窺
0 0 0 20 40 60 80 100 120 Fraction No．（5 ml／tube）
Fig．1−3−5． A gelfiltration chromatography of the alginate degrading enzyme on Sephadex G−75
Conditions of the chromatography wcrc as follows；column size：2．64 cm x 94 cm，
flow ratc：19 ml／h．
一●一Alginate degrading enzyme activity 一◎・一Protein
2−4．Toyopearl HW−50Fによる精製
前項2−3で分画されたアルギン酸分解酵素活性野分をToyopearl HW−50Fカラムに負荷し、
分画した際のクロマトグラムをFig．1−3−6に示した。アルギン酸分解酵素活性を示す鋭い 単一ピークが確認され、しかもタンパク質のピークとほぼ一致していた。しかし、前の精 製段階に比べ精製度は1．04倍とほとんど上昇しなかった。回収率は80％と高かった。
2−5．DEAE−Sephadex A−50による再クロマトグラフィー
前項2−4で分画され、タンパク質のピークとほぼ一致したアルギン酸分解酵素活性画分 を再びDEAE−Sephadex A−50で分画した際の、クロマトグラムをFig．1−3−7に示した。こ のイオン交換クロマトグラフィーにおいてもアルギン酸分解酵素活性を示したピークとタ ンパク質のピークとは一致した。精製度は前の精製段階に比べ低下した上、回収率も50％
と低かった。
3．精製アルギン酸分解酵素の純度検定
ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーなどの手法により H−4株の培養上清から精 製したアルギン酸分解酵素をNative一， SDS−PAGEおよびrEFに供試した。その結果、
Native−PAGEでは単一のバンドが認められ、活性染色によりこのタンパク質バンドのみが
アルギン酸分解活性を示すことを確認した（Fig．1−3−8（A））。また、 SDS−PAGEによっても、
単一バンドが確認された（Fig．1−3−8（B））。なお、同時に泳動を行った、分子量マーカーの移
動度と精製アルギン酸分解酵素の移動度の比較により、H−4株の産生するアルギン酸分解
酵素が分子量32kDaであることが推定された（Fig．1−3．g）。
さらに、精製酵素をIEF後に活性染色を行った結果をFig．1−3−10に示した。精製酵素は IEFでも単一のバンドを示し、その等電点は4．7と推定された（Fig．1−3−11）。活性染色法に
より、検出されたタンパク質のみがアルギン酸分解活性を示すことが確認され、他にアル ギン酸分解活性は全く検出されなかった（Fig．1−3−10）。これらの結果はH−4株の菌体外ア ルギン酸分解酵素が電気泳動的に均一に単離精製できたことを示すものであった。
4．精製アルギン酸分解酵素のN一末端アミノ酸配列
精製したH−4株の菌体外アルギン酸分解酵素のN一末端アミノ酸配列を調べた結果を Table 1−3−2に示した。本酵素のN一末端アミノ酸分析で計30アミノ酸残基を決定すること
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Fraction No． （5 ml／tube）
Fig． 1−3−6． A gelfiltration chromatography of the alginate degrading enzyme on Toyopearl HW−50F．
Conditions of the chromatography were as follows； column size： 2．64 cm x 94 cm，
fiow rate： 20 ml／h．
． Alginate degrading enzmc activity 一 Protein
ゆ