思
￡8
2 o．s
o
o
10 20 30
incubation time （min）
Fig．1−5−1． Substrate spccificity of alginate lyases from／Alteromonas sp．
H−4 （A） and abalone （B）．
The alginate lyase activity was measured to the following 4 different
substrates； ＋Alg Na
＋Mblock −e一 G block ＋ MG random
71
ノ
ず
ノ
cathode side
e pl 9．3
＜
＜
Alginate lyase pl 4．7
pl 3．5
anode side
IEF G block Mblock Alginate
Substrate
Fig．1−5−2． Activity staining profiles of the alginate lyase from Alteromonas sp． H・一4 after isoelectric focusing gel electrophresis．
Table 1−5−1． Kinetic constants of the alginate lyase from．Alteromonas Sp． H−4
Substrate Km （mgtml）
Vmax（O．D．235／min／mg protein）
Vmax！Km
O．1 M Tris ＋Mg2 O．1 M Tris ＋Mg2＋ O．1 M Tris ＋Mg2＋
Alg−Na
Poly M Poly G
MG random
229 1431 66 165
18 227
16 14
O．021 0．042 0．016 0．029
O．036 0．062 0．036 0．032
9．2xlo 5 2．9xlo 5 2．4xlo 1．8xlo 4
2．Oxlo−3 2．7xlo 4 2．2xlo−3 2．3xlo−3 The reaction mixture based on O．1 M Tris−HCI buffer （pH7．5） containing 50 mM MgCl 2．
73
2。アルギン酸リアーゼによる基質分解物の解析
Fig．1−5−3に反応時間を12時間とした時のH−4株の菌体外アルギン酸リアーゼによる Alg−Na， polyM， polyGおよびMG randomの分解物のクロマトグラムを示した。ピークの横
に示した数字は、そえそれのピークに相当するフラクションの総ウロン酸残基数と総還元 末端基数の比から推定した二二の重合度（DP）である。 H−4株の菌体外アルギン酸リアー ゼ反応で生ずる分解物は、いずれの基質からも類似したDPを示す3種のオリゴ糖が生成
していることが観察された。それらの分解物の構成はAlg−NaからはDP 7， DP 6およびDp 4のオリゴ糖が・polyMからはDP 8， DP 5およびDP 3のもの、 polyGからはDP 7， DP 6 およびDP 3のもの・MG randomからはDP 7， DP 6およびDP 3であることが推定された（Fig．
1−5−3）。なお、polyM分解物では、わずかながらDP 8以上の不飽和オリゴウロン酸の生成
も認められた（Fig．1−5−3（B））。
また、Fig．1−5−4にはアワビアルギン酸リアーゼによる分解物を解析した結果をH−4株の 場合と比較して示した。アワビアルギン酸リアーゼはpolyGには分解性を示さなかったこ
とから（Fig．1−5−1（B））、 polyGを基質とした場合の分解物の解析は行わなかった。アワビ酵 素による分解物のパターンはH−4株の酵素分解物のそれに比べ、用いた基質により大きく 異なっていた・つまり・アワビ酵素が最も強い分解性を示したpolyMの分解物（Fig．1−5−1（B））
ではDP 4−5程度の短い糖鎖を中心に生成していたが、 MG randomからはDP 8程度の比較 的長い二二が主要構成成分となっており、Alg−Na分解物はpolyMとMG randomの両分解
物の中間的なパターンが観察された（Fig．1−5−4（B））。また、 H−4株およびアワビアルギン酸 リアーゼで分解した基質の分解物をクロマトグラフィーで分離して得られたピークから回 収された総ウロン酸の回収率をTable 1−5−2に示した。 H−4株アルギン酸リアーゼ分解物の 回収率はgg一・122％程度であり、ほぼ全てのウロン酸が回収された。一方、アワビアルギン 酸リアーゼでは、polyM分解物の回収率は110％とほとんどのウロン酸が回収されていた のに対し、Ng−Na分解物では74．5％、 MG random分解物では86．2％の回収率となり、未分 解な部分が残存していることを伺わせる結果となった。
次に、基質（Alg−NaおよびMG random）の分解反応時間を1時間にした場合の反応生成物 をゲル濾過で解析した結果をFig．1−5−5に示した。反応1時間では比較的高いDPの不飽和 オリゴ糖の比率が高く、DP・3・・ 4程度の短い糖鎖の生成が少ないことが観察された。反応時 間を12時間とし、十分に酵素反応を行うことにより、反応生成物中の短い糖鎖（DP・3一一4， DP 5・・6）の占める比率が高くなった。また、H−4株の菌体外アルギン酸リアーゼは50 mM Mg・・
9
taDP 7
6 4 1DP
8 5 3DP
7 6 3DP
7 6 3 Fig． 1−5−3． Elution profiles of the end products from different substrates degraded by the extra−cellular alginate lyase from Alteromonas sp・ H−4・A：Alteromonas sp． H−4 al．qinate lyase
（a） Alg−Na DP
7 64
（b） polyM B： Abalone alginate lyae
（a） Alg−Na DP
9 5 4fo） polyM
DP
8 5 3（c） polyG DP 10
5 4（d） MG random
DP
76
3 （c） MG randomDP
8 5 4DP
76
