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L. monocytogenes
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39
40
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41
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2 . L . m o n o c y t o g e n e s ࡢ ᳨ ฟ ࠾ ࡼ ࡧ ⾑ Ύ ᆺ ู ᳨ ฟ ᪉ ἲ
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2 ) L . m o n o c y t o g e n e s ⾑ Ύ ᆺ ู
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3 . V T E C ࡢ ᳨ ฟ ࠾ ࡼ ࡧ ཎ ᅉ Ꮚ ಖ ᭷ ≧ ἣ
1 ) V T E C ࡢ ศ 㞳
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43
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44
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2 ) ⾑ Ύ ᆺ ู ヨ 㦂
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45
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P C R ᛂ ᾮ ⤌ ᡂ 㸦2 5 μl ࢫ ࢣ ࣮ ࣝ 㸪1 ࢧ ࣥ ࣉ ࣝ ศ 㸧
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46
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4 . C . j e j u n i ࠾ ࡼ ࡧ C . c o l i ࡢ ᳨ ฟ
1 ) C . j e j u n i ࠾ ࡼ ࡧ C . c o l i ࡢ ศ 㞳
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47
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2 ) C . j e j u n i ࠾ ࡼ ࡧ C . c o l i ࡢ ྠ ᐃ
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P C R ᛂ ᾮ ⤌ ᡂ 㸦2 5 μl ࢫ ࢣ ࣮ ࣝ 㸪1 ࢧ ࣥ ࣉ ࣝ ศ 㸧
ձ 1 0E x Ta q B u ff e r 2 . 5 μl
48
ղ d N T P M i x t u r e㸦 ࡑ ࢀ ࡒ ࢀ 2 . 5 m M㸧 2 μl ճ C . j e j u n i F o r w a r d p r i m e r㸦2 0 μM㸧 0 . 2 5 μl մ C . j e j u n i R e v e r s e p r i m e r㸦2 0 μM㸧 0 . 2 5 μl յ C . c o l i F o r w a r d p r i m e r㸦2 0 μM㸧 0 . 2 5 μl ն C . c o l i R e v e r s e p r i m e r㸦2 0 μM㸧 0 . 2 5 μl շ E x Ta q H o t S t a r t Ve r s i o n㸦5 u n i t /μl㸧 0 . 1 2 5 μl ն Te m p l a t e g e n o m i c D N A㸦< 1 μg㸧 2 . 5 μl
շ ⁛ ⳦ M i l l i Q Ỉ 1 6 . 8 7 5 μl
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ձ 9 5Υ 4 . 5 ศ
ղ 9 5Υ 3 0 ⛊
