さらに，本研究では，中耳炎患者から分離された菌株である NTHi strain 12 を用いたが，
この他にも多くの NTHi 菌株が中耳炎や慢性呼吸器疾患といった炎症反応に関与して いる．したがって，本研究で示された NTHi 由来の EGF-like factor や TGF-β-like factor
による TLR2 発現の制御機構が他の菌株に共通の機構であるかについても，今後検討
する必要があろう．
以上，EGF-like factor，TGF-β-like factor といった種々の因子による TLR2 発現の厳密 な制御は，宿主の免疫応答における TLR2 発現の制御の重要性を示唆している．した がって，この機構の一端を明らかとした本研究は，前述のような課題は残るものの，
NTHi 感染に対する予防薬および治療薬の開発における重要な知見のひとつであると考 えられる．今後の研究により NTHi 感染時の自然免疫の制御機構がさらに明らかとな り，中耳炎や慢性呼吸器疾患といった炎症性疾患の病体解明および予防，治療に結び ついていくことが期待される．
第五章 実験方法の部
第一節 細胞培養
培養に用いた全ての器具類はγ線滅菌済みのものを用い，全ての操作はクリーンベ ンチ内で無菌的に行った．また，全ての細胞は 5% CO2，37℃の条件下で静置培養した．
本研究では，ヒト子宮頸癌細胞である HeLa 細胞を minimal essential medium を用い て，ヒト乳がん細胞である MDA-MB-453 細胞及び MDA-MB-468 細胞を Dulbecco’s modified Eagle’s mediumを用いて培養し，各培養液中には，10% fetal bovine serum，100 units/ml penicillin 及び 0.1 mg/ml streptomycin を添加した．また，ミンク肺細胞株である Mv1Lu 細胞，R1B 細胞及び DR26 細胞においては，培養液として Eagle’s minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution を用い，10% fetal bovine serum，2 mM L-Glutamine，1% non-essential amino acids，100 units/ml penicillin 及 び 0.1 mg/ml
streptomycin を添加して培養を行った．
第二節 NTHiの培養と抽出液の調整
本 研 究 で 用 い た NTHi は 中 耳 炎 患 者 か ら 単 離 さ れ た 株 で あ り ，Dr. H. Faden (Children’s Hospital of Buffalo, State University of New York, Buffalo, NY)より譲り受けた．
NTHi の培養には NAD（3.5 mg/ml） を添加した brain heart infusion brothを用い， 5%
CO2，37℃の条件下で静置培養した．
NTHi 抽出液の調製には，OD 600nm の値が 0.4 - 0.5 の際のNTHi を遠心分離（10,000 g，4℃，10 min）により回収したものを用いた．上清を捨てた後，最初の培養量の 1/3 量の PBS を用いて再懸濁し，超音波処理（80 W）を 3 min 間隔で三回繰り返し懸 濁液とした．超音波処理で破壊されなかった NTHi を遠心分離（10,000 g，4℃，10
min）により除去した後，上清を NTHi 抽出液とした．なお，15 mg/ml のNTHiを各実
第三節 Transfection
本研究における Transfection はTransIT-LT1®（Mirus）を用いて行った．まず，50 µl の無血清培地（Opti-MEM）にTransIL-LT1® を添加し vortexした後，室温で 15 min 反 応させた．その後，目的遺伝子を添加し，さらに15 min 反応させ，細胞に滴下した．
以後の実験には Transfection から 42 時間後の培養細胞を用いた．なお，TransIT-LT1®
は DNA 全量との比が 1：4 となるよう調整した．
第四節 Promoter assay
Transfection から 42 時間後の培養細胞に，NTHi 抽出液あるいは各試薬の処理を行っ
た後，培養細胞を PBS にて洗浄し，細胞溶解液（0.25 M Tris，pH 7.5，0.1% Triton
X-100，0.1% DTT）を用いて細胞を溶解させた．Lusiferase 活性 は，得られた溶解液と
luciferase 基質の混合液を，luminometer (Analytical Luminescence, San Diego, CA)を用い て測定した．
第五節 RNA の抽出及び Quantitative Real-Time PCR
第一項 RNA の抽出
本研究におけるRNA の抽出は Trizol®（Invitrogen）を用いて行った．まず，0.5 ml の Trizol® を細胞に添加後，5 min 室温でインキュベートして細胞の可溶化を行った．
その後，0.1 ml のクロロホルムを加え vortex し，遠心分離（12,000 rpm，15 min）によ り水相を回収した．この水相に 0.25 ml の isopropanol を加えて vortex 後，isopropanol 沈殿を行った．得られた沈殿は 70% ethanol で洗浄し，DEPC 水に溶解後，以後の実験 に用いた．
