新 鮮 時 に 1〜 102_{/g、 腐} 敗 時 に は 106_{〜 10}8_{/g の N 菌 群 細 菌 が 存 在 す る と し 、食 品 衛 生 上 の 重 要} 性 を 指 摘 し た 。 さ ら に 、 同 菌 は 海 産 魚 の 皮 膚 よ り 腸 管 に 多 い こ と を 明 ら か に し て い る４ ９ ）_{。 こ れ ら N 菌 群 細 菌 は 、 現 在 で は 遺 伝 学 的 分 類 に} よ り P. phosphoreum に 帰 属 さ れ て い る２ ４ ）_{。 ま た 、 Morii ら}４ ５ 、 ４ ５ ） は サ バ と ニ シ ン の 10℃ 貯 蔵 と 氷 蔵 を 行 い 、内 臓 で は 両 貯 蔵 下 で 、表 皮 に つ い て は 10℃ 貯 蔵 下 で 発 光 細 菌 の 生 育 を 認 め た が 氷 蔵 下 で は 検 出 さ れ な い こ と 、ま た こ れ ら の 発 光 細 菌 の 大 半 が P. phosphoreum で 同 菌 は 多 量 の ヒ ス タ ミ ン を 生 成 す る こ と を 報 告 し て い る 。 さ ら に サ バ を 低 温 に 貯 蔵 し た 場 合 、特 に 10℃ 貯 蔵 で は 背 部 外 層 筋 肉 と 内 臓 で の ヒ ス タ ミ ン 量 が 極 め て 多 く 、そ の 生 成 に は P. phosphoreum が 主 要 な 役 割 を 演 じ る と し て い る 。 さ ら に 、 氷 蔵 魚 の 表 皮 で 発 光 細 菌 が 検 出 さ れ な か っ た こ と に つ い て は 、 発 光 細 菌 が 海 洋 細 菌 で あ る こ と に 起 因 す る と し て い る 。 以 上 の よ う に 、 低 温 貯 蔵 し た サ バ 科 魚 類 に お け る ヒ ス タ ミ ン 生 成 に は P. phosphoreum が 主 要 な 働 き を し て い る が 、鮮 魚 の 貯 蔵 方 法 な ど の 違 い が 、出 現 す る P. phosphoreum の 数 お よ び ヒ ス タ ミ ン の 生 成 に 影 響 す る こ と も 示 唆 し て い る 。 こ こ で は 低 温 貯 蔵 魚 に お け る ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 及 ぼ す P. phosphoreum の 役 割 を 確 認 す る と 共 に 、鮮 魚 の 冷 蔵

に 汎 用 さ れ る 氷 蔵 （ 魚 体 を 直 接 氷 中 に 埋 没 ） お よ び 同 温 度 の 氷 冷 （ 魚 体 を ビ ニ ー ル 袋 に 入 れ て 氷 中 に 埋 没 ） 下 の サ バ に お け る P. phosphoreum の 出 現 と ヒ ス タ ミ ン 生 成 と の 関 連 性 を 検 討 し た 。 材 料 と 方 法 氷 蔵 お よ び 氷 冷 下 の サ バ に お け る ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 関 す る 実 験 氷 蔵 （ 魚 体 を 直 接 氷 中 に 埋 没 ） お よ び 氷 冷 （ 魚 体 を ビ ニ ー ル 袋 に 入 れ て 氷 中 に 埋 没 ） し た サ バ Scomber japonicus に つ い て 生 菌 数 、 発 光 細 菌 数 お よ び ヒ ス タ ミ ン 量 を 経 時 的 に 調 べ た 。 実 験 は 11 月 と 12 月 の 2 度 行 っ た 。 試 料 の サ バ は 長 崎 市 内 の 鮮 魚 店 か ら 購 入 し た 。 サ バ は 貯 蔵 前 （ 0 日 目 ） と 貯 蔵 後 （ 4 日 間 隔 で 24 日 目 ま で ） に つ い て 生 菌 数 、 発 光 細 菌 数 お よ び ヒ ス タ ミ ン 量 の 測 定 に 供 し た 。 供 試 魚 は 各 測 定 に つ き 3 尾 を 用 い た 。 生 菌 数 お よ び 発 光 細 菌 数 の 測 定 と 菌 株 の 分 離 供 試 魚 の 表 皮 （ 背 部 ）、 筋 肉 （ 表 皮 よ り 約 5 mm 以 深 の 層 ） お よ び 腹 壁 （ 腹 腔 側 ） に つ い て 生 菌 数 と 発 光 細 菌 数 の 測 定 と 菌 株 の 分 離 を 行 っ た 。表 皮 お よ び 腹 壁 に つ い て は 、滅 菌 し た コ ル ク ボ ー ラ ー（ 直 径 2.5 cm） を そ れ ら の 表 面 に 密 着 さ せ 、 そ の 部 分 を 10 ml の 滅 菌 し た 0.1％ ペ プ ト ン ‐ リ ン 酸 緩 衝 液 （ pH 7.0） で 十 分 に 洗 浄 し て 集 菌 し 、 菌 数 測 定 用 試 料 と し た 。 筋 肉 に つ い て は 約 1 g を 正 確 に 計 り 取 り 、 9 ml の 同 緩 衝 液 を 加 え 、 ポ リ ト ロ ン （ Kinematica GmbH, Steinhofhald 20, 6005 Luzern CH）を 用 い て ホ モ ゲ ナ イ ズ し た 。こ れ ら の 試 料 か ら 同 緩 衝 液 を 用 い て 10 倍 段 階 希 釈 液 を 調 製 し 、 PYBG 寒 天 平 板 培 地 ［ 0.5%ポ リ ペ プ ト ン 、 0.25％ 肉 エ キ ス 、 0.25％ 酵 母 エ キ ス 、 0.1％ グ ル コ ー ス お よ び 1.5％ 寒 天 を 50％ 海 水 に 溶 解（ pH 7.0９ ）］に 0.2 ml ず つ 塗 沫 し 、20℃ で 培 養 し た 。 発 光 細 菌 数 は す べ て の 平 板 に つ い て 発 光 の 様 子 を 見 な が ら 12〜 48 時 間 後 に 計 数 し 、総 生 細 菌 数 は 5 日 間 培 養 後 に 通 常 法 に 従 い 適 度 な コ ロ ニ ー の 生 じ た 平 板 で の 計 数 に よ り 算 出 し た 。 菌 株 の 分 離 は

総 生 菌 数 の 測 定 に 供 し た 平 板 か ら 外 観 の 異 な る 集 落 を 釣 菌 し 、 同 組 成 の 平 板 培 地 を 用 い て 純 粋 分 離 し た 。 発 光 細 菌 に つ い て は 総 生 菌 数 の 測 定 に 供 し た 平 板 以 外 か ら も 集 菌 し た 。 分 離 菌 の 同 定 分 離 菌 は Bergey’s Mannual３ ７ 、 ５ ３ ）_{を 参 考 と し 清 水}１ ０ ）_{の 同 定 方 式} に 従 い 属 段 階 ま で 、 特 に 発 光 細 菌 に つ い て は Morii ら４ ４ 、 ４ ５ ）_{と 同 様} に し て 種 段 階 ま で の 同 定 を 行 っ た 。 ヒ ス タ ミ ン 量 の 測 定 サ バ の 背 部 外 層 筋 肉 （ 表 皮 か ら 1〜 2 mm）、 背 部 内 層 筋 肉 （ 約 5 mm 以 深 ） お よ び 腹 部 筋 肉 （ 腹 壁 か ら 1〜 2 mm） 中 の ヒ ス タ ミ ン 量 、 お よ び 分 離 菌 培 養 液 中 の ヒ ス タ ミ ン 量 を Morii ら の 方 法４ ４ 、 ４ ５ ）_{に 従 っ て} 測 定 し た 。 な お 、 分 離 菌 培 養 液 中 の ヒ ス タ ミ ン 量 に つ い て は 、 発 光 細 菌 の す べ て （Photobacterium leiognathi に つ い て は 総 生 菌 数 測 定 用 平 板 か ら 分 離 し た 6 株 と そ の 他 の 平 板 よ り 分 離 し た 2 株 の 計 8 株 、P. phosphoreumに つ い て は 総 生 菌 数 測 定 用 平 板 か ら 分 離 し た 16 株 と そ の 他 の 平 板 よ り 分 離 し た 12 株 の 計 28 株 ）、 氷 蔵 お よ び 氷 冷 下 で 貯 蔵 12 日 目 以 降 の ヒ ス タ ミ ン の 生 成 を 認 め た 供 試 魚 の 各 部 位 か ら 分 離 し た 非 発 光 細 菌 の す べ て の 菌 株（ 153 株 ）、お よ び 貯 蔵 8 日 目 に 分 離 し た 細 菌 の 半 数（ 計 30 株 ）に つ い て 調 べ た（ 総 計 は 発 光 細 菌 36 株 と そ の 他 183 株 ）。 結 果 氷 蔵 お よ び 氷 冷 下 の サ バ の 各 部 位 に お け る 総 生 菌 数 お よ び 発 光 細 菌 数 の 経 時 変 化 氷 蔵 お よ び 氷 冷 し た サ バ の 表 皮 、 筋 肉 （ 内 層 ） お よ び 腹 壁 に お け る 総 生 菌 数 と 発 光 細 菌 数 の 経 時 変 化 を 11 月 （ 実 験 I） と 12 月 (実 験 II) の 2 度 調 べ た 。 そ の 結 果 を 各 々 Fig. 2-1 と Fig. 2-2 に 示 す 。

