第 2 章 GONAD 法による KO マウスの作製
2. in situ エレクトロポレーションによる eGFP KO 妊娠後期胎仔の作出
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Fig. 17. CRISPR/Cas9-mediated genome editing using the GONAD system (day 19.5 fetuses).
The fetuses were isolated from one mouse at day 19.5 and analyzed for eGFP fluorescence using a fluorescence stereomicroscope. The fetuses 7 and 9 that lost eGFP expression completely (white arrows), the fetus 3 exhibited reduced eGFP expression and other fetuses had no obvious loss of eGFP expression.
52 Fig. 18. Analysis of CRISPR/Cas9-induced mutations.
(A) Agarose gel electrophoresis of T7E1-treated PCR products derived from fetuses shown in Fig.
17. The red arrows indicate the cleavage products generated in T7E1 assay and the wild-type sized band is indicated by a black arrow. D.W.: distilled water used as a negative control. M: 100-bp DNA ladder marker. (B) Agarose gel electrophoresis of PCR product amplified with primer set (M026:
GGTGGTGCAGATGAACTTCAG and #125: CGGGATCCATTGCCTTTTATGGTAATCG) using genomic DNAs isolated from fetus 9 and eGFP transgenic mouse as template.
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Fig. 19. Direct sequencing of PCR products amplified from the eGFP target region of fetuses.
The black arrows below the electropherogram show overlapping peaks indicative of indel mutations.
54 第4節 考察
GONAD法を実施後、妊娠中期（Day 13.5）、妊娠末期（Day 19.5）の胎仔を調査した結果、
双方のステージにおいて外貌的に正常な胎仔を得ることができ、うちいくつかの個体では、
eGFP遺伝子のKOが認められた（Fig. 14, 17）。自然分娩の直前のステージで標的遺伝子の
KO個体が得られたことから、GONAD法によって実際にゲノム編集マウスが作製できるだ ろうと考えられた。一方、Day 13.5、19.5のいずれの胚でも複数の変異アレルがモザイクの
形で検出された。本研究において、CRISPRにより生じた変異のスクリーニングにもちいた
T7E1 assayは、二本鎖DNAのミスマッチを認識して切断することから、前述の複数の変異
アレルが体細胞に分布するモザイク変異を検出するには有効な解析法である。しかし、Fig.
14の胎仔1と胎仔4は、eGFP蛍光の完全な欠失を示し、さらに塩基配列決定から変異の存 在が明らかとなったにも関わらず、T7E1 assayによる解析結果は陰性であり、変異を検出で
きなかった。標的配列決定によりこの2つのサンプルが、それぞれ4塩基または3 塩基欠
失を有する変異体であることが示されたが、このようにPCR産物に1種類の変異アレルし
か含まれない場合、ミスマッチする配列が存在しないため、T7E1 assayではindel変異を検
出できない。この問題を解決する手段として、あらかじめサンプルのPCR産物に野生型の
PCR産物を混合することが、有効な方法であると考えられる。この方法であれば、1種類の 変異アレルしか含まない場合であってもT7E1 assayで検出が可能となる。したがって、T7E1
assayはGONAD法のように複数の変異アレルが発生し易い場合に加え、1種の変異アレル
