制 131G

SV40 T antigen SV400ri

図5・3 プラスミド

p

l¥在Y189

KS40~認mmmm旦 pKY241

gyrA

( a m )

lacZ

( a m ) i Cm ^f _g~A

時 4 山 ^γ ^{加点的} ^1p ^離れ ⁸⁹

lacZ

( a m )

supt= gyrA""'‑'

n a lr

gyrA(am) ""'‑'

n a lr

企 ^m

normal

supF

ー令

lac

z + ，

gyrA+ ""'‑'

n a ls mutated

supF =

→

^lacZ^雪^gyrA.^‑^.^.^.^‑

ⁿ ^a ^lr

図 5^・4 supF遺伝子に変異が生じた変異体を選別する原理

第2節プラスミドpMY189のグリオキサール処理と COS‑7細胞へのトランスフェクション

エッペンドルフチューブ中にpMY189及び使用直前に調製したグリオキサール溶液を加えた^O グリオキサール処理に用いたグリオキサ‑}レの量は、プラスミド400ng当り 0、10、50、100、120、150μg(DNA1残基:グリオキサールのモル比は、各々、 1:0、135、677、1625、2031である)とした。 37⁰Cで 60分間インキュベートした後、ゲルろ過により未反応のグリオキサールを除去し、直ちに COS‑7細胞へのトランスフェクションに用いた。尚、いずれのグリオキサール処理条件においてもプラスミド DNAの切断はみられなかった。

グリオキサール処理したプラスミド pMY189をリポフェクション法により COS‑7細胞にトランスフェクションした。リポブエクション法とは、 DNAが内包されたリボソームを用い締胞融合を利用して、補乳動物細胞に DNAを導入する方法である。人工的に作製した脂質二重膜でできた揚イオンリポソームと DNAを混合すると、リボソーム‑DNA複合体ができる。この複合体を含む溶液で細胞を培養すると、複合体中の DNAが細胞に取り込まれる^D リン酸カルシウム法などよりも効率よく DNAを細胞に導入できるので、最近では種々の遺伝子導入用リポソームが市寂されている。著者は G1BCO BRL社の LIPOFECTAMINETM試薬を用いてCOS‑7細胞へのトランスフェクションを行った。以下に方法を示す(図5・5)。約5X 10⁵cellsのCOS‑7細胞を 24時間培養した後、培地 (DME1μ10%胎児ウシ血清)を除去し、血清や抗生物質を含まない培地 (DMEM)を加えて細胞を洗浄し、再び培地を除去した。直ちに、

グリオキサール処理したpMY189、OPTI‑MEM3.IReduced Serum Medium、 LIPOFECTAMINETM試薬、培地を混合して調製した DNA試料を加えて、 5時間培養した後、胎児ウシ血清の終濃度が 10%となるように培地 (DMEM+20%

胎児ウシ血清)を加え、さらに 19時間培養した。翌日、培地 (DMEM+10%給児ウシ血清)を用いて培地交換し、さらに 1‑2日間培養した。

細胞数が増加したところで COS‑7細胞を回収し、アルカリ法によりプラスミドを回収した飽。ここで、回収したプラスミドを制限酵素 DpnIにより消化し、

C O S ‑ 7

細抱内で、複製されなかったフラスミドを除去した。

本実験ではプラスミドのグリオキサール処理で生成した

DNA

損傷を同定していないが、その大部分がグリオキサール心付加体(図 2)であると予想されるo 但し、この付加体形成反応は平衡反応であり、グリオキサール処理したプラスミドを

C O S ‑ 7

細胞にトランスフェクションする段階での付加体生成量は定かではない。

DNA

L l POFECTAMINETM

COS‑7 c e l l s ( 5 x 1 0

⁵

c e l l s ) I OPTI

・

MEM

司

1Reduced Serum Medium j u c m i D M E M

A d d i t i o n o f DNA s o l u t i o n 37

⁰

C

，

5 h r

A d d i t i o n o f DMEMi

・

20%FCS( f i n a l 10%FCS) 37

⁰

C

，

1 9 h r

Medium exchange (DMEM+10%FCS)