Fig. 2-1. Total viable count and luminous bacterial count in the skin, the inner layer of muscle, and the abdominal walls of mackerel during storage in ice (upper) and at the temperature of ice (lower) in Experiment I. Mackerel was stored as touched directly (in ice) and indirectly with ice (at the temperature of ice). The inner layer of muscle is deeper 5 mm from the skin. The counts of bacteria were carried out using PYBG medium [polypeptone, 0.5%; beef extract, 0.25%; yeast extract, 0.25%; glucose, 0.1%; and agar, 1.5% in 50% seawater (pH 7.0)] at 20ÞC. ■＋□, total viable count; ■, luminous bacterial count.

Incubation time (days)

0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 Skin Muscle Abdominal walls Skin Muscle Abdominal walls 実 験 I で は 発 光 細 菌 が 検 出 さ れ た が 、実 験 II で は 検 出 さ れ な か っ た 。 総 生 菌 数 は 発 光 細 菌 出 現 の 有 無 に 関 わ ら ず 、 表 皮 と 筋 肉 で は 氷 蔵 魚 は 氷 冷 魚 よ り 低 く 、腹 壁 で は 高 く な り 、実 験 I と II は 同 様 な パ タ ー ン を 示 し た が 、実 験 I の 貯 蔵 魚 で は 実 験 II の 貯 蔵 魚 に 比 べ て 腹 壁 と 筋 肉 の 菌 数 が 極 め て 高 か っ た 。 実 験 I で は 貯 蔵 前 は 測 定 に 供 し た 全 て の 部 位 で 発 光 細 菌 を 認 め た が 、 貯 蔵 後 は 氷 蔵 と 氷 冷 の 腹 壁 お よ び 氷 冷 の 筋 肉 だ け に 発 光 細 菌 を 認 め た 。

Fig. 2-2. Total viable count in the skin, the inner layer of muscle, and the abdominal walls of mackerel during storage in ice (upper) and at the temperature of ice (lower) in Experiment II. Mackerel was stored as touched directly (in ice) and indirectly with ice (at the temperature of ice). The inner layer of muscle is deeper 5 mm from the skin. The counts of bacteria were carried out using PYBG medium [polypeptone, 0.5%; beef extract, 0.25%; yeast extract, 0.25%; glucose, 0.1%; and agar, 1.5% in 50% sea water (pH 7.0)] at 20ÞC.

Incubation time (days)

0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 0 8 16 24 2 4 6 8 10 Skin Muscle Abdominal walls Skin Muscle Abdominal walls 貯 蔵 魚 の 腹 壁 で は い ず れ の 貯 蔵 魚 で も 12 日 目 以 降 に 発 光 細 菌 が 検 出 さ れ 、20 日 目 で 最 大 と な っ た 。そ の 数 は 氷 蔵 下 で は 9.7×107_{/cm（ 総}2 生 菌 数 の 80.8％ ）、 氷 冷 下 で は 4.9×107_/cm2_{（ 総 生 菌 数 の 81.7％ ） で} あ り 、 供 試 魚 に よ っ て は 全 て が 発 光 細 菌 で 占 め ら れ た 。 ま た 、 氷 冷 魚 の 筋 肉 で は 貯 蔵 16 日 目 と 20 日 目 に 各 々 8.0×106_{/g（ 総 生 菌 数 の 2.1％ ）} お よ び 1.7×107_{/g（ 総 生 菌 数 の 2.8％ ） を 認 め た が 、 両 日 と も 供 試 魚} 3 匹 の う ち の 1 匹 だ け で あ っ た 。 な お 、 購 入 直 後 の サ バ か ら 分 離 し た 発 光 細 菌 は P. leiognathi、 貯 蔵 後 に 増 殖 し た 発 光 細 菌 は P. phosphoreum で あ っ た 。 氷 蔵 お よ び 氷 冷 下 の サ バ 筋 肉 に お け る ヒ ス タ ミ ン 量 の 経 時 変 化 氷 蔵 お よ び 氷 冷 し た サ バ の 背 部 外 層 筋 肉 、 背 部 内 層 筋 肉 お よ び 腹 部

筋 肉 に お け る ヒ ス タ ミ ン 量 の 経 時 変 化 に 関 す る 実 験 I の 結 果 を Table 2-1、 実 験 II の 結 果 を Table 2-2 に 示 す 。 0 5.9 18.4 16.2 5.9 18.4 16.2 4 6.0 15.0 16.3 6.9 15.4 16.4 8 8.1 13.8 17.3 8.4 16.1 19.0 12 7.1 11.9 17.6 15.1 18.2 20.6 16 6.8 11.9 15.8 19.7 21.6 21.0 20 6.5 11.1 16.3 25.7 26.2 43.6 24 8.0 13.4 16.0 39.3 31.1 124.1

Table 2-1. Histamine development in each layer of the muscles of mackerel stored in ice and at the temperature of ice (Experiment I)

In ice At the temperature of ice

Storage time (days) Outer muscle Inner muscle Outer

muscle Ventral_muscle Inner

muscle

Ventral muscle

The outer and inner muscles are layer from 1-2 mm and deeper 5 mm from the skin respectively, and the dorsal muscle is layer from 1-2 mm from the abdominal walls. Histamine was determined using the method of Taylor et al 59） .

Histamine formed (µg/g) 0 6.7 18.0 16.2 6.7 18.0 16.2 4 6.5 16.5 15.8 7.8 17.2 15.7 8 6.2 14.1 14.8 8.8 15.2 15.5 12 5.2 13.3 15.3 8.8 15.2 15.5 16 5.7 13.5 18.6 8.2 15.2 17.1 20 5.8 15.2 21.0 10.6 17.3 21.9 24 8.3 19.0 28.6 12.9 19.2 24.1

Table 2-2. Histamine development in each layer of the muscles of mackerel stored in ice and at the temperature of ice (Experiment II)

In ice At the temperature of ice

Storage time (days) Outer muscle Inner muscle Outer muscle Ventral muscle Inner muscle Ventral muscle

The outer and inner muscles are layer from 1-2 mm and deeper 5 mm from the skin respectively, and the dorsal muscle is layer from 1-2 mm from the abdominal walls. Histamine was determined using the method of Taylor et al 59） .