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のみでも変異を検出可能となることが期待されることから、GONAD法で作出された複数の
変異アレルのスクリーニングには強力なツールになると考えられる。
56 総括
本研究では、従来の顕微注入法による遺伝子改変マウス作製に必須な胚のex vivo操作と
いうステップを経ずにゲノム編集マウスを作製できる「GONAD法」と呼ぶ新規手法の開発
を進めた。第1章では、in vitro/in situエレクトロポレーションによって卵管内の2細胞期胚
にmRNAが導入可能であり、そのmRNAから機能性タンパク質が翻訳されることを明らか
にした。また、CRISPR系RNAを用いることで、Cas9ヌクレアーゼによる配列特異的な標
的遺伝子のゲノム編集が可能であることを示した。一方でエレクトロポレーションによる
胚へのダメージが示唆され、胚の着床・発生能についても検証が必要であると考えられた。
そこで第2章では、in situエレクトロポレーションによりCRISPR系RNAが導入された胚
が正常な着床と妊娠維持を行うことができるかどうかを検討するため、2つの胎仔期におけ
る胎仔の表現型を解析した。その結果、妊娠中期（Day 13.5）ならびに妊娠末期（Day 19.5）
の双方のステージにおいて、標的遺伝子をKOされた外貌的に正常な胎仔を得ることに成功
し、「GONAD法」が実用化される可能性を見出した。
GONAD法は、1）mRNA導入により目的のタンパク質を卵管内に存在する着床前胚で発
現させることが出来る、2）CRISPR/Cas9 関連RNA の導入によりゲノム編集マウスを従来
法に較べより簡便に作製できる、という2つの特徴を持つ。したがって、導入RNAとして
Cre mRNAまたはFLP mRNAを用いれば、in vivoで標的遺伝子の組換え（floxedアレルまた
はFRTedアレルを除去するなど）も可能となることから、conditional KOなどの他領域への
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応用性も期待される。また、GONAD法は胚のex vivo処置を必要としないので、従来の顕
微注入法で使われる供試マウスの数を大幅に減らすことができる。例えば、従来法では繁
殖用雄マウス、採卵のための複数の雌マウス、胚移植のための偽妊娠雌マウスおよび精管
結紮雄マウスが必要となる[Harms et al., 2014]。一方、GONAD法は繁殖用雄および雌マウス
の 1 組のペアのみで実施が可能であるため、偽妊娠雌マウス、精管結紮雄マウスは不要と
なる。したがって、動物福祉で重要視される3R’s（Replacement, Refinement and Reduction）
にも十分叶った手法と言える。さらに GONAD 法はラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ等
の他の生物種にも適用できるポテンシャルを有する。卵管を外科的に処置することができ
れば、CRISPR / Cas9システムの適用によるゲノム編集動物作製の可能性が大いに期待でき
る。過去30年にわたり、Tg技術はマウスを中心に進化しており、世界中の研究機関の多く
の施設で各種モデルマウスが作製されている。しかし、旧来法では胚のex vivo操作を伴う。
これはマウス以外の動物種を扱う場合でも例外ではない。しかし、一般的に、マウス以外
の動物種における胚のex vivo操作は様々な困難を伴う。故に、採卵、胚操作、顕微注入お
よび偽妊娠動物への胚移植などのステップをバイパスできる GONAD 法は、他種動物での
遺伝子改変に光明を与える手技となり得るかもしれない。
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66 謝辞
本論文の作成にあたり、終始ご助言を賜りました本研究の指導教授である東京農業大学
大学院生物産業学研究科・教授・亀山祐一博士（生物産業学）ならびに東京農業大学名誉
教授・横濵道成農学博士に厚く御礼を申し上げる。また、実験遂行と論文執筆について多
大なるご指導を頂きました東京農業大学生物産業学部・准教授・和田健太博士（生物産業
学）に深く感謝の意を表する。また、本研究におけるGONAD法の考案と開発を主導され、
実験系の立ち上げ、実験指導、学術論文の執筆について多くのご指導を頂きました、東海
大学医学部基礎医学系・准教授・大塚正人博士（理学）ならびに鹿児島大学医用ミニブタ
先端医療開発研究センター・遺伝子発現制御分野・教授・佐藤正宏博士（医学）に厚く御
礼を申し上げる。また、実験遂行にあたり多大なるご協力を頂きました、東海大学医学部
基礎医学系・研究員・三浦浩美博士（医学）、米国University of Nebraska Medical Center・
Assistant Professor・Channabasavaiah B. Gurumurthy 博士（Ph.D.）に御礼を申し上げる。