第二項 Quantitative Real-Time PCR
RNA は前項で述べた方法で抽出した．RT 反応は，TaqMan reverse transcription reagents（Applied Biosystem）を用い，25℃ 10 min，37℃ 60 min，42℃ 60 min， 95℃ 5 min の条件で行った．なお，primerには，oligo（dT）primer 及び random hexamers を用いた．PCR 反応は，RT 反応により得られた cDNA 1 µl と TaqMan Universal Master Mix（Applied Biosystem），100 nM primers 及び 100 nM probe または SYBR Green Master Mix（Applied Biosystem） 及び 100 nM primers を用いて行った．な お ， 用 い た probe の 5’ 末 端 は fluorescent reporter dye と し て FAM（ 6-carboxyfluorescein） で ，3’ 末 端 は fluorescent quencher dye と し て TAMRA（ 6-carboxytetramethylrhodamine）で修飾されている．primer 及び probe の各塩基配列は以 下の通りである．TLR2 forward primer，5’-GGC CAG CAA ATT ACC TGT GTG-3’，
reverse primer，5’-AGG CGG ACA TCC TGA ACC T-3’，TaqMan probe，5’-FAM-TCC ATC CCA TGT GCG TGG CC-3’ mTLR2 forward primer，5’-AAG GCA TTA AGT CTC CGG AAT TAT C-3’，reverse primer，5’-TCA CTT AAG CGA GTC TGC TTT CCT GCT-3’，TaqMan probe，5’-FAM-TCC CAA AGT CTA AAG TCG ATC CGC GAC-3’ EGF forward primer，5’-GCC CCA TTC TCT CCT ATC AGC-3’，reverse primer，5’-GTC AGC TCC ATT TGG TGT GGT-3’ TGF-β1 forward primer，5’-CGA GCC TGA GGC CGA CTA C-3’，reverse primer，5’-AGA TTT CGT TGT GGG TTT CCA-3’ TGF-β2 forward primer，5’-CCA TTA AGT GGA GTT GCT GTA CGT-3’，reverse primer，5’-GTG CCT ATT GCA TAG CAA TAC AGA A-3’ TGF-β3 forward primer，5’-CAA ATT CAA AGG CGT GGA CA-3’，reverse primer，5’-CTT GAG GCG CCC CAG AT-3’
第六節 RNA-mediated Interference
transfection reagents を添加し，室温で 15 min 反応させ，細胞に滴下した．以後の実験 には Transfection から 36 時間後の培養細胞を用いた．
第七節 Immunoprecipitation
本研究における immunoprecipitation は Santa Cruz Biotechnology の方法に従い行った．
まず，500 µl の Lysate を control goat IgG 抗体及び protein-A agarose と 30 min，4℃でイ ンキュベートし，非特異的な結合の除去を行った．続いて上清をEGFR抗体と 1 hr， 4℃でインキュベートした後， protein-A agarose を添加し，4℃で overnight のインキュ ベートを行った．immunoprecipitate を RIPA buffer で 3 回洗浄し，2 sample buffer を 用いて再懸濁を行いサンプルとした．得られたサンプルは SDS-PAGE により分離し，
Western Blotting により目的のバンドの検出を行った．
第八節 Western Blotting
回収したサンプルを， SDS-PAGE を常法に従い行った後，PVDF 膜に転写（250 mA， 2 hr）した．転写した PVDF 膜は 5% スキムミルクを含む 0.1% Tween 20-TBS（TBS-T）を用い，室温にて 1 hr マスキングした．続いて，膜を TBS-T で洗浄し，5% BSAを 含む TBS-T に溶解した一次抗体（1：1000）を用いて，4℃ overnight で一次抗体反応 を行った．その後，TBS-T を用いて膜を洗浄し，peroxidase 標識された二次抗体（1：
2000）を用いて二次抗体反応を行った．二次抗体反応終了後， TBS-T で膜を洗浄し，
ECL-plus 試薬を用いて抗体反応を検出した．
第九節 Neutralization Assay
第一項 ligand neutralization assay
本研究における ligand の neutralization assay は，NTHi 抽出液と control IgG，EGF ま たは TGF-β 中和抗体を， 細胞への処理前に 1 hr インキュベートし growth factor like