ճ 5 7Υ 3 0 ⛊ 3 0 ࢧ ࢡ ࣝ
մ 7 2Υ 3 0 ⛊
յ 7 2Υ 2 . 5 ศ
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5 . ࢧ ࣝ ࣔ ࢿ ࣛ ࡢ ᳨ ฟ ࠾ ࡼ ࡧ ⾑ Ύ ᆺ ู ヨ 㦂
1 ) ࢧ ࣝ ࣔ ࢿ ࣛ ࡢ ศ 㞳
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49
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6 . ⣅ ౽ ⣔ ⭠ ⳦ ⩌ ࡢ ᳨ ฟ
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50 1 . L . m o n o c y t o g e n e s ᳨ ฟ ≧ ἣ
L . m o n o c y t o g e n e s ࡣ ∵ ෆ ⮚ ⫗ ➼ 1 0 4 ᳨ య ୰ 2 2 ᳨ య 㸦2 1 . 2 %㸧 ࡀ 㝧
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2 2 ᳨ య ࡽ ᳨ ฟ ࡉ ࢀ ࡓ 2 3 ᰴ ࡢ ⾑ Ύ ᆺ ࡣ 1 / 2 a ࡀ 9 ᰴ㸦3 9 . 1 %㸧㸪1 / 2 c ࡀ 1 4 ᰴ 㸦6 0 . 9 %㸧 ࡛ ࠶ ࡗ ࡓ ࠋ
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51
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⾲11. ∵ෆ⮚⫗ࡢListeria monocytogenes㸪Verotoxin-producingE. coli㸪Campylobacter jejuni/coli㸪ࢧࣝࣔࢿࣛ࠾ࡼࡧ⣅౽⣔⭠⳦᳨ฟ≧ἣ ∵ෆ⮚⫗᳨యᩘ㝧ᛶ᳨యᩘ᳨యᩘ࠾ࡅࡿྜ㸪 L. monocytogenesVTECC. jejuni/coli ࢧࣝࣔࢿࣛ⣅౽⣔⭠⳦⩌ ࣞࣂ࣮㸦⫢⮚㸧382 (5.3)4 (10.5)8 (21.1)0 (0)25(65.8) ࣁࢶ㸦ᚰ⮚㸧187 (38.9)5 (27.8)5 (27.8)0 (0)14(77.8) ࣁ࣑ࣛ㸦ᶓ㝸⭷㸧2 1 (50.0) 0 (0)2 (100)0 (0)2 (100) ࢸ࣮ࣝ㸦ᑿ㸧9 4 (44.4)0 (0)8 (88.9)1 (11.1)9 (100) ࢱࣥ㸦⯉㸧5 1 (20.0) 0 (0)2 (40.0) 0 (0)5 (100) ࣁࢳࣀࢫ㸦➨⫶㸧5 0 (0)0 (0)0 (0)0 (0)3 (60.0) ࢭ࣐ࣥ㸦➨୕⫶㸧9 4 (44.4)5 (55.6)7 (77.8)0 (0)9 (100) ࢠࣛ㸦➨ᅄ⫶㸧9 3 (33.3)7 (77.8)9 (100)0 (0)9 (100) ࣔ࢘ࢳࣙ࢘㸦┣⭠㸧9 0 (0)4 (44.4)9 (100)3 (33.3)9 (100) ィ10422(21.2)25(24.0) 50(48.1)4 (3.8)85(81.7)
57
⾲12. ∵ෆ⮚⫗ࡽ᳨ฟࡉࢀࡓVerotoxin-producing E. coliࡢ⾑Ύᆺ ∵ෆ⮚⫗᳨యᩘ㝧ᛶ᳨యᩘ᳨యᩘ࠾ࡅࡿྜ㸪 VTEC O157VTEC O26 䛭䛾a) 㻌 ࣞࣂ࣮㸦⫢⮚㸧382 (5.3)1 (2.6)1 (2.6) ࣁࢶ㸦ᚰ⮚㸧183 (16.7)0 (0)2 (11.1) ࣁ࣑ࣛ㸦ᶓ㝸⭷㸧2 0 (0)0 (0)0 (0) ࢸ࣮ࣝ㸦ᑿ㸧9 0 (0)0 (0)0 (0) ࢱࣥ㸦⯉㸧5 0 (0)0 (0)0 (0) ࣁࢳࣀࢫ㸦➨⫶㸧5 0 (0)0 (0)0 (0) ࢭ࣐ࣥ㸦➨୕⫶㸧9 4 (44.4)0 (0)1 (11.1) ࢠࣛ㸦➨ᅄ⫶㸧9 7 (77.8)0 (0)0 (0) ࣔ࢘ࢳࣙ࢘㸦┣⭠㸧9 1 (11.1)0 (0)3 (33.3) ィ10417(16.3)1 (1)7 (6.7) a) O1, O28, O91, O103, O153, OUT (O untypable㸪ᆺู⬟)