3 Fig．1−5−4． Elution profiles of the end products from different substrates degr． aded by the H−4 alginate lyase （A） and the abalone alginate lyase （B）Table 1−5−2． Recoverv rates of uronates seDarated belfiltration chromatograDhv of the alginate lvase Droducts
Substrate
．：t1！1g一11：fLg！giug！g．1ygH 41 t1 At！2｛｝！s2pg−g1gipajptygsgbalo litls Alg−NaolvMolvGMG randomAlg−NaolvMolvGMG randorn9 9
Applied ammounts of uronate （mg） Total ammounts of uronate after gelfiltration （mg） Recoverv （9e 6．00 6．97 116．2 6．00 7．3 121．7 6．00 5．91 98．5 6．00 6．89 114．8 6．00 4．47 74．5 6．00 6．62 110．3
NTi）
NT NT
6．00 5．17 86．2 NT） ： Not tested．
（A） Alg−Na：
1 h lncubation 12 h lncubation
一一一一一一ts−t｝一一一一｝．一．一．．一．一一e一一一一一一e一一一一一一ti一一一一一t一一一一e一一ee一一一一一一一一一．一s f一一itt一一一一一t一一一一一一一t一一一一一一一一一一一一t一一t一一ttt一一 i一 一一 一一一一一一一 S
； K 一． ． k 一一．一h．一一一一一．一一．一一．一一一．t 1
鳴．・璽響層・・唖・・●璽・璽… 鴨・・■■●● ■ ■ ・・●r・曝曝璽層●●●●艦艦●曾艦●●●噛閃閃●鵬●●●嘱q 豊●噛●o■●電鴨●●●●●艦艦儘●畢賢・覧・篭・●9●●●●魯畢5，りり●9・●●●・・腫・・■●●・．・曽・o… 鱒騨．o，隔．暉
（B） MG random：
lhlncubation 12 h lncubation
e｛一一t−i−t一一一t−t一一一一t一一一e−t−t一一一一一一一t一一一t−e−et一一ee＃te−e−ttte一一e−tte一一s 一一一一t−ete一一t一一一一一ee一一一一一一t一一ee一一tt一一一一一一一一e一一bdt一一一一tt一一一一一一一一一一一一t−t
1． N，K．xL． 一 K E．
［．一J］一
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Fig．1−5−5． Changes of elution profiles ofunsaturated uronates generated from alginate （A） and MG random （B） by incubation time of the H−4 alginate lyase．
存在下で活性が2．2倍に上昇し、前述のKM値もMg2・存在下で低下したことから、50 mM MgCl、存在下と非存在下での反応生成物の解析を行った。その結果、12時間という十分な 分解条件下でも、分解生成物中のDP 3一一4， DP 5・一6と推定される糖鎖の占める比率がMg・・
無添加時に比べて高くなり、生成する不飽和オリゴ糖の低分子化が顕著になる傾向が認め
られた（Fig．1．5−6）。
考察
H・・4株の培養液から精製した菌体外アルギン酸リアーゼはAlg−Na， polyM， polyGおよび MG randomの各基質に対し明らかな分解性を示した（Fig．1−5−1）。さらに、 IEF後に！Mg−Na，
polyMおよびpolyGを基質とした活性染色法を行った結果、単一の酵素タンパク質がpolyM およびpolyGを分解していることが示唆された（Fig．1−5−2）。そして、本酵素によるAlg−Na，
polyM， polyGおよびMG randomの分解物として、いずれも同様なDPを示す3種の不飽和 ウロン酸が検出され（Fig．1−5−3）、クロマトグラフィー後のこれら不飽和ウロン酸の回収率 はほぼ100％であった（Table 1−5−2）。以上の解析結果は、本酵素がpolyMおよびpolyGの両 基質を分解していることを支持するものであると考えられる。前節のTable 1−4−4に示した
とおり、これまでに基質特異性が報告されているアルギン酸分解酵素はすべてpolyMある いはpolyGのいずれかに対して強い特異性を示している。例えば、本実験でも対照酵素と
して供試したアワビ肝膵臓由来の酵素、およびPhotobacterium sp．， Pseudo〃lonas aeruginosa の産生する酵素は代表的なpolyM特異的リアーゼであり（Romeo＆Preston，1986；Linker＆
Evans，1984）、 Websiella aerogenes由来の酵素はpolyG特異的リアーゼとして最も良く知ら れている（Boyd＆Turvey，1977）。 H−4株の菌体外アルギン酸リアーゼのように、単一の酵素 でpolyMおよびpolyGの両ブロック構造を分解しうる酵素が見いだされた報告例はなく、
本研究で精製したAltero〃zonas sp． H−4株の菌体外酵素は新規な分解様式を示すアルギン酸 リアーゼであると考えている。
なお、preston et al．（1985a）が海藻から分離したAltero〃zonas．sp．（前節Table 1−4−4）やウニ
消化管の主要菌相を形成しているVabrio属細菌（Sawabe et aL，1995 in press）のように、平板培地法で細菌のアルギン酸分解特異性を調べた場合、polyMおよびpolyGいずれにも分解 能を示す細菌が見いだされている。しかし、平板培地法では、基質特異性の異なる複数の 酵素の存在を見分けることができないことから、今後の精製酵素による検討が待たれる。
79
（A）polyM：
12hIncubation 12 h Incubation
一．………＿…．．．…．．．．．．…＿．．．．………．…．……，＿．、 ，．」軸皇照勲㈱￡．乏q．螂．．M＆9・
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（B） polyG：
12 h lncubation
e一一一一tet一一一一一一一一一一e一一一一一一一一e一一et一一一一一e一一一一t一一一 一一一t一一一一s