Histamine formed (µg/g)

実 験 I で は 、氷 蔵 魚 の い ず れ の 部 位 で も 24 日 間 の 貯 蔵 で は ヒ ス タ ミ ン 量 に ほ と ん ど 増 加 は な か っ た 。 一 方 、 氷 冷 魚 で は い ず れ の 部 位 で も

12 日 目 を 境 と し て ヒ ス タ ミ ン 量 は 増 加 し 、 特 に 腹 部 筋 肉 で は 20 日 目 以 降 に 急 増 し た 。 し か し 、 最 大 で も 12 mg/100 g で あ り 、 ヒ ス タ ミ ン 中 毒 の 目 安 と さ れ る 50 mg/100 g２ ２ 、 ３ ８ ） _{に は 達 し な か っ た 。 実 験 II} で は 、 腹 部 筋 肉 で は 氷 蔵 お よ び 氷 冷 と も 、 そ の 量 は 増 加 傾 向 を 示 し た が 、 極 め て 少 な か っ た 。 な お 、 購 入 時 の 魚 の ヒ ス タ ミ ン 量 は 僅 か で あ っ た が 、実 験 I お よ び II の 場 合 と も 、背 部 内 層 筋 肉 、腹 部 筋 肉 お よ び 背 部 外 層 筋 肉 の 順 に ヒ ス タ ミ ン 量 は 減 少 し 、 特 に 背 部 外 層 筋 肉 で は そ の 値 は 著 し く 低 か っ た 。 分 離 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 分 離 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 を Table 2-3 に 示 す 。 　 Luminous bacteria 　 Photobacterium phosphoreum 28 11.3-75.8 　 Photobacterium leiognathi 8 0.0-0.2 　 Other bacteria 183 0.0-0.3

P. leiognathi was isolated from mackerel before storage, and P. phosphoreum and other bacteria were isolated from mackerel which formed histamine in significant amount during storage at the temperature of ice. Histamine formation was tested with Moeller's decarboxylase basal medium cotaining 1% L-histidine at 20ÞC for 24 h.

Table 2-3. Histamine formation by bacterial strains isolated

Bacterial strains Number

of strains Histamine (mg/100ml) 分 離 し たP. phosphoreumの 全 て の 菌 株 に ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 が 見 ら れ 、 培 養 液 100 ml 当 た り 11.3〜 75.8 mg で あ っ た 。 一 方 、 中 温 性 発 光 細 菌 P. leiognathi お よ び そ の 他 の 非 発 光 性 分 離 菌 は ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 が な い か 、 あ っ て も ご く 僅 か だ っ た 。 考 察 1 回 目 の 貯 蔵 実 験 で 、氷 冷 魚 の 筋 肉 で は 12 日 目 を 境 と し ヒ ス タ ミ ン が 生 成 さ れ た が 、氷 蔵 魚 で は 生 成 さ れ な か っ た 。一 方 、P. phosphoreum

が 12 日 目 を 境 と し て 腹 壁 で 優 占 的 に 増 殖 し 、特 に 氷 冷 魚 で は 筋 肉（ 内 層 ） で も 同 菌 を 確 認 し た が 、 氷 蔵 魚 の 筋 肉 で は 確 認 出 来 な か っ た 。 ま た 、 2 回 目 の 貯 蔵 実 験 で は 氷 蔵 お よ び 氷 冷 魚 と も 腹 部 筋 肉 で ヒ ス タ ミ ン が 生 成 さ れ た が そ の 値 は 低 く 、ま た P. phosphoreum は 確 認 出 来 な か っ た 。 と こ ろ で 、 ヒ ス タ ミ ン の 生 成 を 認 め た 供 試 魚 か ら 分 離 し た 菌 株 の う ち 、P. phosphoreum だ け が 多 量 の ヒ ス タ ミ ン を 生 成 し 、 発 光 細 菌 P. leiognathi を 含 む 他 の 菌 株 は ヒ ス タ ミ ン を 生 成 し な い か 、 生 成 し て も そ の 量 は 少 な か っ た 。 以 上 の こ と か ら 、 実 験 I の 氷 冷 下 の サ バ で 多 量 に 認 め た ヒ ス タ ミ ン に つ い て は 、そ の 大 半 が P. phosphoreum に 起 因 し た と い え る 。ま た 実 験 II の 、 特 に 腹 部 筋 肉 で 少 量 な が ら 認 め た ヒ ス タ ミ ン に つ い て は P. phosphoreum 以 外 の 細 菌 に よ り 生 成 さ れ 、 生 菌 数 の 増 加 に 伴 い そ の 量 も 増 加 し た と 考 え ら れ る 。 と こ ろ で 、Okuzumi ら４ ７ 、 ４ ８ 、 ４ ９ 、 ５ ０ 、 ５ １ ）_{は 赤 身 魚 に お け る 発 光 性} と 非 発 光 性 の 低 温 好 塩 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 の 存 在 を 報 告 し て い る 。 と こ ろ が 今 回 、 分 離 菌 の 中 に は ヒ ス タ ミ ン を 多 量 に 生 成 す る 非 発 光 性 細 菌 は 確 認 出 来 な か っ た 。こ れ に つ い て は Okuzumi ら４ ９ ）_{が 開 発 し た} ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 分 離 用 培 地 を 用 い な か っ た こ と が 原 因 と も 考 え ら れ る 。 し か し 、 こ の よ う 選 択 培 地 を 用 い な い た め に 同 菌 の 分 離 頻 度 が 低 く な る こ と は あ っ て も 、 全 く 分 離 さ れ な い こ と は な い と 思 わ れ る 。 実 際 、 同 氏 ら４ ７ 、 ４ ８ ）_{も 同 選 択 培 地 を 用 い な く て も 多 数 の ヒ ス タ ミ ン} 生 成 細 菌 を 分 離 し て お り 、 32 株 中 20 株 が 非 発 光 性 で あ っ た 。 今 回 分 離 し た 非 発 光 細 菌 の 中 に は 多 量 の ヒ ス タ ミ ン を 生 成 す る 菌 株 は 見 ら れ ず 、 優 先 的 に 増 殖 し 多 量 の ヒ ス タ ミ ン を 生 成 す る 細 菌 は い な か っ た よ う で あ る 。 Morii ら４ ４ 、 ４ ５ ）_{は 10℃ に 貯 蔵 し た サ バ の 表 皮 と 内 臓 で 発 光 細 菌 の} 生 育 と ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 を 認 め て い る 。 一 方 、 氷 蔵 で は 内 臓 に 発 光 細 菌 の 生 育 が 見 ら れ た が 、 ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 は な か っ た と し て い る 。 ま た 、 氷 蔵 魚 の 表 皮 で は 発 光 細 菌 の 生 育 も ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 も 認 め て い な い 。 と こ ろ で 、 海 洋 性 の 発 光 細 菌 の 生 育 は 塩 分 濃 度 に 影 響 さ れ る 。

し た が っ て 、淡 水 氷 に よ る 氷 蔵 が P. phosphoreum の 生 育 に 影 響 を 及 ぼ す こ と は 充 分 あ り 得 る 。 し か し 、 今 回 は サ バ を 用 い て 同 様 な 温 度 で の 貯 蔵 実 験 を 行 っ た が 、 氷 蔵 と 氷 冷 の い ず れ の 表 皮 で も P. phosphoreum の 生 育 は 観 察 さ れ な か っ た 。一 方 、腹 部 内 壁 で は 両 貯 蔵 下 の サ バ で P. phosphoreum が 生 育 し た が 、 有 意 な ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 が 氷 冷 下 の サ バ に だ け 認 め ら れ た 。 ま た 、 本 実 験 は 2 度 行 い 1 度 目 の 実 験 の 氷 冷 し た サ バ の 腹 壁 か ら は 全 て の 試 料 で P. phosphoreum が 検 出 さ れ た が 、 2 回 目 の 試 料 で は 全 く 検 出 さ れ な か っ た 。 こ の こ と か ら 、 低 温 貯 蔵 魚 に お け るP. phosphoreumの 生 育 お よ び そ れ に 付 随 す る ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 に 関 し て は 温 度 、 塩 分 に 加 え 、 さ ら な る 要 因 の 関 与 も 考 え ら れ た 。 要 約 低 温 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 、特 に P. phosphoreum の 生 育 と ヒ ス タ ミ ン 生 成 を 調 べ る た め に 、氷 蔵（ 魚 体 を 直 接 氷 中 に 埋 没 ）お よ び 氷 冷（ 魚 体 を ビ ニ ー ル 袋 に 入 れ て 氷 中 に 埋 没 ） し た サ バ に お け る 総 生 細 菌 数 、 発 光 細 菌 数 お よ び ヒ ス タ ミ ン 含 量 を 測 定 し た 。 2 度 の 実 験 を 行 い 、 実 験 I で は 低 温 貯 蔵 に 伴 い P. phosphoreum の 生 育 と ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 を 認 め た が 、 実 験 II で は P. phosphoreum の 生 育 も ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 も 認 め な か っ た 。 発 光 細 菌 が 生 育 し た 実 験 I の サ バ で は 、 氷 蔵 お よ び 氷 冷 の い ず れ も 表 皮 で は P. phosphoreum の 生 育 を 認 め ず 、腹 壁 で は 認 め た 。ま た 、腹 壁 で は 氷 冷 し た サ バ で は ヒ ス タ ミ ン の 有 意 な 蓄 積 を 認 め た が 、 氷 蔵 で は 認 め な か っ た 。さ ら に 、供 試 魚 か ら 分 離 し 、測 定 に 供 し た 菌 株 で P. phosphoreum は 高 い レ ベ ル の ヒ ス タ ミ ン を 生 成 し た が 、P. leiognathi お よ び 非 発 光 細 菌 は ヒ ス タ ミ ン を 生 成 し な い か 、 し て も ご く 僅 か で あ っ た 。 以 上 よ り 、氷 点 付 近 に 貯 蔵 し た サ バ で は P. phosphoreum の 生 育 や ヒ ス タ ミ ン 生 成 が 抑 制 さ れ た が 、P. phosphoreum が 主 体 的 な ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 で あ る こ と に は 変 わ り な か っ た 。 ま た 、 そ の 生 育 や ヒ ス タ ミ ン