十ドい

C o l l e c t i o n 0 1 COS

柵♂

7c e l l s

図

5

・

5 C O S ‑ 7

細胞への

DNA

トランスフェクション

第 3節 suvF変異体の選別

まず、

C O S ‑ 7

紹胞からのプラスミドの回収率を調べるために、 Dpn

I

処理したプラスミド

pMY189

を塩化カルシウム法により

DNA

取り込み効率の高い大腸菌

HBI01

株にトランスフェクションした(函

5

・1)⁰

pMY189

はアンピシリ

ン耐性遺伝子を含有していることから、アンピシリンを含むLB寒天培地上のコロニーの数から大腸菌の生存率を算出し、

C O S ‑ 7

細胞からのプラスミドの回収率とみなした。尚、予め、大腸菌

HBI0l

株への

DNA

トランスフェクションにおいて、導入したプラスミド量に正比例してコロニー数が増加することを確認

した。プラスミドのグリオキサール処理による、大腸菌の生存率すなわち

C O S ‑ 7

細胞からのプラスミドの回収率の変化を図ふ6Aに示した。グリオキサール処理濃度の上昇に伴い回収率が低下したことから、 COS‑7細胞においてグリオキサ

‑}レが毒性を有することは明らかであるo この毒性は、グリオキサールがDNA に作用することにより生じた DNA鎖の切断(第6章で詳しく述べる)あるいは DNA付加体形成による DNA複製の阻害に起因すると考えられる^D

続いて、 supF遺伝子に変異が生じた変異体を選別するために、 DpnI処理したプラスミド pMY189を塩化カルシウム法により大腸菌 KS40/pKY241株にトランスフェクションした(図 5・1)0 COS‑7細胞における変異率を調べるためトランスフェクションした培養液を、 2種類の寒天培地を用いて培養した。

A B

150

100

( 寸 ' OF

×﹀比三

軽量

100

( ポ ) ℃

︒

5 5s

︒

さむ

干の CC﹄ζ

︒

凶.φ

﹀一日

O O O

O 100 150

g l y o x a l ( μ g )

50 150

100

g l y o x a l ( μ g )

図 5・6 COS‑7細胞へのトランスフェクション実験におけるプラスミドの回収率 (A)及び変異率 (B)0 (A) COS‑7細抱より回収したプラスミド pMY189を大腸菌狂B101株にトランスフェクションした。トランスフォーマントのコロニー数から大腸薗の生存率を算出し、COS‑7細胞からのプラスミドの回収率とみなした。 (B)COS‑7細胞において supF遺伝子上に生じた変異の変異率。各々の条件における COS‑7細胞へのト

ランスフェクション実験を最低 3回行い、平均値を算出し図に示した。

X軸は 100ulのプラスミド溶液に添加したグリオキサールの量を表わしている^O

大腸菌KS40/pKY241/pMY189株は、 supF遺伝子変異の有無に関わらず、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含む

LB

寒天培地上で生育できる。一方、

アンピシリン、クロラムフェニコール、 IPTG、X‑gal、ナリジキシン酸を含む

LB

寒天培地上では、 supF遺伝子に変異が生じた変異体のみが白色のコロニーを形成し得るo よって、これら 2種類の寒天培地上のコロニーの数から、生菌数当りの変異体数として、 C08‑7細胞における変異率 (MF)を算出した。プラスミドのグリオキサール処理による、大腸菌の変異率すなわち C08‑7細胞における変異率の変化を図 5・6Bに示した。グリオキサール処理濃度の上昇に伴い変異率が上昇した。すなわち、 C08‑7紹胞においてもグリオキサールが変異誘発能を有することが示された。尚、グリオキサールによって誘発された変異の解析は、各々の濃度のグリオキサール処理実験で得られた変異体について行った。解析を行った変異体についての変異率の平均値は 9.1X 10.³であり、未処理群(グリオキサール Oμg)の約 11倍であるo