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⾲13. ∵ෆ⮚⫗䛛䜙᳨ฟ䛥䜜䛯Verotoxin-producing E. coli䛾⾑Ύᆺ䠈ẘ⣲ᆺ䛚䜘䜃᥋╔ᅉᏊ㛵㐃㑇ఏᏊಖ᭷≧ἣ ⾑Ύᆺ㻌㻌㻌ẘ⣲ᆺ㻌᥋╔ᅉᏊ㑇ఏᏊ㻌 ⳦ᰴᩘ㻌ᑠィ eae saaaggR O157O157:H7 VT2 +- - 9 VT1+VT2 +- - 8a) O157:NMVT1+VT2 +- - 1 18 O26O26:H11 VT1 +- - 1 1 ࡑࡢO103:H2 VT1 +- - 1 O28ac:H25 VT2 -+ - 1 O153:H25VT1+VT2 -+ - 1 OUT:H21VT2 -+ - 3 O1:H45VT2 -- - 1 O91:H14 VT1 -- - 1 OUT:H8 VT2 -- - 1 OUT:H18VT1 -- - 1 OUT:H21VT2 -- - 1 OUT:H45VT2 -- - 1 12 ィ㻌㻌㻌㻌㻌㻌㻌3131 a) VT1+VT2c 䜢㻝ᰴྵ䜐
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⾲14. ∵ෆ⮚⫗䛛䜙䛾Campylobacter jejuni/coli᳨ฟ≧ἣ ∵ෆ⮚⫗᳨యᩘ㝧ᛶ᳨యᩘ㸦᳨యᩘ࠾ࡅࡿྜ㸪%㸧 C. jejuniC. coli ࣞࣂ࣮㸦⫢⮚㸧385 (13.2)3 (7.9) ࣁࢶ㸦ᚰ⮚㸧182 (11.1)3 (16.7) ࣁ࣑ࣛ㸦ᶓ㝸⭷㸧2 2 (100)2 (100) ࢸ࣮ࣝ㸦ᑿ㸧9 7 (77.8)3 (33.3) ࢱࣥ㸦⯉㸧5 2 (40.0) 0 (0) ࣁࢳࣀࢫ㸦➨⫶㸧5 0 (0)0 (0) ࢭ࣐ࣥ㸦➨୕⫶㸧9 6 (66.7)1 (11.1) ࢠࣛ㸦➨ᅄ⫶㸧9 9 (100)1 (11.1) ࣔ࢘ࢳࣙ࢘㸦┣⭠㸧9 9 (100)3 (33.3) ィ10442(40.4)16(15.4)
60
⾲15.∵ෆ⮚⫗䛾Listeria monocytogenes䠈Verotoxin-producingE. coli䠈Campylobacter jejuni/coli䠈䝃䝹䝰䝛䝷᳨య᳨ูฟ≧ἣ㻌 㻌㻌㣗୰ẘ⳦᳨ฟ᳨యᩘ ∵ෆ⮚⫗᳨యᩘL. monocytogenes L. monocytogenes L. monocytogenes VTEC VTEC VTEC C. jejuni/coli C. jejuni/coli VTEC C. jejuni/coli C. jejuni/coli C. jejuni/coli ࢧࣝࣔࢿࣛ- 㻌㻌C. jejuni/coli 㻌㻌ࢧࣝࣔࢿࣛ㻌㻌㻌㻌㻌 ࣞࣂ࣮㸦⫢⮚㸧382 4 8 24 ࣁࢶ㸦ᚰ⮚㸧183 4 1 4 1 5 ࣁ࣑ࣛ㸦ᶓ㝸⭷㸧2 1 1 ࢸ࣮ࣝ㸦ᑿ㸧9 4 1 3 2 ࢱࣥ㸦⯉㸧5 1 1 3 ࣁࢳࣀࢫ㸦➨⫶㸧5 5 ࢭ࣐ࣥ㸦➨୕⫶㸧9 2 1 1 3 1 1 ࢠࣛ㸦➨ᅄ⫶㸧9 3 4 2 ࣔ࢘ࢳࣙ࢘㸦┣⭠㸧9 1 3 2 3 ィ104 5 107 1 118 3 2040
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75
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76
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౪ ヨ L . m o n o c y t o g e n e s ᰴ ࡣ ࢻ ࣝ ࢭ ࢵ ࢺ ࡢ ༸ ᇵ ᆅ 㸦 ᪥ Ỉ 〇 ⸆ 㸧 ࡼ
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2 . L . m o n o c y t o g e n e s ⾑ Ύ ᆺ ู ἲ
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3 . L . m o n o c y t o g e n e s P C R s e r o g r o u p i n g ࡢ ࡓ ࡵ ࡢ M u l t i p l e x P C R ἲ
౪ ヨ L . m o n o c y t o g e n e s 1 8 7 ᰴ ࡢ P C R s e r o g r o u p i n g ࡣ 㸪D o u m i t h ࡽ 㸦7㸧㸪K é r o u a n t o n ࡽ 㸦2 6㸧㸪L e c l e r c q ࡽ 㸦4 2㸧 ࡼ ࡾ ሗ ࿌ ࡉ ࢀ ࡓ ᪉ ἲ