生 成 に 温 度 お よ び 塩 分 に 加 え 、 さ ら な る 要 因 の 関 与 が 考 え ら れ た 。

第 3 章 Photobacterium phophoreum の ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 及 ぼ す 要 因 の 影 響

緒 言 第 ２ 章 で は Photobacterium phosphoreum が 氷 温 下 で 生 育 し 、ま た 低 温 貯 蔵 し た 魚 で の ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 主 体 的 な 役 割 を 果 た す こ と を 述 べ た が 、 同 時 に 同 菌 の 出 現 お よ び ヒ ス タ ミ ン の 蓄 積 に は 温 度 と 塩 分 に 加 え 、さ ら な る 生 育 環 境 条 件 が 関 連 す る と し た 。と こ ろ で 、奥 積 ら４ ）_は 低 温 好 塩 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 （ N 菌 群 細 菌 ） の 液 体 培 養 と 洗 浄 菌 体 を 用 い て ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 及 ぼ す 温 度 、 pH お よ び NaCl 濃 度 の 影 響 を 調 べ て い る 。 今 回 、低 温 貯 蔵 下 の サ バ か ら 分 離 し た P. phosphoreum の 洗 浄 菌 体 に 加 え 、 菌 体 抽 出 液 を 用 い 、 同 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 で の 温 度 、 pH、 NaCl 濃 度 お よ び 基 質 濃 度 の 影 響 、お よ び 同 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す 培 養 条 件 、 す な わ ち 培 養 齢 、 グ ル コ ー ス 添 加 お よ び 酸 素 分 圧 の 影 響 を 検 討 し た 。 材 料 と 方 法 供 試 菌 第 2 章 で 示 し た 実 験 で 、 氷 冷 中 の サ バ か ら 分 離 し た P. phosphoreum の う ち 、 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 の 最 も 高 か っ た 1 菌 株 を 用 い た 。 供 試 菌 の 各 環 境 下 で の 生 育 量 の 測 定 ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 及 ぼ す 因 子 の 影 響 を 調 べ る 実 験 に 対 応 し た 培 地 と 条 件 に よ り 、 供 試 菌 を 20℃ （ 培 養 温 度 で の 違 い を 調 べ る 実 験 は 除 く ） で 18 時 間 培 養（ 培 養 時 間 で の 違 い を 調 べ る 実 験 は 除 く ）後 、生 育 量 を 600 nm で の 吸 光 度 測 定 に よ り 調 べ た 。 洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 の 測 定 洗 浄 菌 体 は 供 試 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 で の 温 度 、pH、NaCl 濃 度 お よ び 基 質 濃 度 の 影 響 に 関 す る 実 験 と ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す 培 養 齢

の 影 響 に 関 す る 実 験 で 用 い た 。洗 浄 菌 体 は 、L-ヒ ス チ ジ ン 1.0%と NaCl 2.5%を 添 加 し た Moeller の 培 地４ ２ ）_{を 用 い 、25℃ で 24 時 間 静 置 培 養（ 培} 養 齢 に 関 す る 実 験 は 除 く ） し た 供 試 菌 の 菌 体 を 、 遠 心 分 離 （ 8,000 回 転 で 17 分 ） し て 集 め 、 2％ NaCl 水 溶 液 で 3 回 洗 浄 し て 調 製 し た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 に 関 す る 実 験 で は 、得 ら れ た 菌 体 を 2％ NaCl 水 溶 液 に 懸 濁 し 、 そ の 1 ml を 1 ml の L-ヒ ス チ ジ ン （ 0.1 mg/ml:基 質 濃 度 の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 10 倍 段 階 の 濃 度 で 0.01〜 1000 µg/ml） お よ び 2.0％ NaCl（ NaCl 濃 度 の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 1％ 間 隔 で 1〜 5％ ）添 加 McIlvaine 緩 衝 液 （ 0.1 M で pH は 6.2:pH の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 0.5 間 隔 で pH 5.5〜 7.5）と 混 合 し 、25℃（ 温 度 の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 5℃ 間 隔 で 20〜 50℃ ） の 湯 浴 中 で 反 応 さ せ た 。 1 時 間 経 過 後 、 直 ち に 氷 水 中 で 急 冷 し 、4℃ で 15 分 間 遠 心 分 離（ 24,150×g）し 、得 ら れ た 上 清 の ヒ ス タ ミ ン 量 を Taylor の 方 法５ ９ ）_{で 測 定 し た 。ヒ ス タ ミ ン 生 成} 活 性 は 湿 重 量 1 g の 菌 体 が 1 時 間 に 生 成 す る ヒ ス タ ミ ン 量 で 著 わ し た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す 培 養 齢 の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 、 6 時 間 間 隔 で 48 時 間 ま で 、25℃ 下 で 静 置 し た 液 体 培 養 か ら 洗 浄 菌 体 を 調 製 し 、 そ の 2％ NaCl 懸 濁 液 1 ml を 1 ml の L-ヒ ス チ ジ ン （ 0.1 mg/ml） お よ び 2.0％ NaCl 添 加 McIlvaine 緩 衝 液（ 0.1 M で pH は 6.2）と 混 合 し 、 25℃ の 湯 浴 中 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。 菌 体 抽 出 液 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 の 測 定 菌 体 抽 出 液 は 供 試 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 で の 温 度 、pH お よ び NaCl 濃 度 の 影 響 に 関 す る 実 験 と ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す グ ル コ ー ス 添 加 培 養 お よ び 培 地 の 酸 素 分 圧 の 影 響 に 関 す る 実 験 で 用 い た 。 菌 体 抽 出 液 の 調 製 で は 、 ま ず 0.2％ L-ヒ ス チ ジ ン を 含 む SWYP 培 地 を 用 い （ た だ し 、 培 地 へ の グ ル コ ー ス 添 加 の 影 響 実 験 で は 、 こ れ に 0.1％ グ ル コ ー ス を 添 加 ）、洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 測 定 実 験 の 場 合 と 同 様 に し て 菌 体 を 得 た 。 こ れ を 0.1 M 酢 酸 緩 衝 液 （ pH 6.2） に 懸 濁 し 、 氷 冷 し な が ら 超 音 波 破 砕 （ ト ミ ー 精 工 株 式 会 社 の モ デ ル UR-200P を 用 い , 出 力 5 で 破 砕 ） し た 。 さ ら に 破 砕 し た 細 胞 断 片 を 遠 心 分 離 （ 17,000×g