第二項 receptor neutralization assay
本研究における receptor の neutralization assay は，細胞と control IgGまたはEGFR 中 和抗体を， NTHi 抽出液処理前に 1 hr インキュベートし細胞の EGFR を中和すること で行った．
第十節 Immunodepletion
60 µg の NTHi 抽出液を control IgG 抗体及び protein-A agarose と 30 min，4℃でイン キュベートし，非特異的な結合の除去を行った．続いて上清を EGF または TGF-β 抗 体と 1 hr，4℃でインキュベートした後， protein-A agarose を添加し，4℃で overnight インキュベートを行った．得られた上清を細胞処理用溶液とし，以後の実験に用いた．
第十一節 ELISA Assay
細胞培養液中の growth factor の量は ELISA assay を用いて検討した．まず，ELISA plate に 150 µl の 0.01 M citrate buffer と 150 µl の細胞培養液上清を添加し，4℃，
overnight でインキュベートすることで，plate の coating を行った．0.05% Tween 20-PBS
（PBS-T）を用いて plate を洗浄した後，200 µl の 10 mg/ml BSA を用いて，室温で 1 hr マスキングを行った．続いて，100 µl の一次抗体を添加し，一次抗体反応を室温で 1 hr 行った．二次抗体反応は peroxidase 標識された 100 µl の二次抗体と室温で 1hr イン キュベートすることで行った．二次抗体反応終了後，PBS-T で plate を洗浄し，100 µl の TMB substrate buffer（Bio-Rad）を用いて抗体反応を検出した．なお， peroxidase と TMB substrate buffer の反応の停止には 40 µl の 4 M sulfuric acid を用いた．
第十二章 Immunofluorescent Staining
本研究における immunofluorescent staining には，4-chamber microscope slide 上で培養 し た 細 胞 を 用 い た ．TGF-β1 あ る い は NTHi 抽 出 液 で 細 胞 を 処 理 後 ，3.7%
paraformaldehyde solution を用いて細胞を固定し，一次抗体反応を行った．二次抗体反
応には fluorescein isothiocyanate（FITC）-conjugated IgGを用い，一次抗体反応を検出し た．
第十三章 In Vivo Study
BALB/c mice は Charles River Laboratories から 7-8 週の mice を購入した．mTLR2 の 発現は，AG1478（1 mg/mouse；50 mg/ml），PP2（0.2 mg/ml；10 mg/ml）， SB431542
（0.2 mg/ml；10 mg/ml）または Ro31-8220（0.2 mg/ml；10 mg/ml）の chemical inhibitor を腹腔内へ 30 min 投与した後，NTHi を気管へ injection し，肺組織から RNA を回収，
quantitative real-time PCR により検討した．各実験には 3 匹の mice を用いた．
謝辞
稿を終えるにあたり，終始御指導と御校閲を賜り，本研究に際し，御指導と御鞭撻を 賜りました熊本大学大学院医学薬学研究部 甲斐 広文 教授に深甚なる感謝の意を 表します．
I would like to express my deepest respect and gratitude to Dr. Li, Jian-Dong, chief of Section on Signal Transduction at House Ear Institute in the United State, for all the advice and the help.
本稿作成に際し，御指導，御校閲を賜りました熊本大学大学院医学薬学研究部 有馬 英俊 助教授，山縣 ゆり子 教授に深く感謝の意を表します．
I would like to thank Dr. Jono Hirofumi, Dr. Hajime Ishinaga, Dr. Lim, Jae-Hyang, Dr. Ha, Un-Hwan, Dr. Kim, Soo-Mi, Dr. He Gu and Dr. Xu, Haidong at house Ear institute in the United States for all the help.
本研究に際し，御指導，御助言を賜りました熊本大学大学院医学薬学研究部 首藤 剛 助手，Mary Ann Suico 助手に深く感謝の意を表します．
本稿作成に際し，御指導，御助言を賜りました沖米田 司 博士に深く感謝の意を表 します．
本稿作成に際し，御協力頂きました遺伝子機能応用学研究室の諸氏に深く謝意を表し ます．特に，友人として私を支えてくれた下原 修治 修士，原田 一恒 修士，吉 田 裕樹 修士に心から感謝の意を表します．
参考文献
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