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1 ) P C R ⏝ Te m p l a t e D N A ࡢ ㄪ ᩚ
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⏝ Te m p l a t e g e n o m i c D N A ࡋ ࡓ ࠋ
2 ) M u l t i p l e x P C R p r o f i l i n g
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ջ p r s F o r w a r d p r i m e r㸦5 0 μM㸧 0 . 1 μl
ռ p r s R e v e r s e p r i m e r㸦5 0 μM㸧 0 . 1 μl
ս p r f A F o r w a r d p r i m e r㸦5 0 μM㸧 0 . 1 μl
վ p r f A R e v e r s e p r i m e r㸦5 0 μM㸧 0 . 1 μl
տ E x Ta q H o t S t a r t Ve r s i o n㸦5 u n i t /μl㸧 0 . 1 2 5 μl ր Te m p l a t e g e n o m i c D N A㸦< 1 μg㸧 2 μl
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ղ 6 0Υ 3 0 ⛊
80
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մ 9 4Υ 3 0 ⛊
յ 6 0Υ 3 0 ⛊ 3 4 ࢧ ࢡ ࣝ
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շ 7 2Υ 7 ศ
3 ) f l a A ࢆ ᑐ ㇟ ࡋ ࡓ ㏣ ຍ ࡢ P C R
f l a A ࠾ ࡼ ࡧ p r s ࢆ ቑ ᖜ ࡍ ࡿ ࣉ ࣛ ࣐ ࣮ ࡣ ࡑ ࢀ ࡒ ࢀ B o r u c k i ࡽ 㸦2㸧
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P C R ᛂ ᾮ ⤌ ᡂ 㸦2 5 μl ࢫ ࢣ ࣮ ࣝ 㸪1 ࢧ ࣥ ࣉ ࣝ ศ 㸧
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ղ d N T P M i x t u r e㸦 ࡑ ࢀ ࡒ ࢀ 2 . 5 m M㸧 2 μl
ճ f l a A F o r w a r d p r i m e r㸦1 0 0 μM㸧 0 . 3 μl
մ f l a A R e v e r s e p r i m e r㸦1 0 0 μM㸧 0 . 3 μl
յ p r s F o r w a r d p r i m e r㸦2 0 μM㸧 0 . 0 5 μl
ն p r s R e v e r s e p r i m e r㸦2 0 μM㸧 0 . 0 5 μl
շ E x Ta q H o t S t a r t Ve r s i o n㸦5 u n i t /μl㸧 0 . 1 2 5 μl ո Te m p l a t e g e n o m i c D N A㸦< 1 μg㸧 2 μl
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81
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4 . o r f 2 11 0 ࢆ ᳨ ฟ ࡍ ࡿ P C R
82
o r f 2 11 0 ࢆ ᳨ ฟ ࡍ ࡿ ༢ ⊂ P C R ࡣ ➨ ୕ ❶ ᮦ ᩱ ᪉ ἲ 3 . 2㸧 ࡢ ᪉ ἲ
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o r f 2 11 0 ࠾ ࡼ ࡧ l m o 0 7 3 7P C R ቑ ᖜ ⏘ ≀ ࡣ 㸪 ➨ ୕ ❶ ᮦ ᩱ ᪉ ἲ 4 .