で 30 分 ） で 除 き 、 そ の 上 清 液 を 菌 体 抽 出 液 と し た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 に 関 す る 実 験 で は 、 0.5 ml の 菌 体 抽 出 液 （ 反 応 直 前 に 蒸 留 水 で 適 度 に 希 釈 し て 使 用：NaCl 濃 度 の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 終 濃 度 が 1％ 間 隔 で 1〜 5％ ） を L-ヒ ス チ ジ ン （ 0.1 mg/ml） を 含 む McIlvaine 緩 衝 液（ 0.1 M で pH は 6.2:pH の 影 響 に 関 す る 実 験 で は １ 間 隔 で pH 4.0〜 8.0） 0.5 ml と 混 合 し 、 25℃ （ 温 度 の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 10℃ 間 隔 で 10〜 50℃ ）で 1 時 間 反 応 さ せ た 。沸 騰 水 中 で 反 応 を 停 止 し 、ヒ ス タ ミ ン 量 を Taylor の 方 法５ ９ ）_{で 測 定 し た 。ヒ ス タ ミ ン 生} 成 活 性 は 湿 重 量 1 g の 菌 体 が 1 時 間 に 生 成 す る ヒ ス タ ミ ン 量 で 著 わ し た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す グ ル コ ー ス 添 加 培 養 の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 、 12 時 間 間 隔 で 48 時 間 ま で 、 25℃ 下 で 静 置 し た 液 体 培 養 か ら 菌 体 抽 出 液 を 調 製 し た 。 ま た 、 培 地 の 酸 素 分 圧 の 影 響 に 関 す る 実 験 で は 20℃ で 24 時 間 培 養 し た が 、好 気 培 養 は 好 気 震 盪 と し 、嫌 気 培 養 は Gas Pak 法（ BBL)を 用 い た 。各 菌 体 抽 出 液 0.5ml を L-ヒ ス チ ジ ン（ 0.1 mg/ml） を 含 む McIlvaine 緩 衝 液 （ 0.1 M で pH は 6.2） 0.5ml と 混 合 し 、 25℃ で 1 時 間 反 応 さ せ た 。 結 果 ヒ ス タ ミ ン の 生 成 反 応 に 及 ぼ す 温 度 の 影 響 供 試 菌P. phosphoreumの 洗 浄 菌 体 お よ び 菌 体 抽 出 液 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 お よ び 同 菌 の 生 育 に 及 ぼ す 温 度 の 影 響 を Fig. 3-1 に 示 す 。 供 試 菌 の 生 育 至 適 温 度 は 25℃ で 、35℃ 以 上 で は 生 育 し な か っ た 。一 方 、 ヒ ス タ ミ ン の 生 成 至 適 温 度 は 洗 浄 菌 体 で 35℃ 、菌 体 抽 出 液 で 40℃ で あ っ た 。ま た 、両 者 と も 僅 か で は あ っ た が 50℃ で も ヒ ス タ ミ ン の 生 成 を 認 め た 。

Fig. 3-1. The effects of the reaction temperature on histamine formation by washed cell suspensions (○ ) and crude extracts (● ) of

Photobacterium phosphoreum isolated from mackerel. The washed cell

suspensions were prepared by washing harvested cells with 2% NaCl solution and suspending the washed cells in the same solution. The crude extracts were prepared by breaking cells suspended in an acetate buffer (pH 6.2) in ice with an ultrasonic machine (20 kHz, 5 min) and

centrifuging (24, 150×g, 15 min, 4ÞC) the broken cell suspensions to remove the debris. The cells were prepared from 24 h cultures at 25 (for the washed cell suspensions) or 20ÞC (for crude extracts). The cultures were grown with Moeller's decarboxylase basal medium containing 1.0%

L-histidine and 2.5% NaCl (for the washed cell suspensions) or SWYP broth45) containing 0.2% L-histidine ( for the crude extracts). The reaction

for histamine formation was performed at 25ÞC using McIlvaine buffer containing 2% NaCl, pH 6.2 (for the washed cell suspensions) or acetate buffer, pH 6.2 (for the crude extracts). The histamine level was

determined using the method of Taylor et al .59) Growth (▲) of the bacterium in each temperature is also presented. The culture was incubated with SWYP broth for 18 h.

0 0.05 0.10 0.15 0.20 Growth (O. D. 6 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 1 2 3 4 5 (mg histamine/g Temperature (ÞC) 0 0.05 0.10 0.15 0.20

Activity of crude (mg histamine/

g ヒ ス タ ミ ン の 生 成 反 応 に 及 ぼ す pH の 影 響 供 試 菌P. phosphoreumの 洗 浄 菌 体 お よ び 菌 体 抽 出 液 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 お よ び 同 菌 の 生 育 に 及 ぼ す pH の 影 響 を Fig. 3-2 に 示 す 。 培 地 の 初 発 pH が 4.5 以 下 で の 生 育 は 極 度 に 抑 制 さ れ 、 pH 5.5〜 8.0 で は 良 好 な 生 育 を 認 め た 。ヒ ス タ ミ ン 生 成 の 反 応 至 適 pH は 洗 浄 菌 体 お よ び 菌 体 抽 出 液 の い ず れ も pH 6.0 付 近 が 最 大 で 、 pH 8.0 で は 生 育 が 良

い に も 関 わ ら ず ヒ ス タ ミ ン の 生 成 を 認 め な か っ た 。

Fig. 3-2. The effects of reaction pH value on histamine fromation by washed cell suspensions (○ ) and crude extracts (● ) of Photobacterium

phosphoreum isolated from mackerel. Growth (▲) of the bacterium in

each pH value is also presented. The culture was incubated with yeast peptone broth45) containing 2.5% NaCl in each pH value at 25ÞC for 18 h.

0 0.05 0.10 0.15 0.20 Growth (O. D. 60 0 4 5 6 7 8 0 0.5 1.0 1.5 (mg histamine/g pH 0 0.02 0.04 0.06 Activity of crude e (mg histamine/g c ヒ ス タ ミ ン の 生 成 反 応 に 及 ぼ す NaCl 濃 度 の 影 響 供 試 菌P. phosphoreumの 洗 浄 菌 体 お よ び 菌 体 抽 出 液 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 お よ び 同 菌 の 生 育 に 及 ぼ す NaCl 濃 度 の 影 響 を Fig. 3-3 に 示 す 。 NaCl 濃 度 2〜 4％ で 生 育 が 良 好 だ っ た 。 1 お よ び 5％ で は 生 育 が 著 し く 抑 制 さ れ 、0％ で は 生 育 し な か っ た 。洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 に 及 ぼ す NaCl 濃 度 の 影 響 は 生 育 の 場 合 と ほ ぼ 同 様 で あ っ た 。 一 方 、 菌 体 抽 出 液 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 は NaCl 無 添 加 で 最 大 と な り 、 NaCl 濃 度 の 増 加 に 伴 い 漸 減 し 、 洗 浄 菌 体 の 場 合 と は 異 な っ た 。

Fig. 3-3. The effects of the reaction NaCl concentration on histamine fromation by washed cell suspensions (○ ) and crude extracts (● ) of

Photobacterium phosphoreum isolated from mackerel. Growth (▲) of

the bacterium in each ÍNaCl concentration is also presented. The culture was incubated with yeast peptone broth45) in each NaCl concentration at 25ÞC for 18 h. 0 0.05 0.10 0.15 0.20 Growth (O. D. 60 0 0 1 2 3 4 5 0 0.5 1.0 1.5 (mg histamine/g NaCl (%) 0 0.02 0.04 0.06

Activity of crude (mg histamine/g

ヒ ス タ ミ ン の 生 成 反 応 に 及 ぼ す 基 質 濃 度 の 影 響 供 試 菌P. phosphoreumの 洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 に 及 ぼ す 基 質 （ L-ヒ ス チ ジ ン ） 濃 度 の 影 響 を Table 3-1 に 示 す 。 0ÞC 25ÞC 　 1000 392 1,574 　 100 37 165 　 10 25 46 　 1 23 32 　 0.1 22 29 　 0.01 21 28 Histidine added (µg/ml) Histamine formed (µg/g cells/h)

Table 3-1. The effects of the reaction histidine concentration on histamine formation by washed cell suspensions of Photobacterium phosphoreum isolated from mackerel in both reaction temperatures

Histamine formation by washed cell suspensions: see Fig. 3-1.

反 応 温 度 が 0 お よ び 25℃ の い ず れ の 場 合 も 、基 質 の ヒ ス チ ジ ン 濃 度 が 1000 お よ び 100 µg/ml で は ヒ ス チ ジ ン 濃 度 と 生 成 さ れ た ヒ ス タ ミ

ン 量 に 相 関 性 が 見 ら れ た 。 ま た 、 洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 量 は 0℃ で も 25℃ の 1/4 程 度 あ っ た 。

ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す 培 養 齢 の 影 響

供 試 菌P. phosphoreumで の 培 養 時 間 の 違 い に 基 づ く 洗 浄 菌 体 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 と 生 育 曲 線 を Fig. 3-4 に 示 す 。

Fig. 3-4. The effects of the culture age on histamine formation by washed cell suspensions (○ ) of Photobacerium phosphoreum isolated from mackerel.

