大腸菌におけるグリオキサールの変異 誘発能

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第 4 章大腸菌におけるグリオキサールの変異

Regulatory 

gene  Control site 

r-A一一~I A一一~(

Structural genes  人.

l ^I .  I  ^p  / o l  

Control of  Promoter 

I 

inducibility 

Operator 

Z  I  Y  I  A 

l a c f   ( w i l d = i y p e )  

l a c r   (mutan

t) 

l a c ぴ (mutan

t)

I 

^{Transacetyl制}

Permease 

戸

嶋

Galactosidase

図4‑1 lacオペロンの構造

f  1  p  101  z  1  y  1  A 

L ^ノれ…叫

よ斗/

↓ d 

Z  I  Y  I  A 

n  ↓  ^s

^回Galactosidase

Z  l Y  I  A 

↓ 

鈴 か

Galacto剥 ase 図4・2 lacI遺伝子又は lacO遺伝子の変異による lacオペロンの税制御

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結合するため戸‑ガラクトシダーゼは誘導されない。しかし、 lacI遺伝子に変異 が生じた変異体では、リフレッサーがオペレーターに結合することができない ためβガラクトシダーゼが誘導されるD また、 lacO遺伝子に変異が生じた場合 には、 lacオペロンの負の謁節機構が脱制御状態になり、 lacI変異体に比べると 発現レベルは低いが、常に βガラクトシダーゼが合成される^D よって、 lacオペ ロンの誘導物質が存在しない条件では、 lacI遺伝子またはlacO遺伝子に変異が 生じた変異体のみがβガラクトシダーゼ合成能を獲得するO

βガラクトシダーゼ合成能の有無に基づき lacI遺伝子上に変異が生じた変異 体を選別する際、指示薬としてフェニル‑βD・ガラクトピラノシド (P‑gal)及び 5・ブロモ‑4‑クロロ4・インドリル

‑ s

^・D‑ガラクトピラノシド (X‑gal)を用いる 74，76₀

いずれも _βガラクトシダーゼの基震であるが、 lacオペロンの誘導物質ではないo

P‑galが加水分解されるとガラクトースとフェノールに分解されるため、ガラク トース代謝能を有する大腸菌はP‑galを炭素原として利用できる。すなわち、lacI 遺伝子またはlacO遺伝子に変異が生じ、 βガラクトシダーゼ合成能を獲得した 大腸菌は、炭素源として P‑galのみを含む培地においても増殖可能となる。一方、

X‑galは加水分解され濃青色の 5‑ブロモ

ι .

クロロ欄インディゴを放出するo この X‑galを含む寒天培地上のコロニーの色により、菌体内の戸・ガラクトシダーゼの 発現レベルを判定することができる。 X‑galが最少グルコース培地中に含まれる 場合に、戸‑ガラクトシダーゼ活性の検出感度が最も高いとされている。 X‑galを 含む最少グ

l

レコース寒天培地上で、lacI遺伝子に変異が生じた変異体は濃青色の

コロニーを形成し、 lacO遺伝子に変異が生じた変異体は淡青色のコロニーを形 成するO これらの性質により、 lacI遺伝子に変異が生じた変異体の選別が可能と なる。

第 2節 大腸菌のグリオキサール処理

まず、本実験で用いる大腸菌W3110野生株の lacオペロンが正常に機能して いること、すなわち lacI遺伝子及び、lacO遺伝子に変異が生じていないことを確 認した。 X^幽galを含む最少グ、jレコース寒天培地上で大腸菌 W3110株を画線培養

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した。この際、青色と白色のコロニーが生じるD 自色のコロニーは、 lacI遺伝子 及びlacO遺伝子に突然変異が生じておらず、[3‑ガラクトシダーゼ活性が抑制さ れていることを示す。

X‑gal最少グルコース寒天培地上で、他のコロニーと良く分離した白色のコロ ニーを選択し、 LB培地に植え、 37⁰

C

で4時間振とう培養した。この培養液 1ml  に対し、使用直前に調製した 5 ulのグリオキサール溶液を添加した。グリオキ サール処理に用いたグリオキサールの量は、大腸菌の培養液 1ml当り 0、50、 200、300、400μgとした。 37⁰Cで1時間接とう培養した後、培養液の一部を 採り、 P‑gal寒天培地上で培養した。また、同培養液を適当に希釈した後、 LB 寒天培地上で培養したq

LB寒天培地は菌体の生育に必要な栄養条件を満たしていることから、この培 地上のコロニーの数から大腸菌の生存率を算出した。一方、 P‑gal寒天培地は炭 素源として P‑galのみを含む寒天培地であり、就に述べたように lacI遺伝子ま たはlacO遺伝子に変異が生じた変異体のみが、この培地上でコロニーを形成し 得る。よって、 LB寒天培地及びP‑gal寒天培地上のコロニーの数から、生菌数 当りの変異体数として、グリオキサールによる大腸菌の変異率 (MF)を算出し た。

大腸菌のグリオキサール処理による、大腸菌の生存率及び変異率の変化を図 4‑3に示した。グリオキサール処理濃度の上昇に伴い生存率が低下したことから、

大腸菌においてグリオキサールが毒性を有することは明らかである。序論でも 述べたが、グリオキサールと蛋白質との反応では、蛋白質中のア

l

レギニン残基

に対する結合 39や、蛋白質問のクロスリンクを引き起こすことが知られている

27，38，39₀ また、 DNAとの反応では、 DNA中のG残基に対する結合41，42や、培養 細胞及びm

吋

voにおける DNA鎖の切断が報告されている 40。従って、この毒 性の発現には、グリオキサールがDNAに作用することにより生じた DNA鎖の 切断(第6章で詳しく述べる)あるいはDNA付加体形成による DNA複製の泡 害、あるいはグリオキサールが蛋白質 (DNAポリメラーゼを含む)に作用する