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P C R ᛂ ᾮ ⤌ ᡂ 㸦2 5 μl ࢫ ࢣ ࣮ ࣝ 㸪1 ࢧ ࣥ ࣉ ࣝ ศ 㸧
ձ 1 0 × B u ff e r f o r K O D - P l u s - 2 . 5 μl
ղ d N T P M i x t u r e㸦 ࡑ ࢀ ࡒ ࢀ 2 m M㸧 2 . 5 μl
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մ F o r w a r d p r i m e r㸦2 0 μM㸧 0 . 6 2 5 μl յ R e v e r s e p r i m e r㸦2 0 μM㸧 0 . 6 2 5 μl
ն K O D - P l u s -㸦1 u n i t /μl㸧 0 . 5 μl
շ Te m p l a t e g e n o m i c D N A㸦< 1 μg㸧 2 . 5 μl
83
ո ⁛ ⳦ M i l l i Q Ỉ 1 4 . 7 5 μl
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1 , 0 0 0g ࡛ 1 5 ศ 㛫 㐲 ᚰ ศ 㞳 ࡋ ࡓ ࠋ࢝ ࣛ ࣒ ࢆ ୖ ୗ ㏫ ࡋ ࡚ ࣐ ࢡ ࣟ ࢳ
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ձ 5 × S e q u e n c i n g B u f f e r 2 μl
ղ Te m p l a t e D N A㸦1 0 0 - 2 0 0 n g㸧 1 μl
ճ F o r w a r d ࡶ ࡋ ࡃ ࡣ R e v e r s e p r i m e r㸦3 . 2 μM㸧 1 μl մ Te r m i n a t o r R e a d y R e a c t i o n M i x 4 μl
մ ⁛ ⳦ M i l l i Q Ỉ 1 2 μl
ᛂ ᮲ ௳
ձ 9 6Υ 1 ศ
ղ 9 6Υ 1 0 ⛊
84
ճ 5 0Υ 5 ⛊ 2 5 ࢧ ࢡ ࣝ
մ 6 2Υ 4 ศ
ᛂ ᾮ ࢆ E t h a n o l / E D TA ỿ Ẋ ἲ ࡼ ࡾ ⢭ 〇 ࢆ ⾜ ࡗ ࡓ ࠋࡍ ࡞ ࢃ ࡕ 㸪2 0 μl ࡢ ࢧ ࢡ ࣝ ࢩ ࣮ ࢡ ࢚ ࣥ ࢫ ᛂ ᾮ 5 μl ࡢ 1 2 5 m M E D TA ࢆ ຍ ࠼ 㸪
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ճ Ὃ ື ⏝ ࣂ ࢵ ࣇ ࣮ 㸹1 0C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e s i s R u n n i n g B u ff e r㸦S i g m a - A l d r i c h㸧
մ D ye S e t㸹Z
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85
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6 . P u l s e d - F i e l d G e l E l e c t r o p h o r e s i s ゎ ᯒ
⾑ Ύ ᆺ 4 d㸪7 ᰴ 㸪P C R s e r o g r o u p I V b - v 1㸪8 ᰴ ࠾ ࡼ ࡧ P C R s e r o g r o u p I V b㸪4 ᰴ ࡘ ࠸ ࡚ P F G E ゎ ᯒ ࢆ ⾜ ࡗ ࡓ 㸦 ⾲ 2 6㸧ࠋP F G E ゎ ᯒ ࡣ 㸪C D C ࡢ ࣃ ࣝ ࢫ ࢿ ࢵ ࢺ ࡢ ᶆ ‽ ࣉ ࣟ ࢺ ࢥ ࣮ ࣝ 㸦1 6㸪1 7㸧 ࢆ ୍ 㒊 ᨵ ኚ ࡋ ࡚ ᐇ ࡋ ࡓ ࠋ
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౪ ヨ ⳦ ᰴ ࢆ B H I ᾮ య ᇵ ᆅ 㸦B e c t o n D i c k i n s o n㸧 ࡛ 3 0Υ 㸪1 4㹼1 6 㛫 ᇵ 㣴 ࡋ ࡓ ࠋ ᇵ 㣴 ᾮ 1 2 0 μl ࢆ ࣐ ࢡ ࣟ ࢳ ࣗ ࣮ ࣈ ࡾ 㸪1 3 , 0 0 0g㸪 1 0 ศ 㛫 㐲 ᚰ ศ 㞳 ࡋ 㸪 ỿ ´ ࢆ 1 5 0 μl ࡢ T E ࣂ ࢵ ࣇ ࣮ ᾋ 㐟 ࡉ ࡏ ࡓ ࠋ 7 . 5 μl ࡢ Lys o z ym e s o l u t i o n㸦2 0 m g / m l i n T E ࣂ ࢵ ࣇ ࣮ 㸧 ࢆ ຍ ࠼ 㸪 ✜
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ྵ ᭷ T E ⁐ ゎ ࡋ ࡓ 1 % S e a K e m G o l d a g a r o s e ࢆ 1 5 0 μl ຍ ࠼ ࡚ 2㹼3 ᅇ ࣆ ࣌ ࢵ ࢸ ࣥ ࢢ ࡋ 㸪 ┤ ࡕ 0 . 7 - m m s a m p l e p l u g c a s t e r㸦B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , H e r c u l e s , C A , U S A㸧 ෆ ࡛ ᅛ ࡉ ࡏ ࡿ ࡇ ࡼ ࡗ ࡚ ྛ ⳦
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