第

4節変異体の suvF遺伝子の配列解析

前章ではダイプライマー法を用いて配列を解析したが、ここで解析を行う supF遺伝子は全長 176塩基対と短いことから、シークエンス反応が比較的笥便であるダイターミネーター法を用いた。

実際に supF遺伝子の配列を解析するに当り、まず、 supF遺伝子に変異が生じていることが確認された変異体の大腸菌を単離培養し、大腸菌よりプラスミ

ドを回収した。次に、フラスミド上のsupF遺伝子全領域を PCRにより増幅した。この PCR産物を鋳型 DNAとし、パーキンエルマ一社の Applied Biosystems Dye Terminator Cycle 8equencing Kitを用いてシークエンス反応を行った。配列解析はAppliedBiosystems model 3738 DNA 8equencerを用いて行った。

未処理群から得られた 48クローンの変異体及びグリオキサール処理群から得られた 98クローンの変異体について配列解析を行った。その結果supF遺伝子上に検出された突然変異を表 5・1に示した。全体の変異スペクトルは、未処

55

理群とグリオキサール処理群とで類似しているD しかし、グリオキサール処理群における変異率は未処理群の約

11

倍であることから、グリオキサール処理群で検出された突然変異の大部分がグリオキサールによって誘発された変異であると考えられるD グリオキサールは主として塩基置換変異及び複数塩基の欠失変異を誘発した。この欠失変異の欠失塩基数は、

29

塩基から

233

塩基と多様であり、また変異のホットスポットは観察されなかった。次に、塩基置換変異に着目すると、グリオキサールは主として G:C塩基対に変異を誘発し、検出された塩基置換変異の

83%

が G:C塩基対における変異であった。特に、 G:C→

T:A

トランスバージョンが最も高頻度で検出され、次いで G:C→C:Gトランジッシヨンが検出された。この結果は、前章の大腸菌の系で検出された変異と若干異なっている。いずれの系でも検出された塩基置換変異の約 8割がG:C塩基対における変異であったが、大腸菌の系では、 G:C→

A:T

トランジッションが最も高頻度で検出され、次いで、 G:C→

T:A

トランスバージョンが検出された。このよう

な相違が見られた理由については、後で詳しく考察する。

表

5‑1

supF遺伝子上に検出された突然変異

M u t a t i o n Cases found (%)

Glyoxa 卜 induced Spontaneous S i n g l e

^咽

bases u b s t i t u t i o n 48 ( 4 8 ) 3 1 ( 6 5 )

G:C → T:A 23 ( 2 3 ) 20 ( 4 2 ) G:C

一心

1 1 ( 1 1 ) 10 ( 2 1 ) G:C → A:T 6 ( 6 ) ( 2 ) A:T → T:A 8 ( 8 )

⁽ ⁰ ⁾ Tandem m u t a t i o n 4 ( 4 ) ( 2 )

GG → TT(CC → AA) 2 ( 2 ) 。 ( 0 ) GG → CT(CC → AG) ( 1 )

⁽ ⁰ ⁾ GG → AT(CC → Aη ( 1 )

⁽ ⁰ ⁾ GG → AA(CC‑

揃一‑鱒句a噂.伊白 G

( 0 ) ( 2 ) . d . G:C 4 ( 4 ) 4 ( 8 ) M u l t i ‑ b a s e d e l e t i o n 3 1 ( 3 2 ) 9 ( 1 9 ) M u l t i p l e m u t a t i o n

1 1 ( 1 1 ) 3 ( 6 )

T o t a l 98 48

a AII 01 the mutations occurred at G:C sites. In glyoxal‑induced m以ants，12G:C

→

A:T mutations， 9 G:C

→

T:A mU1ations， and 3 G:C→C:G mU1ations were observed. In spontaneous mU1ants， G:C→A:^T and G:C→^C:G

were observed within 2 colonies， and a one base deletion at a G:C site and G:C→A:Twere obse

。向

^d^wⁱ^t^hⁱⁿ

one colony.