ことによる蛋白質の失活等が関与していると考えられるo 一方、グリオキサー ル処理濃度の上昇に伴い変異率が上昇した。すなわち、大腸菌においてグリオ

36 

40 

O  O  30 

20 

10 

霞

(的

EO F× )比 三 100 

75 

50 

25 

A 

( ポ ﹀ 一

ω﹀ 一

と コ

ω

500  400 

g l y o x a l  ( μ g )  

200  300  500  100 

400  300 

g l y o x a l  ( μ g )  

100  200 

大腸菌のグリオキサール処理における生存率及び変異率。 (A)グリオ キサール処理 (37"C、1待問)による大腸菌の生存率。 (B)lacI遺伝 子及び lacO遺伝子における変異率。各々のグリオキサール濃度におけ るグリオキサール処理実験を最低3回行い、平均値を算出し図に示した。

X軸は大腸菌の培養液 1mlに添加したグリオキサールの量を表わして し=るo

図4・3

キサールが変異誘発能を有することが示されたD 尚、グリオキサールによって 誘発された変異の解析は、大腸菌の培養液 1ml当り 300ほのグリオキサール を添加して処理を行った実験で得られた変異体について行った^O グリオキサー ルによって誘発された変異を効率よく検出するためには、高い変異率と同時に ある程度の生存率を示す処理条件が望ましいと考えられる^O この 300μgの条件 下では、生存率1.5%、変異率1.0x 10・4であり、変異率は未処理群(グリオキ サール 0μg)の約 75倍であるo

次に、このP‑gal寒天培地上のコロニーから、 lacI遺伝子に変異が生じた変異 体のみを選別するために以下の操作を行った。100μのP‑gal培地に P‑gal寒天 培地上の単一のコロニーを選択して植え、 37"Cで一晩培養した。 この終夜培養 液を X^欄gal最少グルコース寒天培地及びP‑gal最少グルコース寒天培地に植え、

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さらに培養した後、 X‑gal最少グルコース寒天培地上で濃青色を示したコロニー をlacI変異体として選別した。そのものに対応する P‑gal最少クツレコース寒天 培地上の大腸菌を次節での実験に用いた。

第 3節 変 異 体 の lacI遺伝子の配列解析

DNAの配列解析法として、サンガーらの開発したジデオキシ法に基づく、酎 熱性細菌由来の TaqDNAポリメラーゼを用いたサイクルシークエンス法が広 く用いられている。本法の特徴は、環状及び鎖状 (1本鎖及び2本鎖)いずれの DNAも鋳型として用いることができ、 DNAの形状に無関係に同一反応条件が 使用できる点にある。また、サイクルシークエンス法の導入により、用いる鋳 型 DNAが少量c1μgまたはそれ以下)でよいことも長所の一つである。蛍光 式自動シークエンサーを使用することにより、簡便な操作で迅速かつ正確な配 列解析が可能である。現在、シークエンス反応産物を蛍光標識する方法として、

蛍光標識したプライマーを用いるダイプライマー (DyePrim er)法と基質であ るジヂオキシヌクレオチド (ddNTP)を蛍光標識したダイターミネーター (Dye Terminator)法があるo この他、基質ヌクレオチド (dNTP)が蛍光標識され

た方法もあるが、現在のところ汎用性はない。

ダイプライマ一法は、用いる鋳型DNA中にダイプライマーの配列がなくては ならないという制限があるが、基質が通常のヌクレオチドであり、その取り込 みが速やかであることから、明瞭な解析結果が得られる^D 一方、ダイターミネ ータ一法は、任意のフライマーを用いて解析できるが、基質が蛍光標識された ヌクレオチドであるため、ダイプライマ一法に比べ解析能力が劣る。今回、著 者が標的遺伝子とした lacI遺伝子は全長 1200塩基対と長いため、ダイプライ

マー法を用いて配列解析を行った。

実際に lacI遺伝子の配列を解析するに当り、まず、 lacI遺伝子に変異が生じ ていることが確認された変異体の大腸菌を P‑gal最少グルコース寒天培地から 単離培養し、大腸菌の染色体 DNAを抽出した。次に、染色体上の lacI遺伝子 全領域の解析を行うために、図 4・4に示した手順に従って配列解析を試みた 75₀

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まず、第 l段階自のPCRにより lacO領域を含む lacI遺伝子断片を得た^o次に、

ダイプライマ一法によるシークエンス反応を行うために、 5三末端にダイプライ マーの配列を有するプライマーを用いて第 2段階自の PCRを行った。 8P6、・ 21M13、T3は、これらに対応する汎用プライマーの名称に相当する。このPCR 産物を鋳合型DNAとし、パーキンエルマ一社のAppliedBiosystems Dye Primer  Cycle 8equencing Kitを用いてシークエンス反応を行った。配列解析はApplied Biosystems model 3738 DNA 8equencerを用いて行った。

Primer 2 

1st PCR 

: : p  

Primer 1 

~剛悶

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