A growth curve (▲ ) of the bacterium is also presented. The culture was incubated with SWYP broth at 25ÞC.

0 3 6 12 18 24 30 36 42 48 0 0.4 0.8 1.2 (g g Incubation time (h) 0 3 6 12 18 24 30 36 42 48 0 0.05 0.10 0.15 0.20 Growth (O. D. 600 n 洗 浄 菌 体 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は 対 数 増 殖 後 期 で 最 大 と な り 、 以 後 は 徐 々 に 低 下 し た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す グ ル コ ー ス の 影 響 供 試 菌P. phosphoreumの グ ル コ ー ス 添 加 お よ び 無 添 加 培 養 で の 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 、同 培 養 液 の pH お よ び 同 培 地 で の 生 育 曲 線 を Fig. 3-5 に 示 す 。

Fig. 3-5. The effects of the presence of glucose in the culture media on histamine formation (●) by crude extracts of Photobacterium phosphoreum isolated from mackerel, variation of pH value (■) in the culture media, and growth curves (▲) of the bacterium. The cultures were incubated with SWYP broth in the absence (A) and the presence (B) of 1% glucose at 25ÞC.

0 12 24 36 48 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0 12 24 36 48 Incubation time (h) 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 pH 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Growth (O. D. 600 (A) (B) 培 養 12 時 間 目 で は グ ル コ ー ス 無 添 加 培 養 よ り 添 加 培 養 で 生 育 が 抑 制 さ れ た 。グ ル コ ー ス 無 添 加 培 養 で は pH が 一 時 的 に pH 5.47 ま で 低 下 し た が 以 降 は 上 昇 し た 。 一 方 、 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は 徐 々 に で は あ る が 上 昇 し 36 時 間 で 最 大 と な っ た 。 グ ル コ ー ス 添 加 培 養 で は 培 養 12 時 間 目 で pH は 5.15 ま で 低 下 し 、 最 終 的 に 4.7 程 度 で 安 定 し た 。 一 方 、 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 力 は 急 上 昇 し 、12 時 間 培 養 で は グ ル コ ー ス 無 添 加 培 養 で の 最 大 値 の 約 2 倍 に 達 し 、 以 降 は 低 下 し た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す 酸 素 分 圧 の 影 響 供 試 菌P. phosphoreumの 好 気 お よ び 嫌 気 培 養 で の 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 と 同 培 養 環 境 下 で の 生 育 曲 線 を Table 3-2 に 示 す 。 生 育 量 で は 好 気 培 養 は 嫌 気 培 養 の 3 倍 で あ っ た が 、 得 ら れ た 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 量 は 嫌 気 培 養 で は 好 気 培 養 で の 約 2 倍 で あ っ た 。

Condition Growth (O.D. 600 nm) Aerobic 0.75 599 Anaerobic 0.25 1,229 Histamine formed (µg/g cells/h) Table 3-2. The effects of the oxygen tension of the culture on histamine formation by crude extracts of Photobacterium phosphoreum isolated from mackerel

Anaerobic culture was incubated with SWYP broth４５） containing 0.2% histidine using BBL anaerobic jar and Gas-pack anaerobic envelops and aerobic culture using a rotary shaker at 20ÞC for 24 h.

Histamine formation by crude extracts: see Fig. 3-1.

考 察 奥 積 ら４ ）_{は 分 離 し た 低 温 好 塩 性 細 菌 （ 現 在 P. phosphoreum に 帰 属} さ れ て い る が オ キ シ ダ ー ゼ 陽 性 ） の 洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 温 度 を 35〜 40℃ と し て い る 。 今 回 分 離 し た P. phosphoreum （ オ キ シ ダ ー ゼ 陰 性 ） の 洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 温 度 も こ れ と ほ ぼ 同 様 の 35℃ で あ っ た 。と こ ろ が 、同 菌 は こ の 温 度 で は 生 育 で き な い 。 一 方 、 同 菌 の 菌 体 抽 出 液 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 温 度 も こ れ ら と ほ ぼ 同 様 の 40℃ で あ っ た 。 以 上 の こ と か ら 、P. phosphoreum の 細 胞 は 生 育 出 来 な い 高 い 温 度 で も 活 発 に ヒ ス タ ミ ン を 生 成 す る 。 ま た 、 供 試 菌 の 洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 温 度 は 中 温 細 菌 Escherichia coli２ ５ ）_{や Proteus morganii}２ ０ ）_{な ど と} 同 様 で あ り 、 生 育 環 境 温 度 と の 関 連 性 は 見 ら れ な か っ た 。 と こ ろ で 、 異 な る 温 度 で 培 養 し 調 製 し た 洗 浄 菌 体 で は 、P. morganii８ 、 ２ ０ ）_{や E.} coli２ ５ ）_{で は 生 育 至 適 温 度 よ り 低 い 25℃ 前 後 で 培 養 し 調 製 し た 洗 浄 菌} 体 で ヒ ス タ ミ ン 生 成 活 性 は 最 大 と な り 、 培 養 温 度 が 高 く な る に つ れ て そ の 活 性 は 低 下 す る と さ れ て い る 。こ れ は 本 酵 素 の 産 生 誘 導 が 25℃ 前 後 で 最 大 と な る こ と を 示 唆 す る 。 供 試 菌 の 洗 浄 菌 体 は 反 応 pH が 5.5〜 6.5 の 酸 性 域 で ヒ ス タ ミ ン 生 成

活 性 が 高 く 、ま た 生 育 が 活 発 で あ っ た pH 7 以 上 で は 急 減 し た 。既 報 の 低 温 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 の 洗 浄 菌 体 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 pH は 5.4４ ）_{、中 温 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 菌 の P. morganii}７ 、２ ０ ）_{や P. vulgaris} ７ ）_{で も pH 6.0〜 6.5 で あ る 。ま た 、い ず れ も ア ル カ リ 側 で そ の 活 性 は} 急 激 に 低 下 し て お り 、 今 回 の 結 果 と 類 似 し た 。 一 方 、 供 試 菌 の 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 の 至 適 pH も 6.0 で あ っ た 。 以 上 の こ と か ら 、 洗 浄 菌 体 の 酸 性 域 で の 高 い ヒ ス タ ミ ン 生 成 活 性 は HDC の 反 応 至 適 pH を 反 映 す る 。と こ ろ で 、P. morganii８ 、 ２ ０ ）_{を 異 な る pH で 培 養 し た} 場 合 、 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は pH 5 前 後 で 最 大 と な り 、 培 養 pH の 上 昇 に 伴 い そ の 活 性 は 低 下 す る が 、 pH 7 あ る い は そ れ 以 上 の ア ル カ リ 性 で も か な り 高 い 活 性 を 示 す 。つ ま り 、HDC を 産 生 誘 導 す る た め の 至 適 pH は HDC の 反 応 至 適 pH と は 異 な る と 判 断 さ れ た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 に 及 ぼ す NaCl 濃 度 の 影 響 に つ い て は 、洗 浄 菌 体 で は 2〜 4％ NaCl で ヒ ス タ ミ ン 生 成 活 性 が 高 く 、1 お よ び 5％ NaCl で は そ の 活 性 は 極 め て 低 か っ た 。 こ れ は 生 育 の 傾 向 と 類 似 し た 。 一 方 、 菌 体 抽 出 液 で は NaCl 無 添 加 で ヒ ス タ ミ ン 生 成 活 性 が 最 大 と な り 、 NaCl 濃 度 の 増 加 に 伴 い そ の 活 性 は 斬 減 し 、 洗 浄 菌 体 の 場 合 と は 異 な っ た 。 こ の 結 果 は 、 供 試 菌 の HDC が 菌 体 中 で は 何 ら か の 保 護 作 用 を 受 け て い る こ と を 意 味 し て お り 、 供 試 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 を 左 右 す る 一 要 因 と し て 興 味 深 い 。と こ ろ で 、奥 積 ら４ ）_{が 低 温 好 塩 性 ヒ ス タ ミ ン 生 成 細} 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 活 性 を 洗 浄 菌 体 で 調 べ た 結 果 で は 、NaCl 濃 度 に よ る 活 性 の 差 異 を 認 め ず 、 今 回 の 結 果 と は 異 な っ た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 に 及 ぼ す L-ヒ ス チ ジ ン 濃 度 の 影 響 に つ い て は 、 そ の 濃 度 が 100 µg/ml 以 上 で は 濃 度 に 比 例 し て ヒ ス タ ミ ン 生 成 量 も 増 え た 。 と こ ろ で 、 こ の ヒ ス タ ミ ン 生 成 活 性 測 定 実 験 に は 洗 浄 菌 体 を 用 い た 。 こ の こ と か ら P. phosphoreum の 細 胞 が 0.01％ 程 度 以 上 の ヒ ス チ ジ ン 濃 度 を 認 識 で き る こ と 、 換 言 す れ ば こ の 濃 度 が HDC の 産 生 誘 導 に 必 要 な 基 質 濃 度 と 考 え ら れ る 。 と こ ろ で 、 Gale２ ５ ）_{は E. coli の ヒ} ス チ ジ ン 脱 炭 酸 能 が 培 地 中 に 添 加 し た ヒ ス チ ジ ン 量 に 応 じ て 高 ま る と し 、 ま た Eitenmiller２ １ ）_{は P. morganii で は 培 地 の ヒ ス チ ジ ン 濃 度}