図5・7に未処理群及びグリオキサール処理群で検出された 1塩基変異(1塩基の塩基置換変異及び欠失変異)の supF遺伝子上の分布を示した。両群ともに変異のホットスポットが観察された。未処理群では、 supF遺伝子の 160番の位置での G:C→T:Aトランスバージョンがここで示した変異の 48%を占めている。

また、 123番、 133番及び139番の位置にもマイナーホットスポットが観察された。一方、グリオキサール処理群で、は、 133番の位置での G:C→T:Aトランスバージョンがここで示した変異の 35%を占めており、さらに 159番の位置での G:C→C:Gトランジッションが 27%を占めている。従って、未処理群とグリオキサール処理群とでは変異の分布が明らかに異なっていた。このことは、グリオキサール処理群で検出された突然変異が、 DNAのグリオキサール処理により生成した DNA修飾に由来するものであることを示している。

5'‑‑‑39 AT TIGATATGAT GCGCCCCGCT TCCCGATAAG GGAGCAGGCC AGTAAAAGCA 90

…

^‑ ^‑ ^. ^J

G A T2 C G3 G3

+ + + + +

91 TIACCTGTGG TGGGGTICCC GAGCGGCCAA AGGGAGCAGA CTCTAAATCT 140

Begin tRNA

‑ ‑ . J i ~ i

¹⁷

q u

m

印

刷し

∞ す

ドキュメント内 File Information Type Doc URL DOI Issue Date Citation Author(s) Title (ページ 56-62)

SV40 T antigen SV400ri

p

KS40~認mmmm旦 pKY241

( a m )

( a m ) i Cm f g~A

時 4 山 γ 加 点 的 1p 離れ 89

( a m )

n a lr

n a lr

企 m

normal

ー令

z + ，

n a ls mutated

→

n a lr

C O S ‑ 7

DNA

C O S ‑ 7

DNA

L l POFECTAMINETM

COS‑7 c e l l s ( 5 x 1 0

c e l l s ) I OPTI

MEM

1Reduced Serum Medium j u c m i D M E M

A d d i t i o n o f DNA s o l u t i o n 37

C

5 h r

A d d i t i o n o f DMEMi

20%FCS( f i n a l 10%FCS) 37

C

1 9 h r

Medium exchange (DMEM+10%FCS)

十 ド い

C o l l e c t i o n 0 1 COS

7c e l l s

5

5 C O S ‑ 7

DNA

C O S ‑ 7

I

pMY189

DNA

HBI01

5

pMY189

C O S ‑ 7

HBI0l

DNA

C O S ‑ 7

A B

( ポ ) ℃

︒

︒

さ む

︒

g l y o x a l ( μ g )

g l y o x a l ( μ g )

LB

LB

第

55

11

29

233

83%

T:A

A:T

T:A

5‑1

M u t a t i o n Cases found (%)

Glyoxa 卜 induced Spontaneous S i n g l e

bases u b s t i t u t i o n 48 ( 4 8 ) 3 1 ( 6 5 )

G:C → T:A 23 ( 2 3 ) 20 ( 4 2 ) G:C

1 1 ( 1 1 ) 10 ( 2 1 ) G:C → A:T 6 ( 6 ) ( 2 ) A:T → T:A 8 ( 8 )

( 0 ) Tandem m u t a t i o n 4 ( 4 ) ( 2 )

GG → TT(CC → AA) 2 ( 2 ) 。 ( 0 ) GG → CT(CC → AG) ( 1 )

( 0 ) GG → AT(CC → Aη ( 1 )

( 0 ) GG → AA(CC‑

( a m ) i Cm ^f _g~A

時 4 山 ^γ ^{加点的} ^1p ^離れ ⁸⁹

企 ^m

ⁿ ^a ^lr

十ドい

さむ

⁽ ⁰ ⁾ Tandem m u t a t i o n 4 ( 4 ) ( 2 )

⁽ ⁰ ⁾ GG → AT(CC → Aη ( 1 )

⁽ ⁰ ⁾ GG → AA(CC‑

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^‑ ^‑ ^. ^J

刷し