が 0.07％ で 最 大 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 を 示 し た と し て い る 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す グ ル コ ー ス の 影 響 に つ い て は 、 グ ル コ ー ス 添 加 培 地 で は 無 添 加 培 地 に 比 べ て ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は 極 め て 高 く な り 、ま た pH の 急 激 な 低 下 と 若 干 の 生 育 抑 制 が 見 ら れ た 。こ れ は グ ル コ ー ス 添 加 に よ り 培 地 の pH が 低 下 し 、そ の 結 果 と し て 生 育 の 抑 制 と ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 の 上 昇 が 起 こ っ た と 考 え ら れ る 。 Gale２ ５ ）_{は E. coli で} は グ ル コ ー ス 添 加 培 養 で ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 が 増 す こ と を 述 べ て い る 。 ま た 、 反 応 液 へ の グ ル コ ー ス 添 加 で 同 酵 素 活 性 に は 変 化 が 見 ら れ な か っ た こ と か ら 、 培 地 へ の グ ル コ ー ス 添 加 に 伴 う 同 酵 素 活 性 の 上 昇 に つ い て は 、グ ル コ ー ス そ の も の に 起 因 す る の で は な く 、pH の 低 下 に 起 因 す る と し て い る 。一 方 、河 端 ら８ ）_{は グ ル コ ー ス 添 加 に 伴 う 同 酵 素 の 産} 生 促 進 は pH の 低 下 だ け で は 説 明 さ れ な い と し て い る 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す 培 地 の 溶 存 酸 素 の 影 響 に つ い て は 、 嫌 気 培 養 は 好 気 培 養 に 比 べ て ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は 有 意 に 高 か っ た 。 Kimata ら３ ４ ）_{は P. morganii で は 通 気 培 養 は 嫌 気 培 養 や 好 気 培 養 に 比 べ て ヒ} ス タ ミ ン 生 成 量 は 少 な く 、 そ の 原 因 は HDC が 酸 素 に よ り 分 解 も し く は 不 活 性 化 さ れ る た め と し て い る 。 ま た 、 Ferencik２ ３ ）_{は Hafnia sp.で} は 嫌 気 培 養 は 好 気 培 養 よ り ヒ ス タ ミ ン 生 成 は 緩 や か で あ る と し て い る 。 一 方 、Gale２ ５ ）_{は E.coli に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 量 が 嫌 気 お よ び 好 気 下} で 有 意 な 違 い は な か っ た と し て い る 。何 れ に し て も 、起 源 の 異 な る HDC は 各 々 の 特 徴 を 有 し て お り 、 顕 著 な ヒ ス タ ミ ン 生 成 細 菌 に つ い て は 個 々 に 特 徴 付 け を 行 う 必 要 が あ る と 思 わ れ る 。 要 約 低 温 貯 蔵 下 の サ バ か ら 分 離 し たP. phosphoreumの 洗 浄 菌 体 と 菌 体 抽 出 液 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 反 応 で の 温 度 、pH、NaCl 濃 度 お よ び 基 質 濃 度 の 影 響 、 お よ び 同 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 に 及 ぼ す 培 養 条 件 、 す な わ ち 培 養 齢 、 グ ル コ ー ス 添 加 お よ び 酸 素 分 圧 の 影 響 に つ い て 調 べ た 。 供 試 菌 の 生 育 至 適 温 度 は 25℃ で 、35℃ 以 上 で は 生 育 し な か っ た 。一

方 、ヒ ス タ ミ ン の 生 成 至 適 温 度 は 洗 浄 菌 体 で 35℃ 、菌 体 抽 出 液 で 40℃ で あ っ た 。 培 地 の 初 発 pH が 5.5〜 8.0 で は 良 好 に 生 育 し 、 4.5 以 下 で の 生 育 は 極 度 に 抑 制 さ れ た 。 ヒ ス タ ミ ン 生 成 は 洗 浄 菌 体 お よ び 菌 体 抽 出 液 と も に pH 6.0 付 近 で 最 大 で と な り 、 pH 8.0 で は 生 育 が 良 い に も 関 わ ら ず そ の 生 成 を 認 め な か っ た 。NaCl 濃 度 2〜 4％ で は 生 育 が 良 好 で 、 1 お よ び 5％ で は 著 し く 抑 制 さ れ 、 0％ で は 生 育 し な か っ た 。 洗 浄 菌 体 に よ る ヒ ス タ ミ ン 生 成 に 及 ぼ す NaCl 濃 度 の 影 響 は 生 育 の 場 合 と ほ ぼ 同 様 で あ っ た が 、菌 体 抽 出 液 の 場 合 は NaCl 無 添 加 で ヒ ス タ ミ ン 生 成 活 性 が 最 大 と な り 、NaCl 濃 度 の 増 加 に 伴 い 漸 減 し 、洗 浄 菌 体 の 場 合 と は 異 な っ た 。 供 試 菌 の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 は 対 数 増 殖 後 期 で 最 大 と な り 、 以 後 は 徐 々 に 低 下 し た 。グ ル コ ー ス 添 加 培 養 で 培 地 の pH 低 下 と 若 干 の 生 育 抑 制 を 認 め た が 、 HDC 産 生 能 の 最 大 値 は グ ル コ ー ス 無 添 加 培 養 の 約 2 倍 に 達 し た 。 嫌 気 培 養 で の 供 試 菌 の HDC 産 生 能 は 好 気 培 養 の 約 2 倍 と な っ た 。

第 4 章 Photobacterium phophoreum の 二 つ の ヒ ス チ ジ ン 脱 炭 酸 酵 素 の 生 成 と そ の 活 性 に 及 ぼ す 培 養 酸 素 分 圧 の 影 響 緒 言 第 3 章 で は 、Photobacterium phosphoreum の ヒ ス タ ミ ン 生 成 能 、 す な わ ち ヒ ス チ ジ ン 脱 炭 酸 酵 素（ HDC）の 産 生 能 が 培 地 の 酸 素 分 圧 に 影 響 さ れ る こ と を 述 べ た が 、 HDC に 及 ぼ す 酸 素 の 影 響 に 関 し て は 相 反 す る 結 果 が 報 告 さ れ て い る２ ３ 、 ２ ５ 、３ ４ ）_{。ま た 供 試 菌 の 菌 体 抽 出 液 を 凍 結 保} 存 し た と き 、 保 存 当 初 で は 菌 体 抽 出 液 中 の HDC 活 性 は 低 下 す る が 以 降 は ほ ぼ 一 定 と な っ た こ と か ら 、 安 定 性 の 異 な る 複 数 の HDC の 存 在 を 予 測 さ せ た 。 ま た 、 こ れ ま で に 報 告 さ れ て い る HDC は 例 外 な く オ リ ゴ マ ー 酵 素 で あ り 、Klebsiella planticola の HDC に つ い て は ダ イ マ ー と オ リ ゴ マ ー の 2 つ の 活 性 型 が 報 告 さ れ て い る２ ７ 、５ ３ 、５ ６ 、５ ７ ）_{。そ こ で 、} 本 章 で は P. phosphoreumの HDC の 多 形 性 と 酸 素 の 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 材 料 と 方 法 細 菌 、 培 地 お よ び 生 育 条 件 供 試 菌 と し て は 、氷 冷 し た サ バ か ら 分 離 し た P. phoshoreum NUFM 262 株 を 用 い た 。 供 試 菌 の 培 養 に は 通 常 、 ヒ ス チ ジ ン 添 加 SWYP 液 体 培 地 [0.5% バ ク ト ペ プ ト ン (Difco)、0.3% 酵 母 エ キ ス 粉 末 (Oxoid)お よ び 0.2% L-ヒ ス チ ジ ン (和 光 )を 75%熟 成 ろ 過 海 水 中 に 溶 解 （ pH 6.2） ]を 用 い 、必 要 に 応 じ て L-ヒ ス チ ジ ン 無 添 加 で 使 用 し た 。ま た 特 記 し な い 限 り 、20℃ で 24 時 間 培 養 し た 。好 気 培 養 は 静 置 、撹 拌 お よ び 震 盪 下 で 行 っ た 。 撹 拌 速 度 は 菌 体 が 適 度 に 懸 濁 さ れ る 程 度 と し 、 ま た 震 盪 速 度 は 120 お よ び 133 回 転 ／ 分（ 直 径 6.7 cm）で 行 っ た 。嫌 気 培 養 は ガ ス パ ッ ク （ BBL） を 用 い た 嫌 気 ジ ャ ー 中 に 静 置 し て 行 っ た 。

異 な る 酸 素 分 圧 で 生 育 し た P. phoshoreum の 菌 体 抽 出 液 の HDC 活 性 の 測 定 供 試 菌 の 培 養 は 嫌 気 静 置 、好 気 静 置 お よ び 好 気 震 盪（ 120 回 転 ／ 分 ） 下 で 行 っ た 。 生 育 量 は 培 養 の 濁 度 （ 600 nm の 吸 光 度 ） と 細 胞 湿 重 量 で 測 定 し た 。 HDC 活 性 は 細 胞 の 湿 重 量 （ g） お よ び 培 養 液 量 （ 100 ml） 当 た り の 活 性 で 示 し た 。 菌 体 抽 出 液 の 調 製 供 試 菌 の 培 養 は 500 ml 容 三 角 フ ラ ス コ に 入 れ た 200 ml の ヒ ス チ ジ ン 添 加 SWYP 液 体 培 地 を 用 い 、1 回 分 の 菌 体 抽 出 液 の 調 製 に は 通 常 培 養 液 800 ml を 用 い た 。菌 体 抽 出 液 の 調 製 は 、ま ず 液 体 培 養 し た 菌 体 を 遠 心 分 離 （ 13,000×g で 15 分 ） し 、 少 量 の 0.1 M 酢 酸 緩 衝 液 （ pH 6.2） に 懸 濁 し た 。 次 に 、 懸 濁 菌 体 を 氷 冷 し な が ら 超 音 波 破 砕 （ ト ミ ー 精 工 株 式 会 社 の モ デ ル UR-200P を 用 い , 出 力 5 で 破 砕 ） し た 。 破 砕 し た 細 胞 断 片 を 遠 心 分 離（ 17,000×g で 30 分 ）で 除 き 、そ の 上 清 液 を 菌 体 抽 出 液 と し た 。 HDC 活 性 の 測 定 法 酵 素 液 0.3 ml、 0.1 M 酢 酸 緩 衝 液 （ pH 6.2） 0.5 ml お よ び 50 mM ジ チ オ ト レ イ ト ー ル （ DTT） あ る い は 蒸 留 水 0.1 ml の 混 合 液 に 、 0.1 ml の L-ヒ ス チ ジ ン 溶 液 （ 10 mg/ml） を 添 加 し 、 直 ち に 混 合 し た 後 、 25℃ で 反 応 さ せ た 。 反 応 は 沸 騰 水 中 に 5 分 間 漬 け て 停 止 し た 。 対 照 試 験 は L- ヒ ス チ ジ ン 添 加 前 に 酵 素 を 加 熱 失 活 さ せ た 。 生 じ た ヒ ス タ ミ ン は Taylor の 方 法５ ９ ）_{で 測 定 し た 。 酵 素 1 単 位 は 25℃ で 1 時 間 に 1 µmole} の ヒ ス タ ミ ン を 生 成 す る 酵 素 量 と し た 。 タ ン パ ク 質 量 の 測 定 タ ン パ ク 質 量 は Lowry 法３ ９ ）_{で 測 定 し た 。 ゲ ル ろ 過 カ ラ ム か ら の 溶} 出 液 の タ ン パ ク 質 量 に つ い て は 280 nm の 吸 光 度 を 調 べ た 。

ゲ ル ろ 過 に よ る HDC の 分 画 と 分 子 量 の 推 定 菌 体 抽 出 液 の 7 ml を 0.02 M 酢 酸 緩 衝 液 （ pH 6.2） で 平 衡 化 し た Sepharose CL-6B カ ラ ム に 充 填 し （ 直 径 2.6、 高 さ 96 cm）、 同 緩 衝 液 で 展 開 し た 。 特 記 し な い 限 り 、 緩 衝 液 に は 5 mM DTT を 混 合 し た 。 流 速 31.6 ml／ 時 間 で 展 開 し 、 溶 出 液 の 7.8 ml を 分 画 し た 。 HDC の 分 子 量 は チ ロ グ ロ ブ リ ン（ MW：669,000）、フ ェ リ チ ン（ MW： 440,000）、カ タ ラ ー ゼ （ MW： 232,000）、 牛 血 清 ア ル ブ ミ ン （ MW： 67,000）、 キ モ ト リ プ シ ノ ゲ ン A（ MW：25,000）お よ び N-2,4-ジ ニ ト ロ フ ェ ニ ル -L-ア ラ ニ ン （ MW： 255.2） と の 相 対 溶 出 容 量 か ら 推 定 し た 。 酵 素 の 安 定 性 試 験 冷 蔵 、透 析 、ゲ ル ろ 過 お よ び -20℃ 保 存 に お け る 菌 体 抽 出 液 の 安 定 性 、 並 び に 好 気 震 盪 （ 120 回 転 ／ 分 ） お よ び 嫌 気 静 置 培 養 菌 体 抽 出 液 を ゲ ル ろ 過 し て 得 ら れ た 分 画 酵 素 の 安 定 性 に 及 ぼ す DTT の 影 響 を 調 べ た 。 つ ま り 7 日 間 の 冷 蔵 お よ び 冷 凍 、 0.02 M 酢 酸 緩 衝 液 （ pH 6.2） で の 18 時 間 の 透 析 、 お よ び Sepharose CL-6B ゲ ル ろ 過 前 後 に お け る 、 好 気 静 置 培 養 菌 体 抽 出 液 の HDC の 安 定 性 を DTT の 有 無 で 調 べ た 。 加 え て 7 日 間 の 冷 蔵 、 0.02 M 酢 酸 緩 衝 液 （ pH 6.2） で の 18 時 間 の 透 析 、 お よ び Sepharose CL-6B ゲ ル ろ 過 前 後 に お け る 、好 気 震 盪（ 120 回 転 ／ 分 ）お よ び 嫌 気 静 置 培 養 菌 体 抽 出 液 を ゲ ル ろ 過 し て 得 た 分 画 HDC の 安 定 性 を DTT の 有 無 で 調 べ た 。 こ の 安 定 性 試 験 に お け る 操 作 は 特 記 し な い 限 り 4℃ で 行 っ た 。 結 果 各 酸 素 分 圧 下 で の P. phophoreum の 生 育 と ヒ ス タ ミ ン 生 成 異 な る 酸 素 分 圧 下 で 培 養 し た P. phosphoreumの 生 育 曲 線 を Fig. 4-1 に 示 す 。 吸 光 度 お よ び 細 胞 湿 重 量 の い ず れ を 用 い た 測 定 で も 、 生 育 は 好 気 振 盪 培 養 で 極 め て 良 好 で 、 続 い て 好 気 静 置 培 養 お よ び 嫌 気 静 置 培 養 の 順 に 悪 く な っ た が 、 後 2 者 は 好 気 振 盪 培 養 よ り 著 し く 劣 っ た 。